一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的微囊及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的微囊及其制備方法，屬于基因治療領(lǐng)域。本發(fā)明治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的微囊，為包裹轉(zhuǎn)IL-1Ra基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的海藻酸-聚賴氨酸-海藻酸微囊，其直徑在200μm左右。本發(fā)明微囊的選擇通透性膜可以使小分子營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物及生物活性物質(zhì)可以自由出入，使微囊內(nèi)的細(xì)胞能長期存活，并將持續(xù)表達(dá)IL-1Ra蛋白分泌到微囊外，且可以隔離具有殺傷性的抗體，避免機(jī)體對(duì)囊內(nèi)細(xì)胞的免疫反應(yīng)起到免疫隔離作用，提高基因治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的效果。
【專利說明】一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的微囊及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因治療領(lǐng)域，涉及一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的微囊及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoidarthritis, RA)是以對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫性疾病，其病理主要表現(xiàn)為滑膜炎，即滑膜的增生、血管翳的形成以及免疫細(xì)胞浸潤?？蓪?dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨和骨的破壞，關(guān)節(jié)功能障礙，甚至殘廢。其病因及病理機(jī)制比較復(fù)雜，至今尚未完全明確。研究表明，IL-1在RA的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，是導(dǎo)致炎性反應(yīng)的持續(xù)發(fā)生和軟骨破壞的重要促炎性細(xì)胞因子。
[0003]IL-1Ra最早在上世紀(jì)80年代被發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)自然存在的IL-1Ra是具有22_26kDa的糖蛋白，其可以牢固的結(jié)合I型IL-1受體，使IL-1完全喪失對(duì)其受體的激活功能而自己本身并不激活細(xì)胞。正常狀態(tài)下IL-1與IL-1受體結(jié)合而引起的生理效應(yīng)很大程度上受到IL-1Ra與IL-1受體結(jié)合狀態(tài)的調(diào)控。在發(fā)生關(guān)節(jié)炎動(dòng)物的滑膜組織內(nèi)雖然可以產(chǎn)生IL-1Ra，但是由于其數(shù)量有限，不能完全抵消IL-1的作用，因此單純依靠體內(nèi)天然產(chǎn)生的IL-1Ra不足以抑制疾病的發(fā)展。在膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠模型的研究也發(fā)現(xiàn)隨著疾病的發(fā)展滑膜中IL-1/IL-lRa比例也會(huì)持續(xù)升高，而且其與關(guān)節(jié)炎指數(shù)的升高呈正相關(guān)。IL-1Ra基因敲除小鼠會(huì)發(fā)生嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎也進(jìn)一步表明了 IL-1/IL-lRa平衡在維持體內(nèi)關(guān)節(jié)正常生理過程及免疫系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中的重要意義?；隗w內(nèi)IL-1/IL-lRa的動(dòng)態(tài)平衡，通過導(dǎo)入外源性IL-1Ra恢復(fù)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病中遭到破壞的相互制約關(guān)系已經(jīng)成為該病治療中的重要指導(dǎo)思想之一。
[0004]目前應(yīng)用IL-1Ra治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎在動(dòng)物模型和病人體內(nèi)都取得了很好的療效。有文獻(xiàn)研究表明，在免疫復(fù)合物誘導(dǎo)小鼠關(guān)節(jié)炎模型和兔抗原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型中應(yīng)用IL-1Ra可以明顯抑制炎癥的發(fā)展，減輕骨和軟骨的破壞。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)過度表達(dá)IL-1Ra的轉(zhuǎn)基因鼠很少發(fā)生膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎。對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者靜脈注射IL-1Ra不但可以抑制白細(xì)胞向滑膜部位浸潤及關(guān)節(jié)軟骨蛋白多糖合成減少而且還可以降低破骨細(xì)胞活化及金屬基質(zhì)蛋白酶的釋放，從而對(duì)骨和軟骨起到保護(hù)作用。
