一種肝癌靶向的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種肝癌靶向的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料及其制備方法，所述復(fù)合材料為阿霉素DOX和含乳糖酸修飾的氧化石墨烯GO-PEI-FI-PEG-LA的復(fù)合物。制備：氧化石墨烯復(fù)合材料GO-PEI-FI-PEG-LA的合成；配制兩種pH值環(huán)境下的阿霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；將氧化石墨烯復(fù)合材料溶解于水中，加入鹽酸阿霉素水溶液，并調(diào)pH值為中堿性，攪拌4小時(shí)，透析，冷凍干燥，即得；本發(fā)明的新型載藥材料具有pH敏感型釋放及肝癌細(xì)胞靶向的特點(diǎn)，可以用于抗腫瘤研究，有著很好的實(shí)用價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種肝癌靶向的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于肝癌靶向納米材料及其制備領(lǐng)域，特別涉及一種肝癌靶向的氧化石墨 烯載藥復(fù)合材料及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 抗癌藥物的毒副作用和水溶性差一直是腫瘤化學(xué)治療中的瓶頸問(wèn)題，因此使用藥 物輸送系統(tǒng)受到了廣泛的關(guān)注。納米載藥系統(tǒng)憑借其獨(dú)特的尺寸范圍（l-l〇〇nm)不僅可以 降低藥物的生物毒性，有效提高藥物的溶解度和穩(wěn)定性，還可以并且可以通過(guò)對(duì)藥物載體 的修飾、載體藥物的選擇以及負(fù)載方法的設(shè)計(jì)來(lái)控制藥物的緩釋與定向輸送，從而達(dá)到最 佳的治療效果。
[0003] 作為一種新型的二維納米材料，石墨烯擁有獨(dú)特優(yōu)良的電學(xué)，光學(xué)和力學(xué)性質(zhì)，近 年來(lái)，石墨烯衍生物在生物醫(yī)學(xué)，包括生物元件，微生物檢測(cè)，疾病診斷和藥物輸運(yùn)系統(tǒng)等 的應(yīng)用前景，使其成為納米生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。
[0004] 接下來(lái)是石墨烯以及氧化石墨烯用于載藥體系，生物監(jiān)測(cè)，生物成像，腫瘤治療以 及他們的生物安全研究進(jìn)展。聚乙烯亞胺（P〇lyethyleneimine,PEI)是一種攜帶大量氨基 的高分子聚電解質(zhì)材料，分為直鏈型和超支化型兩種，由于氨基的存在，可以連靜電吸附許 多物質(zhì)，也可以化學(xué)鍵合一些反應(yīng)基團(tuán)。
[0005] 鹽酸阿霉素（Doxorubicin, D0X)屬蒽環(huán)類(lèi)抗腫瘤抗生素是一種抑制DNA和RNA合 成的抗腫瘤藥物。其作用機(jī)制主要是嵌入DNA的相鄰堿基對(duì)使DNA發(fā)生錯(cuò)配，從而使DNA 鏈裂解，阻礙DNA和RNA合成。D0X抗瘤譜比較廣，對(duì)RNA的抑制作用最強(qiáng)，并且對(duì)多種腫 瘤均有作用，對(duì)腫瘤細(xì)胞的各種生長(zhǎng)周期都有殺滅作用，屬于周期非特異性藥物。然而，D0X 在大劑量時(shí)會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生較大的殺傷性，因此，為了降低D0X對(duì)人體的正常組織造成 毒副作用，使用藥物載體對(duì)D0X進(jìn)行負(fù)載，控制其釋放是變得十分有必要。
[0006] 檢索國(guó)內(nèi)外有關(guān)D0X靶向運(yùn)輸方面的文獻(xiàn)和專(zhuān)利表明：以多功能化石墨烯為載體 材料，通過(guò)η-η堆積作用負(fù)載阿霉素，達(dá)到靶向、pH敏感釋放的多重功效的研究還比較 少。這種方法能進(jìn)一步拓展D0X在臨床醫(yī)學(xué)的引用范圍。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種肝癌靶向的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料及 其制備方法，該載藥方法操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和，氧化石墨烯復(fù)合載藥材料藥物裝載率 高，且具有pH敏感型釋放及肝癌靶向的特性。
