慢性腎臟病的動物模型的建立的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及阿霉素與腺嘌呤聯(lián)合使用在制備用于篩選治療慢性腎臟病的動物模型中的用途，其中阿霉素的施用劑量為2.5-10mg/Kg/次，腺嘌呤的施用劑量為200mg/kg/天。本發(fā)明動物模型更符合人類慢性腎臟病的發(fā)生發(fā)展過程，并且實驗結(jié)果提示聯(lián)合應(yīng)用兩種藥，能縮短造模時間，同一時間點腎臟損傷更加嚴重。
【專利說明】慢性腎臟病的動物模型的建立

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及慢性腎臟病的動物模型的建立，具體地，是伴有小球和小管間質(zhì)復(fù)合 損傷的慢性腎臟病動物模型的建立。

【背景技術(shù)】
[0002] 慢性腎臟?。–hronic kidney disease, CKD)是絕大多數(shù)的腎臟疾?。ㄖT如腎小 球腎炎、隱匿性腎炎、腎盂腎炎、過敏性紫癜腎炎、紅斑狼瘡腎炎、痛風(fēng)腎、IgA腎病、腎病綜 合征、膜性腎病、糖尿病腎病、高血壓腎病、多囊腎腎病）的臨床統(tǒng)稱；除了急性腎炎和急性 尿路感染（腎臟急性炎癥性疾?。┩?，都可以歸屬慢性腎臟病的范圍；本病是一個緩慢發(fā)展 相對良性的疾?。ɑ蚬餐呐R床病理過程）；但若未能及時有效診治，均可導(dǎo)致病情惡化進 展或隨病程遷延，發(fā)展成為慢性腎功能不全、腎衰竭，最終形成尿毒癥。
[0003] 慢性腎功能衰竭（CRF)是以腎臟的排泄功能、內(nèi)分泌功能、免疫功能、代謝功能等 發(fā)生一系列病理改變，機體內(nèi)環(huán)境紊亂為特征的臨床綜合征。目前文獻報道的動物模型有 以下幾種：1、以腺嘌呤制作CRF動物模型，平均攝入量為300mg/kg. d ;2、以阿霉素制作CRF 動物模型；3、以柔紅霉素制作CRF動物模型4、外科手術(shù)造模：包括大鼠單側(cè)腎切除CRF模 型，大鼠5/6腎切除CRF模型，大鼠液氮冷凍腎CRF模型，電凝摘除腎CRF模型，腎動脈分枝 結(jié)扎CRF模型。近年來慢性腎衰的動物模型無論是從藥物制備、外科手術(shù)制備還是二者相 結(jié)合共同制備，造模技術(shù)均不斷完善，但目前仍較多偏于細微局部的的觀察研究，而有關(guān) 其全方位、各系統(tǒng)的實驗研究相對開展較少，且診斷及療效標(biāo)準界定模糊，以人類慢性腎 衰的分期來界定CRF動物模型有一定局限性、因為人類和動物畢竟有一定差別，再者模型 動物缺乏對較嚴重尿毒癥的良好耐受性，通常延長實驗研究時限，均會導(dǎo)致動物死亡。（杜 卉蓮，等，慢性腎衰動物的模型制備及臨床應(yīng)用，中醫(yī)研究，2005年12月第18卷第12期）
[0004] 阿霉素腎?。ˋDR-induced nephropathy)是局灶節(jié)段性腎小球硬化（FSGS)的一 個經(jīng)典動物模型，是目前公認的能較好的模擬腎小球疾病的模型之一。阿霉素（ADR)是 一種含醌的蒽環(huán)抗腫瘤抗生素，在臨床上作為腫瘤化療藥物而廣泛應(yīng)用，ADR可在腎臟內(nèi) 代謝還原為半醌型自由基，后者與氧反應(yīng)產(chǎn)生活性氧，誘發(fā)腎小球上皮細胞脂質(zhì)過氧化反 應(yīng)，影響腎小球上皮細胞糖蛋白代謝，破壞腎小球濾過膜的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致基底膜 濾過屏障的選擇性變化，從而引起蛋白尿。