[0005]已經(jīng)有對(duì)應(yīng)IL-1Ra的商品藥物應(yīng)用臨床，anakerin是最重要的制劑之一。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，anakerin可以抑制膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠對(duì)II型膠原的抗體反應(yīng)，保護(hù)骨和關(guān)節(jié)免受進(jìn)一步破壞。長期多中心臨床應(yīng)用療效評(píng)估結(jié)果表明，應(yīng)用皮下注射anakerin可以明顯延緩類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者受累關(guān)節(jié)的破壞速度和程度，減輕疼痛，相應(yīng)的VAS評(píng)分指數(shù)明顯降低。但是由于皮下注射藥物伴有較多的副作用，主要是皮注射部位反應(yīng)，以至于有一部分患者放棄這一療法，通過其他途徑應(yīng)用IL-1Ra治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的研究也在進(jìn)行當(dāng)中。
[0006]隨著基因重組技術(shù)的迅速發(fā)展，人們開始嘗試基因治療，即利用重組細(xì)胞的代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能，治療相關(guān)疾病。目前導(dǎo)入基因治療疾病的技術(shù)也日漸成熟，已經(jīng)可以通過各種轉(zhuǎn)染方式將編碼IL-1Ra基因的質(zhì)?；蛳俨《緦?dǎo)入到類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型體內(nèi)使IL-1Ra蛋白持續(xù)表達(dá)并取得了較好的療效，其中以病毒載體效率最高。但是由于病毒為載體的基因治療應(yīng)用可以激發(fā)機(jī)體的針對(duì)病毒載體的免疫反應(yīng)。因此如何減少病毒載體的免疫反應(yīng)成為基因治療的一個(gè)研究熱點(diǎn)。
[0007]抗IL-1藥物在臨床上治療RA有明顯的效果，然而這種治療不良反應(yīng)大，較昂貴需反復(fù)注射，因此受到了限制?；蛑委煂⒕哂兄委熥饔玫幕蛑亟M到真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)移至人體細(xì)胞，表達(dá)出具有治療作用的多肽或蛋白質(zhì)，從而達(dá)到治療目的。IL-1Ra可減輕和阻斷RA的進(jìn)展。移植攜帶IL-1Ra基因的細(xì)胞可抑制疾病進(jìn)展。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植可誘發(fā)免疫反應(yīng)且不利細(xì)胞生存。
[0008]80年代以后，微囊化技術(shù)開始和組織細(xì)胞移植相結(jié)合，廣泛應(yīng)用于一些神經(jīng)內(nèi)分泌疾病治療的研究，最典型的是1980年加拿大多倫多大學(xué)的Sun和Lim發(fā)明了海藻酸-聚賴氨酸-海藻酸(APA)微膠囊，把豬的胰島細(xì)胞微囊化，形成人工細(xì)胞植入糖尿病大鼠體內(nèi)，結(jié)果表明該人工細(xì)胞成功地降低了血糖水平[17]。之后細(xì)胞微囊化技術(shù)在骨科得到廣泛應(yīng)用。Isobe等人將重組人骨形成蛋白(rhBMP)包裹于乳酸-乙醇酸微囊內(nèi)并植到大鼠皮下，組織檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著骨形成蛋白的釋放，在微囊周圍出現(xiàn)具有堿性磷酸酶活性的骨誘導(dǎo)細(xì)胞，并且在異位骨誘導(dǎo)形成過程中轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞。早在上世紀(jì)80年代，KatoT等用乙基纖維素包裹絲裂霉素C做成微囊，經(jīng)DSA放在骨腫瘤滋養(yǎng)血管處，起到對(duì)腫瘤的持續(xù)化療作用。HuangYY等將慶大霉素做成微囊，對(duì)術(shù)后骨髓炎起到預(yù)防作用。其它生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也得到比較廣泛的應(yīng)用，如肝細(xì)胞微囊化為急性肝衰竭提供暫時(shí)性代謝支持，腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞微囊化治療帕金森氏病，甲狀旁腺細(xì)胞微囊化治療甲狀腺機(jī)能低下等。在骨科領(lǐng)域中也有通過微膠囊包裹生長因子或藥物治療骨或軟骨的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的微囊及其制備方法。
[0010]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0011]一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的微囊，為包裹轉(zhuǎn)IL-1Ra基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的海藻酸-聚賴氨酸-海藻酸微囊。
[0012]所述的微囊的直徑在200 μ m左右。
[0013]所述的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞優(yōu)選來源于大鼠。
[0014]所述的轉(zhuǎn)IL-1Ra基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞優(yōu)選為將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLXRN-1L-1Ra轉(zhuǎn)染到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞得到。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLXRN-1L-1Ra的構(gòu)建見參考文獻(xiàn)“人IL-1受體拮抗蛋白重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建、鑒定及在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的表達(dá)”(芮云峰，王友，張曉玲等，《中國修復(fù)重建外科雜志》2008年第5期)。
