一種誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的中藥提取物及其制備工藝和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的中藥提取物及其制備工藝和應(yīng)用，屬于中藥材提取【技術(shù)領(lǐng)域】，所述的中藥提取物為毛葉白粉藤水提物。本發(fā)明所述中藥提取物按如下方法制備而成：將毛葉白粉藤原料置于提取容器中，先后用濃度為90%-95%（v/v）乙醇、70%-75%（v/v）乙醇各回流提取1-3次，棄掉醇提液，所得藥渣加水煎煮1-4次，過濾得水提液，濃縮成稠膏，干燥，粉碎，得毛葉白粉藤水提物。本發(fā)明涉及的中藥提取物由單一的中草藥制備而成，其不僅可以抑制腫瘤細胞增殖，而且可以誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥材提取【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的中藥提取物及其 制備工藝和應(yīng)用。 一種誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的中藥提取物及其制備工藝和應(yīng)用

【背景技術(shù)】
[0002] 目前，對于癌癥的治療盡管結(jié)合了外科手術(shù)，化學(xué)療法，及放射性療法，但是其治 愈率還是很低的?；瘜W(xué)療法的低成功率原因在于當(dāng)前的化學(xué)療法是以迅速分化的腫瘤細胞 為靶子的。這種方法對潛伏的或者生長緩慢的腫瘤細胞是低效率的。這種療法還影響迅速 分化的正常細胞，引起有害的副作用。
[0003] 近些年出現(xiàn)了一種治療癌癥的新方法，該方法以最近剛被發(fā)現(xiàn)的生物學(xué)現(xiàn)象"細 胞凋亡"為基礎(chǔ)，細胞凋亡又被稱為"細胞的程序化死亡"或者"細胞自殺"（Tomei等人， "細胞凋亡"：細胞死亡的分子基礎(chǔ)。冷泉港實驗室出版社，1991)。與細胞損傷導(dǎo)致的細胞 死亡相比，細胞凋亡是基因介導(dǎo)的細胞主動自毀過程并且為生物學(xué)上有意義的功能服務(wù)。 最近有這樣一種觀點認為，癌癥是由不充分的細胞凋亡引起的（Cope，F(xiàn).O and Wille，J. j, "Apoptosis" ：The molecular Basis of CellDeath，冷泉港實驗室出版社，pp61, 1991)。 這種觀點為癌癥治療開創(chuàng)了一種新的思路--腫瘤細胞可以通過激勵細胞凋亡被殺死。以 正常發(fā)展中的諸過程為基礎(chǔ)，細胞凋亡的調(diào)諧作用是一種控制腫瘤細胞增殖的潛在機制。 恢復(fù)腫瘤細胞中的細胞凋亡機制是一種值得嘗試的方法，因為至少在理論上它將導(dǎo)致細胞 自殺死亡。
[0004] 中藥材毛葉白粉藤為葡萄科植物毛葉白粉藤的藤莖。目前，該藥材被用于跌打損 傷、扭傷。風(fēng)濕關(guān)節(jié)疼痛、骨折、癰瘡腫毒。等疾病，尚無文獻報道毛葉白粉藤或其提取物具 有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的功效。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 基于細胞的程序化死亡的研究，本發(fā)明的目的在于提供一種誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的 中藥提取物及其制備工藝和應(yīng)用。
[0006] 為了實現(xiàn)本能發(fā)明的目的，發(fā)明人通過大量試驗研究并不懈探索，最終獲得了如 下技術(shù)方案： 一種誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的中藥提取物，所述的中藥提取物為毛葉白粉藤水提物。
[0007] 本發(fā)明所述中藥提取物的制備工藝，該工藝包括如下步驟：將毛葉白粉藤原料置 于提取容器中，先后用濃度為90%-95% (v/v)乙醇、70%-75% (v/v)乙醇各回流提取1-3次， 棄掉醇提液，所得藥渣加水煎煮1-4次，過濾得水提液，濃縮成稠膏，干燥，粉碎，得毛葉白 粉藤水提物。
[0008] 在上述誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的中藥提取物的制備工藝中，優(yōu)選每次乙醇回流提取的 時間為l_3h ;優(yōu)選每次藥渣加水煎煮的時間為l_2h。
[0009] 本發(fā)明所述誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的中藥提取物，其中每次乙醇回流提取的時間為 3-5h ;每次藥渣加水煎煮的時間為1-2. 5h。
[0010] 細胞增殖過度和細胞凋亡異常是腫瘤發(fā)生的生物學(xué)基礎(chǔ)。因此，如何誘導(dǎo)細胞進 入凋亡是腫瘤治療取得成功的關(guān)鍵。本發(fā)明人通過實驗研究表明，毛葉白粉藤水提物不僅 可以抑制人喉癌ifep2細胞增殖，而且可以誘導(dǎo)該細胞進入凋亡。因此，本發(fā)明的另一個目 的在于提供一種制藥用途，即：上述的毛葉白粉藤水提物在制備抑制腫瘤細胞增殖的藥物 中的應(yīng)用；或者，上述的毛葉白粉藤水提物在制備誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。進一 步優(yōu)選地：上述的毛葉白粉藤水提物在制備抑制人喉癌ifep2細胞增殖的藥物中的應(yīng)用；或 者，上述的毛葉白粉藤水提物在制備誘導(dǎo)人喉癌ifep2細胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。
[0011] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明涉及的中藥提取物由單一的中草藥制備而成，其不僅可 以抑制腫瘤細胞增殖，而且可以誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。另外，該提取物來源于天然植物，因此 毒副作用低，屬于"綠色治療藥物"的范疇，可望被開發(fā)成抗腫瘤的一線用藥。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1不同濃度毛葉白粉藤水提物對Ifep2細胞增殖的抑制率曲線圖。