有研究表明，阿霉素腎病主要是對腎小球足細胞 的損傷，腎小球足細胞是位于腎小球基底膜外側(cè)的一種終末期分化細胞，是維持腎小球濾 過屏障結(jié)構(gòu)和功能正常的主要細胞之一。足細胞足突及其裂孔隔膜是避免機體蛋白丟失的 最后一道屏障，所以足細胞或裂孔隔膜損傷必然伴隨大量蛋白尿。阿霉素的腎毒性作用及 大量蛋白尿的剌激，進一步誘發(fā)腎小球內(nèi)固有細胞及其他炎性細胞產(chǎn)生并釋放各種細胞 因子和炎性介質(zhì)，刺激腎小球系膜細胞增殖和系膜基質(zhì)增多，緩慢發(fā)展形成腎小球硬化； 亦能通過多種途徑，引起間質(zhì)炎性細胞浸潤，引起腎小管的損傷，促進間質(zhì)纖維化，最終 引起腎臟纖維化，進展為終末性腎衰竭。其中阿霉素的使用劑量為l〇mg/kg/天。目前常 用的阿霉素造模方法的用量：一次性阿霉素尾靜脈注射l〇mg/kg或者采用間隔2周兩次尾 靜脈注射阿霉素4mg/kg。
[0005] 尿酸性腎病是由于血尿酸產(chǎn)生過多或排泄減少形成高尿酸血癥所致的腎損害，通 常稱為痛風(fēng)腎病，臨床表現(xiàn)可有尿酸結(jié)石，小分子蛋白尿、水腫、夜尿、1?血壓、血、尿尿酸升 高及腎小管功能損害。近年來研究證明，腎功能損害的程度均與腎小管間質(zhì)病變的程度密 切相關(guān)。鄭平東，朱燕俐，丁名城，等.用腺嘌呤制作慢性腎功能衰竭動物模型.中華腎 臟病雜志1989 ;5(6) : 342用腺嘌呤制作慢性腎衰動物模型方法改進。即動物購置適應(yīng)周圍 環(huán)境3d后，除正常對照組外，所有動物均按200mg · kg-1 · d-Ι體重的腺嘌呤灌胃，連續(xù) 2w，再改為100mg · kg-1 · d-Ι體重的腺嘌呤灌胃，連續(xù)lw。
[0006] 阿霉素主要作用于腎小球，同時介導(dǎo)動物免疫紊亂；早期可使腎小球毛細血管內(nèi) 皮細胞和足細胞腫脹，足突融合消失，基底膜增厚；也誘發(fā)腎小球上皮細胞脂質(zhì)過氧化反 應(yīng)，破壞濾過膜，最終引起蛋白尿，誘導(dǎo)腎小球疾??；晚期緩慢發(fā)展形成腎小球硬化，同時可 伴有繼發(fā)蛋白尿的輕度腎小管損傷。
[0007] 腺嘌呤腎病模型也是慢性腎病動物模型之一。腺嘌呤主要對腎小管、間質(zhì)造成損 傷。當(dāng)機體攝入大量腺嘌呤時，沉積于腎小管，引起腎小管上皮細胞破壞，腎小管阻塞，毒素 蓄積及電解質(zhì)和氨基酸代謝紊亂，最終導(dǎo)致慢性腎損害，腎功能衰竭?；诎⒚顾睾拖汆堰?對腎臟的不同致病特點，尚缺乏免疫、代謝復(fù)合致腎小球、小管損傷，全面的反映慢性腎臟 病發(fā)生、發(fā)展過程中腎小球、腎小管以及腎間質(zhì)的病理損害過程的模型。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了一種慢性腎臟病的動物模型，它是將阿霉素與腺嘌呤 聯(lián)合應(yīng)用，造成腎小管和腎小球復(fù)合損傷。
[0009] 本發(fā)明提供了阿霉素與腺嘌呤聯(lián)合使用在制備用于篩選治療慢性腎臟病的動物 模型中的用途，其中阿霉素的施用劑量為2. 5-10mg/Kg/次，腺嘌呤的施用劑量為200mg/ kg/ 天。
[0010] 其中，所述的阿霉素的施用劑量為2. 5mg/Kg/次、5. Omg/Kg/次、7. 5mg/Kg/次。
[0011] 其中，所述的阿霉素為靜脈注射施藥；所述的腺嘌呤為口服施藥。