[0008] 本發(fā)明的一種肝癌靶向的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料，所述復(fù)合材料為阿霉素 D0X 和含乳糖酸修飾的氧化石墨烯G0-PEI-FI-PEG-LA的復(fù)合物；其中G0-PEI-FI-PEG-LA、阿霉 素 D0X的質(zhì)量比為1:0. 5-1:2。
[0009] 本發(fā)明的一種肝癌靶向的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料的制備方法，包括：
[0010] 將G0-PEI-FI-PEG-LA溶解在水中，加入阿霉素 D0X的水溶液，混合均勻，調(diào)節(jié)pH 值，攪拌反應(yīng)3-4h，透析除去未連接上的DOX，冷凍干燥，得到肝癌靶向的氧化石墨烯載藥 復(fù)合材料（G0/D0X載藥復(fù)合物）。
[0011] 所述調(diào)節(jié)pH值為用0. 1M的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值為5-10。
[0012] 所述透析為采用透析袋，在pH = 7. 4的緩沖液中透析。
[0013] 所得的肝癌靶向的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料進(jìn)行藥物釋放實(shí)驗(yàn)的方法：
[0014] (1)配制D0X磷酸緩沖溶液及醋酸緩沖溶液，于紫外分光光度計(jì)中檢測(cè)最大吸收 值，并擬合兩種pH環(huán)境下的D0X標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；
[0015] (2)將肝癌靶向的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料溶于磷酸緩沖溶液中，置于兩個(gè)透析 袋中，然后分別將透析袋放入兩種pH值環(huán)境的溶出儀中，于不同時(shí)間點(diǎn)取樣，并補(bǔ)充緩沖 液，得到藥物釋放曲線(xiàn)。
[0016] 所述步驟（1)中磷酸緩沖溶液的pH值為7-7. 5 ;醋酸緩沖溶液的pH值為5-6。
[0017] 所述步驟（1)中所述D0X標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)D0X濃度為0· 005?0· 08mg/ml。
[0018] 所述步驟⑵中磷酸緩沖溶液的pH值為7. 4。
[0019] 所述步驟⑵中兩種pH值環(huán)境分別為：pH值為7-7. 4的磷酸緩沖溶液、pH值為 5-6的醋酸緩沖溶液；體積均為10-15ml。
[0020] 所述步驟（2)中藥物釋放所需的肝癌靶向的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料為0. 5? 2mg〇
[0021] 將肝癌靶向的多氧化石墨烯載藥復(fù)合材料（G0/D0X載藥復(fù)合物）對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行 檢測(cè)，驗(yàn)證其靶向性。
[0022] 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)G0/D0X里D0X的濃度為0· 5?4 μ M。
[0023] 所述含乳糖酸修飾的氧化石墨烯G0-PEI-FI-PEG-LA的制備方法：
[0024] (1)將氧化石墨烯G0分散在溶劑二甲基亞砜中，加入EDC活化2_3h，然后加入聚 乙烯亞胺PEI的二甲基亞砜溶液，在常溫條件下反應(yīng)12-24h，透析，冷凍干燥，得到G0-PEI ; 其中氧化石墨烯與PEI的質(zhì)量比為1:1-1:2 ;G0和EDC的質(zhì)量比為1-3:1 ;
[0025] (2)將乳糖酸LA溶解在磷酸鹽緩沖液（pH值為5-6)中，加入EDC、NHS活化2-3h， 加入NH 2-mPEG_C00H，在常溫條件下，反應(yīng)12-24h，透析，冷凍干燥，得到PEG-LA ;
[0026] (3)將上述G0-PEI溶于水中，加入異硫氰酸熒光素 FITC溶液；
[0027] (4)將上述PEG-LA加入EDC、NHS活化2-3h，然后加入步驟（3)溶液，常溫條件 下，反應(yīng) 12-24h，得到 G0-PEI-FI-PEG-LA ;其中 G0-PEI 與 PEG-LA 的摩爾比為 1:10-1:20 ; PEG-LA、EDC、NHS的摩爾比為1:1:1-1:10:10 ;將上述G0-PEI-FI-PEG-LA中，加入三乙胺混 合30min，然后加入乙酸酐，室溫條件下反應(yīng)12-24h，透析，冷凍干燥，即得含乳糖酸修飾的 氧化石墨烯復(fù)合材料；G0-PEI-FI-PEG-LA中氨基與乙酸酐的摩爾比為1:5-1:10。