[0015]上述治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的微囊的制備方法，包括如下步驟:
[0016](I)利用PT67細(xì)胞株包裝重組PLXRN-1L-1Ra逆轉(zhuǎn)錄病毒。
[0017](2)從大鼠骨髓分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0018](3)重組PLXRN-1L-1Ra逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0019](4)利用高壓靜電法制作包裹PLXRN-1L-1Ra逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊。
[0020]優(yōu)選的，步驟⑷為:
[0021]I)將轉(zhuǎn)染PLXRN-1L-1Ra逆轉(zhuǎn)錄病毒的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與海藻酸鈉混合制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞終濃度為3 X106/mL，海藻酸鈉濃度終為1.75%的溶液；溶劑為0.9% NaCl。
[0022]2)于電壓為3kV，液面距25mm，推進(jìn)速度30mm/h的高壓靜電場(chǎng)成囊裝置中，將該混合液滴入100mmol/L CaCl2溶液中并反應(yīng)lOmin，用0.9% NaCl洗滌兩次。
[0023](3)再與0.05%聚賴氨酸溶液反應(yīng)使微粒外包裹一層聚賴氨酸并反應(yīng)5min，
0.9% NaCl洗滌兩次。
[0024](4)加入0.15%海藻酸鈉溶液中和微粒表面電荷，0.9% NaCl洗滌兩次。
[0025](5)最后用55mmol/L檸檬酸鈉溶液置換出微粒核心中的鈣離子得到微囊，0.9%NaCl洗滌兩次。
[0026]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果:
[0027]本發(fā)明制備的包裹PLXRN-1L-1Ra逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊形態(tài)大小基本一致，直徑基本在200 μ m左右，其選擇通透性膜可以使小分子營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物及生物活性物質(zhì)可以自由出入，使微囊內(nèi)的細(xì)胞能長期存活，并將持續(xù)表達(dá)IL-1Ra蛋白分泌到微囊外，且可以隔離具有殺傷性的抗體，避免機(jī)體對(duì)囊內(nèi)細(xì)胞的免疫反應(yīng)起到免疫隔離作用，提高基因治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1是大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞40倍顯微鏡下視野圖。
[0029]圖2是PLXRN-1L-1Ra逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后在熒光顯微鏡下視野圖(100X)。
[0030]圖3是本發(fā)明包裹PLXRN-1L-1Ra逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉微囊的形態(tài)圖。
[0031]圖4是本發(fā)明微囊培養(yǎng)I周和4周在熒光顯微鏡下的生長情況圖，A:1周，B:4周。
[0032]圖5是本發(fā)明微囊培養(yǎng)過程中IL-1Ra的分泌情況圖，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間(天)，縱坐標(biāo)為IL-1Ra分泌量(ng)。

【具體實(shí)施方式】
[0033]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0034]實(shí)施例1重組PLXRN-1L-1Ra逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝
[0035](I)細(xì)胞PT67通過G418篩選
[0036]G418藥物敏感性實(shí)驗(yàn):待轉(zhuǎn)染PT67細(xì)胞常規(guī)傳代培養(yǎng)。在24孔板中每孔接種I X 14個(gè)細(xì)胞，等細(xì)胞貼壁后加入G418，使其終濃度分別為0、50、100、200、300、400、500、800mg/L。每個(gè)濃度做三個(gè)平行孔。每三天換一次液，每2天檢查一次培養(yǎng)皿中細(xì)胞活性。約5天左右開始出現(xiàn)大量細(xì)胞死亡，14天細(xì)胞全部死亡的最低濃度為最佳篩選濃度400mg/L0
[0037](2)病毒包裝
[0038]根據(jù)LipofectAMINE2000轉(zhuǎn)染試劑說明書:六孔板每孔IX 16個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合度90-95%。轉(zhuǎn)染前兩小時(shí)換液。將4yg的質(zhì)粒DNA加至250 μ L無血清培養(yǎng)液中，混均。將10 μ L的LipofectAMINE2000加至另外250 μ L無血清培養(yǎng)液中，輕輕混均，室溫靜置5分鐘。將DNA懸液和LipofectAMINE2000懸液混合輕輕混均，室溫靜置20分鐘。分別將合適量的空逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLXRN、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLXRN-1L-1Ra轉(zhuǎn)染試劑加入6孔板中，混均，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4-6小時(shí)后更換含有血清的培養(yǎng)液；48小時(shí)突光顯微鏡下可見包裝成功的細(xì)胞，后加入G418至終濃度為200mg/L，培養(yǎng)4周后陽性克隆形成。