[0012] 其中，所述的動物模型是伴有小球和小管間質(zhì)復(fù)合損傷的大鼠慢性腎臟病動物模 型。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種制備慢性腎臟病的動物模型的方法，它是將阿霉素與腺嘌呤 施用于大鼠，其中阿霉素的施用劑量為2. 5-10mg/Kg/次，腺嘌呤的施用劑量為200mg/kg/ 天。
[0014] 其中，所述的阿霉素的施用劑量為2. 5mg/Kg/次、5. Omg/Kg/次、7. 5mg/Kg/次。
[0015] 其中，所述的阿霉素為靜脈注射施藥；所述的腺嘌呤為口服施藥。
[0016] 本發(fā)明還提供了所述的方法制備得到的慢性腎臟病動物模型。
[0017] 本發(fā)明還提供了所述的動物模型在篩選治療伴有小球和小管間質(zhì)復(fù)合損傷的慢 性腎臟病的藥物中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種篩選治療慢性腎臟病的藥物的方法，包括如下步驟：
[0019] a、將阿霉素與腺嘌呤施用于大鼠，其中阿霉素的施用劑量為2. 5-10mg/Kg/次，腺 噪呤的施用劑量為200mg/kg/天；
[0020] b、將候選物施用于a步驟所述的大鼠；
[0021] c、用慢性腎臟病動物模型評價潛在的治療慢性腎臟病的藥物。
[0022] 本發(fā)明動物模型更符合人類慢性腎臟病的發(fā)生發(fā)展過程，并且實驗結(jié)果提示聯(lián)合 應(yīng)用兩種藥，能縮短造模時間，單用阿霉素建立慢性腎臟疾病模型，造模時間為12周；單用 腺嘌呤建立該模型，造模時間為4周；結(jié)合這兩類藥物的特性，聯(lián)合應(yīng)用建立慢性腎臟疾病 模型，模型建立3周即出現(xiàn)典型的慢性腎臟病理改變，4周后病變更顯著，因此，造模周期為 3-4周，且同一時間點腎臟損傷更加嚴重。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1正常組
[0024] 圖2阿霉素組
[0025] 圖3腺嘌呤組
[0026] 圖4阿霉素（2. 5mg/kg) +腺嘌呤組
[0027] 圖5阿霉素（5mg/kg) +腺嘌呤組
[0028] 圖6阿霉素（7. 5mg/kg) +腺嘌呤組
[0029] 圖7正常組
[0030] 圖8腺嘌呤組
[0031] 圖9阿霉素組
[0032] 圖10阿霉素（2. 5mg/kg) +腺嘌呤組
[0033] 圖11阿霉素（5mg/kg)+腺嘌呤組
[0034] 圖12阿霉素（7. 5mg/kg) +腺嘌呤組
[0035] 圖13, A正常組；B腺嘌呤組
[0036] 圖14, A:阿霉素組，B、阿霉素（2. 5mg/kg)+腺嘌呤組；
[0037] 圖15, A:阿霉素（5mg/kg)+腺嘌呤組；B:B:阿霉素（7. 5mg/kg)+腺嘌呤組

【具體實施方式】
[0038] 實施例1本發(fā)明動物模型的制備
[0039] 1、實驗動物：由瀘州醫(yī)學(xué)院SPF實驗研究中心提供。許可證：SYXK (川）2013-065
[0040] 所有動物均飼養(yǎng)在SPF級環(huán)境中，光照時間明暗各半，室溫22°C -24°C，濕度 50% -70%。動物飼喂全價顆粒料，自由進食和飲水。
[0041] 2、研究設(shè)計：按照劑量分組，給予藥物干預(yù)4周，觀察12周，觀察模型大鼠在不同 病理損傷發(fā)生發(fā)展的特征，收集標(biāo)本，檢測相關(guān)指標(biāo)。
