一種特異性針對Neutrokine-α蛋白的核酸適配體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種特異性針對Neutrokine-α蛋白的核酸適配體，其具有較好的結(jié)合Neutrokine-α蛋白的活性，可以用于制備成為試劑盒從而特異性的篩選以及去除Neutrokine-α蛋白。
【專利說明】—種特異性針對Neutroki ne- α蛋白的核酸適配體及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，本發(fā)明涉及用于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的多肽。

【背景技術(shù)】
[0002]系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)據(jù)認(rèn)為是自體免疫疾病，其中B淋巴細胞的異常機能亢進和免疫球蛋白Y(IgG)自體抗體的大量異常產(chǎn)生起著關(guān)鍵作用。該病理學(xué)過程導(dǎo)致Ig包覆的細胞的隱沒和破壞、補體蛋白的固定和切割以及化學(xué)吸引素(chemotaxin)、血管活性肽和破壞性酶在組織中的釋放。
[0003]系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)并發(fā)動脈粥樣硬化(AS)是SLE主要致死原因之一。早在1976年，人們已經(jīng)注意到了 SLE死亡率曲線呈"雙峰"模式，一個是在活動性狼瘡早期階段敗血癥的高發(fā)生率，另一個是非活動性狼瘡?fù)砥陔A段心肌梗死的高發(fā)生率。盡管各種疾病控制措施大大提高了系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的生存率，然而AS仍然是導(dǎo)致SLE患者死亡的主要原因。紅斑狼瘡的病例對照(年齡，種族，和性別相匹配)研究表明:在年齡小于50歲的紅斑狼瘡的患者中，31-37%患者表現(xiàn)出AS病變的代表性標(biāo)志物，而對照組中僅有9-15%的人群表現(xiàn)出這種代表標(biāo)志物；在年齡大于或等于50歲的患者中，70-80%的狼瘡患者表現(xiàn)出動脈粥樣硬化病變的代表性標(biāo)志物，而對照人群中只有21-45%的人具有這種代表性標(biāo)志物。
[0004]SLE的特征在于多樣性表現(xiàn)形式。在疾病進程中，總共95%的患者訴有肌肉骨骼疾病，80 %表現(xiàn)出皮膚損傷，85 %有血液疾病，60 %有神經(jīng)紊亂，60 %有心肺疾病，30 %~50%有腎臟疾病，40%有胃腸道疾病，15%有血栓且15%有眼部疾病。大多數(shù)的患者(95% )還經(jīng)受在大多數(shù)時候均存在的系統(tǒng)性癥狀，如疲倦、不適、發(fā)燒、厭食和體重減輕。多數(shù)患者經(jīng)歷突發(fā)與緩解交替的疾病期。永久性緩解(不治療時沒有癥狀)極為罕見。超過50年之前，多數(shù)診斷為SLE的患者存活少于5年?，F(xiàn)在，10年存活超過90%，這主要是基于早診斷、對癥抗炎和免疫抑制治療。常見死因為免疫抑制造成的感染。
[0005]研究結(jié)果顯示:包括高血壓、肥胖、糖尿病、吸煙、高膽固醇血癥、絕經(jīng)后狀態(tài)等在內(nèi)傳統(tǒng)危險因素均不能完全解釋紅斑狼瘡患者中冠心病加重的原因，而系統(tǒng)性紅斑狼瘡本身(非長期使用糖皮質(zhì)激素的情況下)依然是一個獨立危險因素。盡管疾病病程與系統(tǒng)性紅斑狼瘡損傷指數(shù)都是促進動脈粥樣硬化(頸動脈斑塊)的獨立預(yù)測因素，但狼瘡如何增加動脈粥樣硬化的發(fā)生風(fēng)險尚未完全明了。
[0006]在SLE治療中常規(guī)使用抗瘧疾藥、抗炎藥和免疫抑制藥物。當(dāng)癥狀難以控制時，對非甾體抗炎劑補充以皮質(zhì)激素。此外，主要器官受累的活躍的SLE需要采用環(huán)磷酰胺的激進性療法。