[0028] 本發(fā)明中作為一種二維的新型碳納米材料，氧化石墨烯相比一維的碳納米管，表 面含有更多的功能基團(tuán)，由于石墨烯是片層結(jié)構(gòu)，上下兩層都能負(fù)載藥物，其比表面積遠(yuǎn)大 于碳納米管，所以氧化石墨烯的載藥效率能高于相同質(zhì)量的碳納米管載藥體系。
[0029] 有益效果
[0030] (1)本發(fā)明利用氧化石墨烯與阿霉素之間的-----堆積作用，合成含阿霉素的氧 化石墨烯載藥復(fù)合材料，制備方法操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)條件溫和；
[0031] (2)本發(fā)明的含阿霉素的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料藥物裝載量高，能夠長(zhǎng)效緩釋?zhuān)?且具有pH敏感型輸送，在較低pH值環(huán)境下釋放率高，適合腫瘤組織的微環(huán)境，具有應(yīng)用其 做后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)分析的潛力；
[0032] (3)氧化石墨烯載藥復(fù)合材料中的乳糖酸可以實(shí)現(xiàn)其對(duì)肝癌細(xì)胞的主動(dòng)靶向作 用，并能進(jìn)一步研究其體內(nèi)循行和代謝分布。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033] 圖1為實(shí)施例1所得的含阿霉素的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料在不同pH環(huán)境下的 釋放曲線(xiàn)；
[0034] 圖2為實(shí)施例2所得的阿霉素在不同pH環(huán)境下的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；其中a為pH = 7. 4 的PBS緩沖溶液、b為pH = 5. 8的醋酸緩沖液；
[0035] 圖3為實(shí)施例3所得的不同pH條件下的D0X的上樣率和包封率；
[0036] 圖4為實(shí)施例4所得的藥物及載藥復(fù)合物對(duì)SMMC-7721的MTT結(jié)果；
[0037] 圖5為實(shí)施例4所得的載體對(duì)SMMC-7721的MTT結(jié)果；
[0038] 圖6為實(shí)施例5所得的載藥復(fù)合物對(duì)SMMC-7721及PIEC細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測(cè) 結(jié)果；
[0039] 圖7為實(shí)施例6所得的載藥復(fù)合物對(duì)SMMC-7721及PIEC細(xì)胞的激光共聚焦顯微 鏡檢測(cè)結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0040] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定 的范圍。
[0041] 實(shí)施例1
[0042] (1)將5mg氧化石墨烯復(fù)合材料，溶解在5ml水中，在攪拌的情況下，逐滴加入5mL 含D0X(5mg)的水溶液，用0. 1M的氫氧化鈉溶液調(diào)pH = 9. 0,在室溫狀態(tài)下攪拌4h。最后 將含阿霉素的氧化石墨烯溶液放入透析袋（MW = 8, 000?14, 000)中，用透析法將未連接 上的阿霉素除去，用PBS緩沖液透析3次，每次2L。最后將產(chǎn)物冷凍干燥后獲得G0/D0X。
[0043] (2)稱(chēng)取 2mg 阿霉素，分別配制 0· 002Μ、0· 004Μ、0· 008Μ、0· 016Μ、0· 032M 的 PBS 溶 液（pH = 7.4)及醋酸溶液（pH = 5. 8)，對(duì)阿霉素溶液進(jìn)行紫外檢測(cè)，吸收波長(zhǎng)設(shè)為481nm， 收集數(shù)據(jù)并擬合阿霉素在兩種pH條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