[0039]逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLXRN-1L-1Ra的構(gòu)建見參考文獻(xiàn)“人IL-1受體拮抗蛋白重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建、鑒定及在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的表達(dá)”(芮云峰，王友，張曉玲等，《中國修復(fù)重建外科雜志》2008年第5期)。
[0040](3)選擇穩(wěn)定的產(chǎn)病毒細(xì)胞株、收集病毒
[0041]I)在所獲的克隆中隨機(jī)挑選3-4個(gè)大而健康的克隆，移至單獨(dú)的培養(yǎng)皿進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)(用含10%血清的DMEM+G418200mg/L培養(yǎng)基)，常規(guī)培養(yǎng)，傳代直至細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到實(shí)驗(yàn)需要的培養(yǎng)體積。
[0042]2)保留一皿行連續(xù)培養(yǎng)。
[0043]3)平鋪培養(yǎng)于需要數(shù)目的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度在60-80%即可。具體做法為:以I X 16/瓶接種于250mL的玻璃培養(yǎng)瓶中，各用8mL含血清含G418的DMEM培養(yǎng)液于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)24小時(shí)。
[0044]4)更換新培養(yǎng)液(含F(xiàn)BS、青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液)，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集培養(yǎng)基上清液，病毒上清每隔24h收獲一次，直到細(xì)胞沒有活力為止。
[0045]5)用0.22 μ m微孔濾器除去細(xì)胞和雜質(zhì)，該培養(yǎng)液中就含有復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒和被分泌于培養(yǎng)液中的目的基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
[0046](3)病毒的濃縮和保存
[0047]I)收集好病毒上清，500 XglOmin短暫離心樣品去除細(xì)胞碎片。
[0048]2)4°C下高速離心機(jī)50000 Xg離心90min，使病毒片狀沉淀，去除上清液。
[0049]3)0.5-1 %的原始體積TNE重懸病毒，4°C過夜孵育。
[0050]4)等分清潔的上清液，裝入單個(gè)一次性的試管，避免反復(fù)凍融。
[0051]5) _80°C保存試管，不需要冷凍保護(hù)劑。
[0052]實(shí)施例2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及微囊化包裹
[0053](I)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的體外分尚與培養(yǎng)
[0054]取體重300g左右雄性SD大鼠(由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，氯胺酮腹腔麻醉^Omg/kg)。在嚴(yán)格的無菌條件下分離出雙側(cè)股骨，用咬骨鉗截除其遠(yuǎn)近端。用1mL a MEM完全培養(yǎng)基沖洗出骨髓組織，接種于10mm培養(yǎng)皿，每皿10mL，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱孵育。
[0055]初接種的細(xì)胞種類較多，倒置顯微鏡下可見滿視野圓形且折光性較強(qiáng)的細(xì)胞，其中多數(shù)為紅細(xì)胞不貼壁，3d后半量換液后，由于紅細(xì)胞減少，可見少量的貼壁細(xì)胞，呈棒狀或紡錘狀。7d后全量換液,瓶內(nèi)見多個(gè)細(xì)胞克隆形成,細(xì)胞多伸展為長梭形。1d后，克隆增大與其他克隆逐漸融合。隨著換液次數(shù)的增加懸浮不貼壁的細(xì)胞逐漸被清除，少數(shù)夾雜生長。以后3d換一次培養(yǎng)液。到第14天，貼壁細(xì)胞幾乎80%匯合，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外形如梭(圖1)。
[0056](2)傳代培養(yǎng)
[0057]I)胰酶消化:a.小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBS清洗(沖洗)2次，加入適量胰酶消化液，注意消化液的量以蓋住細(xì)胞最好，最佳消化溫度是37°C。b.倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，消化到細(xì)胞之間不再連接成片。c.加入1mLPBS洗掉胰酶消化液，加入新鮮的培養(yǎng)液。
[0058]2)吹打分散細(xì)胞:a.用滴管將已經(jīng)消化的細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。b.將細(xì)胞懸液吸入1mL離心管中。c.平衡后將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中，以1200rpm離心4min。d.棄去上清液，加入2mL培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。
[0059]3)分裝稀釋細(xì)胞:a.將細(xì)胞懸液吸出分裝至2-3個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。b.倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量，必要時(shí)計(jì)數(shù)，最后做好標(biāo)記。