[0007]迄今為止，還沒有可用于治愈SLE和/或在長期基礎(chǔ)上改善患者的生活品質(zhì)的病因性治療。然而，近來在抗體技術(shù)中的發(fā)展和對引起該自體免疫疾病的因素的進一步鑒定已經(jīng)開啟了使用單克隆抗體作為治療選擇的可能性。特別地，治療SLE的有利方法將是與導(dǎo)致多克隆自體抗體的大量過度產(chǎn)生的病理性免疫響應(yīng)相互作用或?qū)⑵浼m正的特異性治療。由于SLE的發(fā)病機理主要涉及失調(diào)的B細胞，特別受關(guān)注的是能夠靶向B細胞的單克隆抗體。潛在的B細胞表面抗原靶標(biāo)是⑶19、⑶20、⑶21和⑶22。此外，IL-10、IL-1ra,IL-12是調(diào)節(jié)免疫響應(yīng)的重要細胞因子，且尤其在SLE患者的突發(fā)期間升高。IL-10和抗雙鏈DNA(dsDNA)的自體抗體的血漿水平往往反映患SLE的患者的疾病活躍性。升高的IL-10水平與SLE患者的疾病活躍性相關(guān)(Park等，Clin.Exp.Rheumatol.1998年5月-6月；16(3):283-8)。然而，IL-10是對免疫系統(tǒng)具有多效性的細胞因子，且已知其還參與降低促炎性響應(yīng)。
[0008]已對SLE患者進行了采用單克隆抗體的臨床試驗。特別地，幾種試驗涉及抗體利妥昔單抗(Rituximab)，一種用于治療非霍奇金氏淋巴瘤的嵌合小鼠抗CD20單克隆抗體。Robak和Robak(2009)注意到，這些試驗的結(jié)果顯示出該抗體在SLE患者中較高的活性，且已開發(fā)了數(shù)種新的靶向⑶20的抗體(Ofatumumab、IMMU-106和GA-101)。其它報道了單克隆抗體在SLE中的活性的臨床試驗采用抗CD22抗體、依帕珠單抗(Epratuzumab)、抗TNF α 抗體、英夫利昔單抗(Infliximab)、抗 IL-10 抗體、Β-Ν10 (Llorente 等,ArthritisRheum.2000 年 8 月；43(8):1790-800)、抗 CD40L 抗體、IDEC 131 和 BG 9588、BLYS 抑制劑、貝利單抗(Belimumab)、抗IL6受體抗體、妥克利母單抗(Toclimumab)和抗C5抗體依庫珠單抗(Eculizumab)完成。
[0009]Neutrokine-α蛋白(SEQ ID NO:1)是TNF配體家族的一個成員，其與APRIL (28.7% ),TNFa (16.2% )、和淋巴毒素-a (LTa) (14.1% )享有氨基酸序列相同性(Moore, et al., (19 99) Science 285:260-263)。Neutrokine- α 的正式名稱是腫瘤壞死因子(配體)超家族成員13B(TNFSF13b)。全長Neutrokine-α基因編碼285個氨基酸的多肽，其第47位到73位氨基酸之間為跨膜區(qū)，跨膜區(qū)前面為II型膜結(jié)合蛋白特征性的非疏水性序列。和TNF家族的其他成員一樣,Neutrokine-α以三聚體蛋白的形式發(fā)揮作用。當(dāng)Neutrokine-α在細胞表面表達之后，在第134位氨基酸處裂解細胞外區(qū)，以便釋放出有生物學(xué)活性的三聚體。
[0010]已知Neutrokine-α與來自腫瘤壞死因子受體超家族的三種不同受體結(jié)合。它們是跨膜活化物和CAM互作用體、B細胞活化因子受體、B細胞成熟抗原。受體的表達主要限定于B淋巴細胞。相信Neutrokine-α的大部分作用都是由BAFF-R介導(dǎo)的，因為在Neutrokine-α表達缺陷或BAFF-R表達缺陷小鼠的B細胞組分中的主要缺陷在TACI或BCMA缺陷小鼠中并不明顯。
[0011]當(dāng)在體外和體內(nèi)檢測Neutrokine-α蛋白時,Neutrokine-α顯示出能促進B細胞的增殖、分化和生存。另外,Neutrokine-α也顯示出一些對T細胞的作用。被遺傳工程化成過度表達Neut1kine-α的小鼠具有增加數(shù)目的外周B細胞和增高的免疫球蛋白濃度。另外，Neutrokine-α轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出自身免疫表型，其與人系統(tǒng)性紅斑狼瘡中看到的類似，包括發(fā)生自身抗體和腎小球腎炎相關(guān)癥狀。后來的研究顯示在自身免疫病例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和干燥綜合征患者的血清和/或滑膜液中的Neutrokine-α水平也是被上調(diào)的。因此，在科學(xué)界普遍的看法是Neut1kine-α拮抗劑在治療自身免疫病方面具有治療作用。
[0012]發(fā)明詳述