[0042] 3、干預(yù)方式：按不同分組，一次性尾靜脈注射不同劑量的阿霉素，并每日灌胃給予 腺嘌呤。
[0043] 4、實驗流程：
[0044] 將SD大鼠140只，按體重分層隨機數(shù)字表法，分為7組，每組20只，分別為阿霉素 組（A)，腺嘌呤組（B)，阿霉素+腺嘌呤組（AB1)，阿霉素+腺嘌呤組（AB2)，阿霉素+腺嘌 呤組（AB3)，阿霉素+腺嘌呤組（AB4)，正常組（C)。
[0045] 將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，給予A組，AB1-AB4組共5組大鼠分別一次性尾靜脈注 射不同劑量的阿霉素（劑量依次為l〇mg/kg，2. 5mg/kg, 5mg/kg, 7. 5mg/kg, lOmg/kg);給予B 組、AB1-AB4組共5組大鼠每日定時腺嘌呤灌胃，劑量均為200mgAkg. d);給予C組大鼠同 等體積的生理鹽水尾靜脈注射及灌胃。在連續(xù)灌胃2周后，AB1-AB4組進行隔天灌胃。分 別于2周、4周、6周、8周、10周、12周收集尿、血液、組織標(biāo)本，進行檢測分析。
[0046] 5、觀察及檢測指標(biāo)：包括動物一般情況；尿液分析；血液生化分析；腎臟病理。
[0047] 6、建立CKD動物模型標(biāo)準化指標(biāo)見觀察指標(biāo)。
[0048] (1)動物一般情況：大鼠體重、食量、飲水量、精神、反應(yīng)、活動度、毛發(fā)等一般狀 態(tài)。
[0049] (2)尿液：①尿常規(guī)；②尿蛋白定量；③尿β 2-MG、溶菌酶；④尿肌酐。
[0050] (3)血液：①血尿素氮、血肌酐；②血常規(guī)；③血清總蛋白、白蛋白；④膽固醇、甘油 三酯；⑤血電解質(zhì)、C02-CP。
[0051] (4)腎常規(guī)病理檢查：
[0052] 光鏡：腎小球、腎小管間質(zhì)病理形態(tài)，纖維化，炎細胞浸潤。
[0053] 電鏡：腎小球足細胞、足突、GBM，腎小管上皮細胞等超微結(jié)構(gòu)。
[0054] (5) CKD動物模型鑒定、標(biāo)準化指標(biāo)
[0055] ①一般指標(biāo)：進食減少，體重減輕，反應(yīng)靈敏度下降；②小便：24h尿蛋白升高；③ 血腎功：血尿素氮、血肌酐明顯升高；④病理：腎臟體積縮小，腎小球硬化，間質(zhì)纖維化，小 管擴張，管內(nèi)有蛋白管型；⑤骨代謝：鈣、磷代謝紊亂，腎性骨營養(yǎng)不良。
[0056] 7、實驗手段和方法
[0057] 7. 1、動物模型制作每日灌胃腺嘌呤，和或一次性尾靜脈注射阿霉素；灌胃丙基硫 氧嘧啶或甲狀腺素；所有動物均飼養(yǎng)在SPF級環(huán)境中，光照時間明暗各半，室溫22°C _24°C， 濕度50% -70%。動物飼喂全價顆粒料，自由進食和飲水。
[0058] 每組大鼠均于2周末、4周末、6周末、8周末、10周末、12周末用代謝籠收集24h尿 液，用量杯測尿量，搖勻取3mL，3000r/min，離心5min，全自動生化分析儀檢測。
[0059] 組織取材當(dāng)日，戊巴比妥鈉麻醉后，心臟穿刺采血，室溫下2h內(nèi)離心，3000r/min, 離心lOmin，取血清，全自動生化分析儀檢測。手術(shù)獲取腎臟，按照目的分別作一定預(yù)處理。
[0060] 7. 2小便指標(biāo)常規(guī)自動尿液分析儀分析。
[0061] 7. 3血液指標(biāo)貝克曼自動分析儀分析生化指標(biāo)，血細胞分析儀分析血液
[0062] 學(xué)指標(biāo)。
[0063] 7. 4、光鏡、電鏡檢測