[0044] (3)稱(chēng)取2mg載藥復(fù)合物于2ml磷酸緩沖液（pH = 7. 4)中，充分溶解，放入兩個(gè)透 析袋（MW = 8, 000?14, 000)中，并放置在溶出儀，分別補(bǔ)加10ml的PBS溶液（pH = 7. 4) 及醋酸溶液（pH = 5.8)。溶出儀溫度設(shè)為37度，轉(zhuǎn)速90轉(zhuǎn)/分，分別于2h、4h、6h、8h、10h、 24h、48h、96h、120h取出lml透析液，并回補(bǔ)lml相應(yīng)的PBS緩沖溶液和醋酸緩沖溶液。對(duì) 收集的透析液進(jìn)行紫外檢測(cè)，吸收波長(zhǎng)設(shè)為481nm，收集數(shù)據(jù)并并計(jì)算藥物釋放情況。
[0045] (4) D0X在兩種pH環(huán)境下的釋放曲線(xiàn)如圖1所示。在7?后，D0X在pH = 5. 8的 緩釋液中約釋放80%。而在PBS環(huán)境中僅釋放10%，兩者釋放存在顯著差異，腫瘤組織較 正常組織細(xì)胞相比其pH要低，該載藥材料的釋放正好符合這一特性。表明該載藥復(fù)合材料 是一種可以用于腫瘤治療的pH敏感型材料。
[0046] 實(shí)施例2
[0047] (1)將8mg氧化石墨烯復(fù)合材料，溶解在8ml水中，在攪拌的情況下，逐滴加入 13mL含DOX (6mg)的水溶液，用0. 1M的氫氧化鈉溶液調(diào)pH = 9. 0,在室溫狀態(tài)下攪拌4h。最 后將含阿霉素的氧化石墨烯溶液放入透析袋（MW = 8, 000?14, 000)中，用透析法將未連 接上的阿霉素除去，用PBS緩沖液透析3次，每次2L。最后將產(chǎn)物冷凍干燥后獲得G0/D0X。
[0048] (2)稱(chēng)取 3mg 阿霉素，分別配制 0· 0025Μ、0· 005Μ、0· 01Μ、0· 02Μ、0· 04M 的 PBS 溶液 (pH = 7.4)及醋酸溶液（pH = 5.8)，對(duì)阿霉素溶液進(jìn)行紫外檢測(cè)，吸收波長(zhǎng)設(shè)為481nm，收 集數(shù)據(jù)并擬合阿霉素在兩種pH條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
[0049] (3)稱(chēng)取4. 5mg載藥復(fù)合物于4. 5ml磷酸緩沖液（pH = 7. 4)中，充分溶解，放入兩 個(gè)透析袋（MW = 8, 000?14, 000)中，并放置在溶出儀，分別補(bǔ)加15ml的PBS溶液（pH = 7.4) 及醋酸溶液（pH = 5.8)。溶出儀溫度設(shè)為37度，轉(zhuǎn)速90轉(zhuǎn)/分，分別于2h、4h、6h、 8h、10h、24h、48h、96h、120h取出2ml透析液，并回補(bǔ)2ml相應(yīng)的PBS溶液和醋酸溶液。對(duì)收 集的透析液進(jìn)行紫外檢測(cè)，吸收波長(zhǎng)設(shè)為481nm，收集數(shù)據(jù)并計(jì)算藥物釋放情況。
[0050] (4)D0X在兩種pH值環(huán)境下的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖2所示，選擇481nm處的吸光度為縱坐 標(biāo)與橫坐標(biāo)（D0X濃度）制做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。當(dāng)D0X在PBS(pH = 7. 5)(圖2-a)中的濃度范圍在 0. 0025-0. 04mg/mL時(shí)，D0X的濃度-吸光度線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)為R2 = 0. 99983說(shuō)明其有著很好 的線(xiàn)性關(guān)系。當(dāng)D0X在醋酸鹽緩沖液（pH = 5.8)(圖2-b)中的濃度范圍在0.0025-0. 04mg/ mL時(shí)，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)為R2 = 0. 9995,說(shuō)明該pH值下D0X的濃度-吸光度依然有著很好的 線(xiàn)性關(guān)系。
[0051] 實(shí)施例3
[0052] (1)將10mg氧化石墨烯復(fù)合材料，溶解在10ml水中，在攪拌的情況下，逐滴加入 5mL含DOX (10mg)的水溶液，用0. 1M的氫氧化鈉溶液分別調(diào)pH = 5. 5、6. 5、7. 5、8. 5和9. 5， 在室溫狀態(tài)下攪拌4h。最后將不同pH值下含阿霉素的氧化石墨烯溶液放入透析袋（MW = 8, 000?14, 000)中，用透析法將未連接上的阿霉素除去，用PBS緩沖液透析3次，每次2L。 最后將產(chǎn)物冷凍干燥后獲得G0/D0X。