[0013]本發(fā)明的目的在于提供能夠特異性結(jié)合Neutrokine-α蛋白的適配子,從而實現(xiàn)將人體中Neutrokine- α被結(jié)合、分離或者功能被抑制，從而達到治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的效果。
[0014]所述能識別Neutrokine-α蛋白的寡核苷酸序列,包括SEQ ID N0.2_15，且采用其中的一條寡核苷酸序列就能完成對Neutrokine-α蛋白的識別檢測；
[0015]所述一組能識別Neutrokine-α蛋白的寡核苷酸序列的制備方法包括以下步驟:
[0016]1、合成用于篩選的ssDNA寡核苷酸文庫(5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCTTC——
[0017]N35——GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3')，其中 N35 為 35 個隨機寡核苷酸；
[0018]2、將寡核苷酸文庫分別與Neutrokine- α蛋白混合后進行SELEX篩選，獲得適配子富集文庫；
[0019]3、SELEX篩選完成后，對獲得的適配子富集文庫進行克隆測序；
[0020]4、選擇測序結(jié)果中出現(xiàn)的高拷貝ssDNA，進行親和特異性的驗證，篩選獲得能識別Neutrokine-α蛋白的寡核苷酸序列。

【具體實施方式】
[0021]實施例:
[0022]1、Neutrokine-α 蛋白的制備
[0023]采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的酵母重組表達的方式獲得具有與Neutrokine-α蛋白相同生物活性的Neutrokine-α蛋白，該蛋白序列如SEQ ID NO:1所示；蛋白溶液的濃度為 10mg/mlo
[0024]2、文庫和引物的合成
[0025]2.1、合成用于篩選的 ssDNA寡核苷酸文庫(5' -AATTCACTTACTTAACCAATCCGG——N35——ACACAAGAGTGAGAATTAGAGCG-3')，其中 N35 為 35 個隨機寡核苷酸；
[0026]引物Pl:AATTCACTTACTTAACCAATCCGG ；
[0027]引物P2: CGCTCTAATTCTCACTCTTGTGT。
[0028]2.2、適配子的SELEX篩選，具體方法如下:
[0029]2.2.1ssDNA與Neutrokine-α蛋白的結(jié)合、分離，具體方法如下:
[0030]取100μΜ的ssDNA寡核苷酸文庫4μ L，用2Χ結(jié)合緩沖液稀釋至100 μ 1，95 °C變性5min,冰浴1min后加入100 μ I Neutrokine- α蛋白，搖床結(jié)合50min,再6000rpm離心7min,棄上清,然后用IX結(jié)合緩沖液洗沉淀,棄上清；在沉淀中再加入IX結(jié)合緩沖液100 μ L,96°C加熱5min,然后15000rpm離心1min,取上清液,對沉淀再次加熱并離心,合并上清液，則可分離得到與Neutrokine-α蛋白有親和力的ssDNA次級文庫；所述2X結(jié)合緩沖液為20 X結(jié)合緩沖液用雙蒸水稀釋10倍后的溶液，所述IX結(jié)合緩沖液為20 X結(jié)合緩沖液用雙蒸水稀釋20倍后的溶液；所述20X結(jié)合緩沖液配方為IM NaCl、50mM KCl、500mMTris-HClUOmM MgCl2, pH 7.4。
[0031]2.2.2 ssDNA與Neutrokine-α蛋白的結(jié)合、分離，具體方法如下:
[0032]將步驟2.2.I分離得到的能與Neutrokine-α蛋白結(jié)合的ssDNA,再與100 μ INeutrokine-α蛋白搖床結(jié)合30min,后續(xù)步驟同步驟2.2.1,可分離到與Neutrokine-α蛋白有親和力的ssDNA次級文庫。
[0033]2.2.3不對稱PCR擴增ssDNA，具體方法如下:
[0034]對步驟2.2.2分離獲得的ssDNA次級文庫進行不對稱PCR擴增，總體積為25 μ I的不對稱 PCR 擴增體系為:10XPCR 緩沖液:2μ I ；Ρ1(10μΜ):1μ I ；Ρ2(0.2μΜ):1μ I ；dNTP (各 2.5mM):0.4μ I ；MgCl2(25mM):1.2μ I ;ssDNA 模板(0.2 μ g/ μ I):2μ I ；Taq DNA聚合酶(5ιι/μ I):0.2μ I ；ddH20:17.2μ I ;PCR 反應(yīng)參數(shù):94°C預(yù)變性 4min，然后進行 40個循環(huán)94°C變性30s，58。。退火30s，72。。延伸20s，最后72°C延伸7min ；