[0064] 光鏡：腎組織常規(guī)方法經(jīng)FAA固定、乙醇脫水、石蠟包埋后，制成3 μ m厚的石蠟切 片，做普通HE、PAS染色及Masson特殊染色，Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)的改 變。
[0065] 電鏡：常規(guī)方法腎組織取出后切成1mm3的小塊，經(jīng)25mL/L的戊二醛固定、lg/ L磷酸鹽緩沖液浸洗、10g/L鋨酸固定、lg/L磷酸鹽緩沖液浸洗、乙醇梯度脫水、環(huán)氧樹脂 EP0N812浸透、包埋，聚合后作半超薄切片1?2u，美藍染色后光學(xué)顯微鏡下定位，超薄切片 機進行超薄切片50?70nm，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后透射式電子顯微鏡下觀察、拍照。
[0066] 8、結(jié)果：
[0067] 2周末不同處理方式對大鼠血尿素氮、肌酐、24h尿蛋白的影響
[0068]

【權(quán)利要求】
1. 阿霉素與腺嘌呤聯(lián)合使用在制備用于篩選治療慢性腎臟病的動物模型中的用途，其 中阿霉素的施用劑量為2. 5-10mg/Kg/次，腺嘌呤的施用劑量為200mg/kg/天。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于：所述的阿霉素的施用劑量為2. 5mg/Kg/ 次、5. Omg/Kg/ 次、7. 5mg/Kg/ 次。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的阿霉素為靜脈注射施藥；所述 的腺嘌呤為口服施藥。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項所述的用途，其特征在于：所述的動物模型是伴有小球 和小管間質(zhì)復(fù)合損傷的大鼠慢性腎臟病動物模型。
5. -種制備慢性腎臟病的動物模型的方法，其特征在于：它是將阿霉素與腺嘌呤施用 于大鼠，其中阿霉素的施用劑量為2. 5-10mg/Kg/次，腺嘌呤的施用劑量為200mg/kg/天。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的動物模型的制備方法，其特征在于：所述的阿霉素的施用劑 量為 2. 5mg/Kg/ 次、5. Omg/Kg/ 次、7. 5mg/Kg/ 次。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的動物模型的制備方法，其特征在于：所述的阿霉素為靜脈注 射施藥；所述的腺嘌呤為口服施藥。
8. 權(quán)利要求5-7任意一項所述的方法制備得到的慢性腎臟病動物模型。
9. 權(quán)利要求8所述的動物模型在篩選治療伴有小球和小管間質(zhì)復(fù)合損傷的慢性腎臟 病的藥物中的應(yīng)用。
10. -種篩選治療慢性腎臟病的藥物的方法，包括如下步驟： a、 將阿霉素與腺嘌呤施用于大鼠，其中阿霉素的施用劑量為2. 5-10mg/Kg/次，腺嘌呤 的施用劑量為200mg/kg/天； b、 將候選物施用于a步驟所述的大鼠； c、 用慢性腎臟病動物模型評價潛在的治療慢性腎臟病的藥物。
【文檔編號】A61K31/704GK104095865SQ201410339515
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月16日
【發(fā)明者】樊均明, 芶芳芳, 馬欣 申請人:樊均明