【具體實施方式】
[0013] 以下是本發(fā)明毛葉白粉藤水提物干粉的制備實施例和效果試驗例，對本發(fā)明做進 一步說明。但是，本發(fā)明的保護范圍并不受限于以下實施例，凡是基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實 現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0014] 實施例1毛葉白粉藤水提物干粉的制備 毛葉白粉藤干品lkg，粉碎，置回流提取裝置中，先后用濃度為95% (v/v)乙醇12L、70% (v/v)乙醇10L各回流提取2次，每次2h，棄掉醇提液，所得藥渣加水15L，煎煮2次，每次 2h，合并兩次水提液，濾過，濃縮成稠膏，冷凍干燥，粉碎成細粉，過100目篩，得毛葉白粉藤 水提物干粉。
[0015] 實施例2毛葉白粉藤水提物抑制腫瘤細胞生長的試驗研究 取實施例1制備的毛葉白粉藤水提物干粉，分別將其干粉溶于含10%胎牛血清的1640 完全培養(yǎng)液，使水提物濃度分別為150、200、250、300、400、500、600μ g/mL備用。人喉癌 Η印2細胞株，用含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)液于37°C恒溫、5% C02、95%飽和濕度條 件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的ifep2細胞，以每孔1 X 104個接種于96孔板，每孔200 μ L。過夜 培養(yǎng)后棄上清，將配置好的不同濃度（150、200、250、300、400、500、600μ g/mL)的毛葉白粉 藤水提物溶液分別加入培養(yǎng)板，并設(shè)置空白對照組（只加含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng) 液），每孔20(^1^，分別培養(yǎng)24、48、72 11。結(jié)束前411每孔加入511^/1111^1'1'溶液2(^匕培 養(yǎng)結(jié)束后棄上清，每孔加二甲基亞砜（DMSOWOOyL，避光輕微振蕩lOmin。于酶標(biāo)儀490nm 波長處測定各孔的吸光度A，并按下式計算抑制率：抑制率) = [1-(A實驗組/ A陰性對 照）]X 100%，實驗重復(fù)3次。試驗結(jié)果參見圖1。
[0016] 根據(jù)圖 1 可以看出，MTT 結(jié)果顯示 150、200、250、300、400、500、600μ g / mL 的毛 葉白粉藤水提物在不同程度上均能抑制ifep2細胞的增殖，其抑制作用隨濃度增加、時間的 延長而加強，呈劑量和時間依賴性。
[0017] 實施例3毛葉白粉藤水提物誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的試驗研究 人喉癌Η印2細胞株，用含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)液于37°C恒溫、5% C02、95% 飽和濕度條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的ifep2細胞，以2X 105 /孔接種于鋪有蓋玻片的6孔 板中，用不同濃度（150、250、300μ g/mL)的毛葉白粉藤水提物(實施例1制備)及0. 5μ g/mL 阿霉素分別處理48h，并設(shè)置陰性對照組。培養(yǎng)結(jié)束后棄上清，細胞爬片用PBS洗滌三次，于 10 μ g/mL的Hoechst 33258染色液中避光孵育10 min，取出細胞爬片用PBS洗滌3次，于熒 光顯微鏡下觀察。
[0018] Hoechst 33258熒光染色后，未經(jīng)藥物處理的陰性對照組細胞呈彌漫性均勻熒光， 且熒光較弱。在各用藥組中，ifep2細胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生明顯改變，核固縮呈致密的顆粒狀 強熒光，尤其是毛葉白粉藤水提物高劑量組出現(xiàn)凋亡的典型形態(tài)學(xué)變化，可見清晰的凋亡 小體。
【權(quán)利要求】
1. 一種誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的中藥提取物，其特征在于：所述的中藥提取物為毛葉白粉 藤水提物。
2. -種制備如權(quán)利要求1所述誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的中藥提取物的工藝，其特征在于 所述工藝包括以下步驟：將毛葉白粉藤原料置于提取容器中，先后用濃度為90%-95%v/v乙 醇、70%-75%v/v乙醇各回流提取1-3次，棄掉醇提液，所得藥渣加水煎煮1-4次，過濾得水提 液，濃縮成稠膏，干燥，粉碎，得毛葉白粉藤水提物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述制備誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的中藥提取物的工藝，其特征在于：每 次乙醇回流提取的時間為l-3h。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述制備誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的中藥提取物的工藝，其特征在于：每 次藥渣加水煎煮的時間為l_2h。
5. 權(quán)利要求1所述的毛葉白粉藤水提物在制備抑制腫瘤細胞增殖的藥物中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求1所述的毛葉白粉藤水提物在制備誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P35/00GK104055948SQ201410336819
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月16日
【發(fā)明者】董燕子 申請人:崔新明