[0035]2.2.4親和力的測定，具體方法如下:
[0036]2.2.4.1擴增:用帶有地高辛標(biāo)記的引物Pl不對稱PCR擴增篩選出來的ssDNA次級文庫，擴增條件和參數(shù)與步驟2.2.3的不對稱PCR擴增體系和參數(shù)相同；
[0037]2.2.4.2與蛋白結(jié)合:取步驟2.2.4.1擴增所得的PCR產(chǎn)物100μ L，95°C變性5min,冰浴1min后加入100 μ L蛋白中，充分混合,在室溫下結(jié)合30min,然后6000rpm離心，分離蛋白與上清液，蛋白中包含有與蛋白中結(jié)合的帶地高辛標(biāo)記的ssDNA，上清液中是未結(jié)合的ssDNA，同時做一不加ssDNA的空白，即用2 X結(jié)合緩沖液代替PCR產(chǎn)物，同樣進行上述操作；
[0038]2.2.4.3洗滌:將蛋白用IX結(jié)合緩沖液500 μ L洗滌I次，6000rpm離心，棄上清，
取蛋白；
[0039]2.2.4.4與酶標(biāo)兔抗地高辛抗體結(jié)合:在蛋白中加入100 μ L1:900TBS稀釋的過量的酶標(biāo)兔抗地高辛抗體，充分混合后，反應(yīng)lOmin，使之與蛋白中的地高辛標(biāo)記的ssDNA結(jié)合；
[0040]所述TBS為0.5M Tris-NaCl溶液，配制方法為:先水溶8.5~9g NaCl,再加Tris-HCK0.5M, ρΗ7.6)溶液 100ml，最后加水定容至 IL ；0.5M Tris-HCl (ρΗ7.6，100ml)溶液配制方法:稱取Tris 6.06g,加入雙蒸水40ml溶解，滴加濃HCl調(diào)pH至7.6，定容至10mlo
[0041]2.2.4.5洗滌:6000rpm離心，去上清，再用IX結(jié)合緩沖液500 μ L洗滌3次，得蛋白；
[0042]2.2.4.6ΤΜΒ (四甲基聯(lián)苯胺)顯色:加入400 μ L雙蒸水重懸蛋白，再加入200 μ LTMB顯色液，避光顯色1min后，以2mol/L H2S04200 μ L終止反應(yīng)，測定450nm處的吸光值0D450，該值即反映與菌結(jié)合的ssDNA的親和力，即OD結(jié)合，空白同樣進行上述步驟
2.2.4.3,2.2.4.4,2.2.4.5和2.2.4.6，得到空白相應(yīng)的吸光度OD空白；
[0043]所述TMB顯色液使用常規(guī)的配制方法配制。
[0044]2.2.4.7測定PCR產(chǎn)物中DNA的摩爾濃度:取步驟2.2.4.1擴增所得的PCR產(chǎn)物，以已知濃度梯度的初始ssDNA文庫為標(biāo)準(zhǔn)品，用Bandscan軟件作為圖像分析軟件，采用溴化乙錠瓊脂糖凝膠電泳法定量測定PCR產(chǎn)物中的DNA含量，獲得相應(yīng)DNA的摩爾濃度，進而可以計算出10yL PCR產(chǎn)物中的DNA摩爾數(shù)。
[0045]2.2.4.8計算相應(yīng)文庫的親和力:
[0046]

【權(quán)利要求】
1.一種用于適配子篩選的Neutrokine-α蛋白，其序列為SEQ ID Ν0:1所示。
2.—種識別Neutrokine-α蛋白的寡核苷酸序列,其特征在于為SEQ ID N0.2_15任一條序列所示。
3.權(quán)利要求2所示的寡核苷酸序列用于篩選Neutrokine-α蛋白的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所示的寡核苷酸序列制備得到的藥物組合物、試劑或試劑盒。
5.權(quán)利要求4所示的寡核苷酸序列在制備用于治療紅斑狼瘡的藥物組合物、試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K31/7088GK104177488SQ201410342519
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年7月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月13日
【發(fā)明者】馬海龍 申請人:馬海龍