[0060]4)繼續(xù)培養(yǎng):用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)胞2小時(shí)后開始貼附在瓶壁上。
[0061]傳代細(xì)胞培養(yǎng)注意嚴(yán)格的無菌操作及適度消化，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散或有成片浮起的跡象，立即終止消化。
[0062](3) PLXRN-1L-1Ra逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
[0063]75cm的培養(yǎng)瓶細(xì)胞貼壁生長面積為70%時(shí)進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)為宜:
[0064]I)感染前6小時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液處理，每瓶細(xì)胞使用6mL無血清培養(yǎng)基，換液后正常條件培養(yǎng)6小時(shí)；
[0065]2)每瓶添加實(shí)施例1得到的病毒液500 μ L，輕晃培養(yǎng)瓶，使之分布均勻，正常條件培養(yǎng)12小時(shí)；
[0066]3)每瓶補(bǔ)加8mL的含10% FBS的完全培養(yǎng)基，輕晃培養(yǎng)瓶，使之分布均勻，正常條件培養(yǎng)12小時(shí)；
[0067]4)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液處理，使用15mL含10 % FBS的完全培養(yǎng)基，正常條件培養(yǎng)24小時(shí)；
[0068]5)熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞48小時(shí)后可見有熒光蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率在80%左右(圖2)。
[0069](4)轉(zhuǎn)染PLXRN-1L-1Ra逆轉(zhuǎn)錄病毒的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞微囊化包裹
[0070]參照文獻(xiàn)中方法制備(丁惠鋒，湯亭亭，劉榮等.包裹骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因轉(zhuǎn)染干細(xì)胞的微囊化方法和蛋白釋放效應(yīng)[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志.2007，24(1):69-71.)包裹骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的海藻酸-聚賴氨酸-海藻酸(APA)微囊。主要步驟如下:
[0071](I)將轉(zhuǎn)染PLXRN-1L-1Ra逆轉(zhuǎn)錄病毒的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液與一定濃度的海藻酸鈉溶液混合制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞終濃度為3X106/mL，海藻酸鈉濃度終為1.75%的溶液。
[0072](2)于電壓為3kV，液面距25mm，推進(jìn)速度30mm/h的高壓靜電場(chǎng)成囊裝置(上海理工大學(xué)研制)中，將該混合液滴入lOOmmol/L CaCl2溶液中并反應(yīng)1min并用0.9% NaCl洗滌兩次。
[0073](3)再與0.05%聚賴氨酸溶液反應(yīng)使微粒外包裹一層聚賴氨酸并反應(yīng)5min后
0.9% NaCl洗滌兩次。
[0074](4)加入0.15%海藻酸鈉溶液中和微粒表面電荷，0.9% NaCl洗滌兩次。
[0075](5)最后用55mmol/L檸檬酸鈉溶液置換出微粒核心中的鈣離子得到微囊，0.9%NaCl洗滌兩次；
[0076](6)所得微囊置無菌培養(yǎng)皿中，加入DMEM培養(yǎng)液10mL，于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待用。
[0077]注意事項(xiàng):⑴細(xì)胞懸液用0.9% NaCl洗滌兩次；⑵細(xì)胞終濃度為3 X 106/mL，海藻酸鈉濃度終為1.75%的溶液；(3)微囊制備中每步的反應(yīng)時(shí)間為5-10min左右；(4)每步反應(yīng)后用0.9% NaCl洗滌兩次。
[0078]利用高壓靜電裝置制造的海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉微囊形態(tài)大小基本一致，直徑基本在200 μ m左右(圖3)。微囊長時(shí)間培養(yǎng)后，其包裹的細(xì)胞成活率仍很高，圖4是微囊培養(yǎng)I周和4周在熒光顯微鏡下的生長情況。
[0079]實(shí)施例3包裹IL-1Ra轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊體外蛋白釋放
[0080]取實(shí)施例2得到的包裹IL-1Ra轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊(微囊內(nèi)細(xì)胞總量約2.5X106/組)，于15mLaMEM(含15%小牛血清)中培養(yǎng)。每隔2天換培養(yǎng)液，換液時(shí)取上清，留作ELISA法測(cè)IL-1Ra的含量。