[0053] (2)稱(chēng)取 2mg 阿霉素，分別配制 0· 001Μ、0· 002Μ、0· 004Μ、0· 012Μ、0· 036M 的 PBS 溶 液（pH = 7.4)及醋酸溶液（pH = 5. 8)，對(duì)阿霉素溶液進(jìn)行紫外檢測(cè)，吸收波長(zhǎng)設(shè)為481nm， 收集數(shù)據(jù)并擬合阿霉素在兩種pH條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
[0054] (3)各稱(chēng)取0· 5mg載藥復(fù)合物于1ml磷酸緩沖液（pH = 7. 4)中，充分溶解，放入兩 個(gè)透析袋（MW = 8, 000?14, 000)中，并放置在溶出儀，分別補(bǔ)加10ml的PBS溶液（pH = 7.4) 及醋酸溶液（pH = 5.8)。溶出儀溫度設(shè)為37度，轉(zhuǎn)速90轉(zhuǎn)/分，分別于2h、4h、6h、 8h、10h、24h、48h、96h、120h取出lml透析液，并回補(bǔ)lml相應(yīng)的PBS溶液和醋酸溶液。對(duì)收 集的
[0055] 透析液進(jìn)行紫外檢測(cè)，吸收波長(zhǎng)設(shè)為481nm，收集數(shù)據(jù)并并計(jì)算藥物釋放情況。
[0056] (4)不同pH條件下，D0X的上樣率和包封率如圖3所示。在氧化石墨烯復(fù)合物與 D0X質(zhì)量比為1:1是，上樣率恰等于包封率。pH值環(huán)境越高越有利與藥物的上載，這是由于 去質(zhì)子作用，堿性環(huán)境中阿霉素更容易和氧化石墨烯產(chǎn)生堆積效應(yīng)。
[0057] 實(shí)施例4
[0058] (1)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中種入SMMC-7721細(xì)胞，每孔細(xì)胞密度大約為10, 000個(gè)， 并補(bǔ)足每孔200 μ L的培養(yǎng)液，在5% C02，的條件下于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。
[0059] (2)第二天倒掉舊培養(yǎng)基，加入含有不同濃度的GO-PEI -FI -PEG-LA、D0X和G0/D0X 的20 μ L的PBS溶液，并補(bǔ)足180 μ L新鮮培養(yǎng)基，使每孔總體積仍為200 μ L。孵育24h。
[0060] (3)孵育24h后，每孔加20 μ L的0· 5%的MTT溶液，置37°C恒溫箱中靜止4h，吸 去孔內(nèi)培養(yǎng)液，并添加200 μ L DMS0,置搖床上避光低速振蕩15-20min，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè) 儀570nm處各孔的紫外吸收值。
[0061] (4)載藥復(fù)合物及純藥D0X對(duì)細(xì)胞的MTT分析如圖4所示。D0X濃度在0· 5-4 μ Μ 的情況下均對(duì)SMMC-7721細(xì)胞產(chǎn)生了較大的毒性。進(jìn)一步驗(yàn)證復(fù)合載藥材料對(duì)細(xì)胞的殺傷 作用僅與其中的D0X有關(guān)，同時(shí)對(duì)藥物載體進(jìn)行了 MTT檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示。與載藥復(fù)合 物中G0濃度相同的載體材料均不產(chǎn)生細(xì)胞毒性，也驗(yàn)證了載藥復(fù)合物對(duì)細(xì)胞的殺傷僅與 其中的D0X有關(guān)。
[0062] 實(shí)施例5
[0063] (1)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中種入SMMC-7721細(xì)胞，每孔細(xì)胞密度大約為200, 000個(gè)， 并補(bǔ)足每孔lmL的培養(yǎng)液，在5% C02，的條件下于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。
[0064] (2)第二天倒掉舊培養(yǎng)基，加入含4 μ MD0X的G0/D0X的100 μ L的PBS溶液，并補(bǔ) 足900 μ L新鮮培養(yǎng)基，孵育2h。
[0065] (3)吸去含材料的培養(yǎng)液，并用PBS沖洗三次，胰酶消化，離心收集細(xì)胞，棄上清， 將細(xì)胞懸浮于PBS中。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其中D0X的熒光變化。