[0081]實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照IL-1RaImmunoassay試劑盒(R&D公司)的操作程序進(jìn)行:首先將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行溶解并倍比稀釋；在已用抗IL-1Ra單抗包被的微孔板內(nèi)加RDl?19檢測(cè)稀釋液100 μ L，再分別加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品各50 μ L，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品、樣品設(shè)兩個(gè)重復(fù)孔；用不含標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的測(cè)定稀釋液RDl?19作為零對(duì)照。室溫下靜置2h，洗滌3次。然后，力口200 μ L的酶標(biāo)抗體(偶聯(lián)辣根過氧化物酶的抗IL-1Ra單克隆抗體)，室溫下靜置2h，洗滌
3次。再加200 μ L的底物溶液(過氧化氫和四甲基聯(lián)苯胺)，室溫下避光靜置30min后加Λ 50 μ L終止液停止反應(yīng)，30min內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)光密度OD值(測(cè)定波長450nm)，求出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品含量。試劑盒的最低檢測(cè)質(zhì)量濃度約為31pg/mL。
[0082]IL-1Ra分泌情況如圖5所示，表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染IL-1Ra基因并微囊化后可以持續(xù)表達(dá)IL-1Ra蛋白，這說明本發(fā)明制備的微囊即能使細(xì)胞在囊內(nèi)長期存活，同時(shí)也保障蛋白的釋放。
[0083]實(shí)施例4包裹IL-1Ra轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊的免疫隔離作用
[0084]在96孔板內(nèi)加入100 μ L實(shí)施例2得到的包裹IL-1Ra轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊，再加入100 μ L0.05% (w/v)紅色熒光IgG，輕輕搖晃后放入培養(yǎng)箱中，靜止I小時(shí)，再在激光共聚焦顯微鏡下觀察微囊的通透性。觀察發(fā)現(xiàn)微囊呈現(xiàn)黑色，微囊外面為紅色的熒光，即紅色熒光IgG不能進(jìn)入微囊內(nèi)。說明本發(fā)明微囊能有效的避免抗體對(duì)囊內(nèi)細(xì)胞的攻擊。
[0085]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的微囊，其特征在于:為包裹轉(zhuǎn)IL-1Ra基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的海藻酸-聚賴氨酸-海藻酸微囊。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的微囊，其特征在于:直徑為200μ m。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的微囊，其特征在于:所述的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源于大鼠。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的微囊，其特征在于:所述的轉(zhuǎn)IL-1Ra基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLXRN-1L-1Ra轉(zhuǎn)染到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞得到。
5.權(quán)利要求1所述的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的微囊的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (1)利用PT67細(xì)胞株包裝重組PLXRN-1L-1Ra逆轉(zhuǎn)錄病毒； (2)從大鼠骨髓分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞； (3)重組PLXRN-1L-1Ra逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； (4)利用高壓靜電法制作包裹PLXRN-1L-1Ra逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的微囊的制備方法，其特征在于步驟(4)為: 1)將轉(zhuǎn)染PLXRN-1L-1Ra逆轉(zhuǎn)錄病毒的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與海藻酸鈉混合制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞終濃度為3X 106/mL，海藻酸鈉濃度終為1.75%的溶液；溶劑為0.9% NaCl ； 2)于電壓為3kV，液面距25mm，推進(jìn)速度30mm/h的高壓靜電場(chǎng)成囊裝置中，將該混合液滴入100mmol/L CaCl2溶液中并反應(yīng)lOmin，用0.9% NaCl洗滌兩次； (3)再與0.05%聚賴氨酸溶液反應(yīng)使微粒外包裹一層聚賴氨酸并反應(yīng)5min，0.9%NaCl洗滌兩次； (4)加入0.15%海藻酸鈉溶液中和微粒表面電荷，0.9% NaCl洗滌兩次； (5)最后用55mmol/L檸檬酸鈉溶液置換出微粒核心中的鈣離子得到微囊，0.9% NaCl洗滌兩次。
【文檔編號(hào)】A61P29/00GK104127884SQ201410334116
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年7月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月14日
【發(fā)明者】張超, 岳倩宇, 劉偉, 楊召, 趙毅, 姚紹平, 胡建華, 李宏鍵 申請(qǐng)人:云南省第一人民醫(yī)院