[0066] (4)為了對(duì)材料靶向性進(jìn)行檢測(cè)，選取非靶向細(xì)胞PIEC，操作過(guò)程與SMMC-7721相 同。
[0067] (5)載藥材料對(duì)兩種細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析，結(jié)果如圖6所示，含有去唾液酸糖蛋 白受體的SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)過(guò)復(fù)合材料的孵化后，D0X熒光強(qiáng)度提升（p〈0. 05)，而非靶向細(xì) 胞則變化不大，說(shuō)明材料已經(jīng)主動(dòng)識(shí)別SMMC-7721細(xì)胞。
[0068] 實(shí)施例6
[0069] (1)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中放入蓋玻片，并種入SMMC-7721細(xì)胞，每孔細(xì)胞密度大約 為30, 000個(gè)，并補(bǔ)足每孔lmL的培養(yǎng)液，在5% C02，的條件下于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。
[0070] (2)第二天倒掉舊培養(yǎng)基，加入含4 μ MD0X的G0/D0X的100 μ L的PBS溶液，并補(bǔ) 足900 μ L新鮮培養(yǎng)基，孵育2h。
[0071] (3)吸去含材料的培養(yǎng)液，并用PBS沖洗，加 lml2. 5%的戊二醛固定15min。
[0072] (4)吸去戊二醒，并用 PBS 沖洗，加 1ml Hoescht33342 染色 15min。
[0073] (5)吸去Hoescht33342,并用PBS沖洗，將蓋玻片取出，滴一滴熒光封閉劑，置于載 玻片上，進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)。為了對(duì)材料靶向性進(jìn)行檢測(cè)，選取非靶向細(xì)胞PIEC， 操作過(guò)程與SMMC-7721相同。
[0074] (6)載藥復(fù)合物對(duì)SMMC-7721及PIEC細(xì)胞的激光共聚焦顯微鏡結(jié)果如圖7所示。 可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)材料孵化后的SMMC-7721細(xì)胞的FITC熒光強(qiáng)度和D0X熒光強(qiáng)度均比PIEC 細(xì)胞高，說(shuō)明材料對(duì)肝癌細(xì)胞均有一定的靶向性。
【權(quán)利要求】
1. 一種肝癌靶向的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料，其特征在于：所述復(fù)合材料為阿霉素 DOX和含乳糖酸修飾的氧化石墨烯GO-PEI-FI-PEG-LA的復(fù)合物；其中GO-PEI-FI-PEG-LA、 阿霉素 DOX的質(zhì)量比為1:0. 5-1:2。
2. -種如權(quán)利要求1所述的肝癌靶向的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料的制備方法，包括： 將GO-PEI-FI-PEG-LA溶解在水中，加入阿霉素 DOX的水溶液，混合均勻，調(diào)節(jié)pH值，攪 拌反應(yīng)3-4h，透析，冷凍干燥，得到肝癌靶向的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種肝癌靶向的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料的制備方法，其特 征在于：所述調(diào)節(jié)pH值為用0. 1M的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值為5-10。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種肝癌靶向的氧化石墨烯載藥復(fù)合材料的制備方法，其特 征在于：所述透析為采用透析袋，在pH = 7. 4的緩沖液中透析。
【文檔編號(hào)】A61K9/00GK104146946SQ201410333882
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年7月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月14日
【發(fā)明者】朱利民, 陶磊, 楊卉卉, 公曉, 曹欣樂(lè) 申請(qǐng)人:東華大學(xué)