雙靶向固體脂質(zhì)磁性納米粒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種具有雙重靶向作用的固體脂質(zhì)磁性納米粒，該磁性納米粒由F-68溶液、硬脂胺-半乳糖嫁接物、單甘脂、四氧化三鐵及油酸乙醇組成。通過(guò)硬脂胺、乳糖酸和碳二亞胺溶于無(wú)水乙醇中，得硬脂胺-半乳糖嫁接物，以水性溶劑擴(kuò)散法制備脂質(zhì)磁性納米粒。本發(fā)明提供的固體脂質(zhì)磁性納米粒，可制備成一種對(duì)肝臟具有主動(dòng)和被動(dòng)雙重靶向功能的磁共振特異對(duì)比劑，可應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。利用這種對(duì)比劑，有望實(shí)現(xiàn)安全、快速的肝靶向分子影像成像；提高我國(guó)磁共振對(duì)比劑研發(fā)的自主創(chuàng)新能力，為開拓我國(guó)磁共振新型對(duì)比劑的研發(fā)，提供理論與技術(shù)基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】
雙靶向固體脂質(zhì)磁性納米粒及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬化合物制備方法，涉及固體脂質(zhì)磁性納米粒的合成方法，以及作為納米級(jí)肝組織雙靶向磁共振對(duì)比劑在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]磁共振成像(MRI)技術(shù)是目前對(duì)肝臟疾病，尤其是局灶性病變的診斷和鑒別診斷最有效的影像學(xué)檢查手段之一，能夠提供準(zhǔn)確的解剖形態(tài)和功能信息，在分子成像中具有良好的應(yīng)用前景。但是，MRI對(duì)分子探針探測(cè)的靈敏度低，要實(shí)現(xiàn)疾病的MR分子成像，必須要有足夠濃度的對(duì)比劑與相關(guān)分子靶點(diǎn)結(jié)合，并產(chǎn)生可分辨的MR信號(hào)改變。因此，制備安全有效的靶點(diǎn)特異性對(duì)比劑是MRI分子成像的關(guān)鍵所在，不僅可以減少成像所需對(duì)比劑的劑量，降低對(duì)比劑所致的毒副作用，還可以提高疾病早期診斷的準(zhǔn)確性。
[0003]固體脂質(zhì)納米粒(Solid lipid nanoparticles, SLN)是近年來(lái)正在發(fā)展的一種新型納米粒給藥系統(tǒng)，其為粒徑在l(Tl 000 nm之間的固態(tài)膠體顆粒。這種新型給藥載體使用無(wú)生物毒性的脂質(zhì)作為基質(zhì)，同時(shí)具備納米粒的物理穩(wěn)定性高、可控制藥物釋放以及良好的靶向性等優(yōu)勢(shì)，又兼具了脂質(zhì)體、乳劑的毒性低、能大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，是一種極有發(fā)展前景的新型給藥載體。SLN以固態(tài)的天然或合成的類脂如單硬脂酸甘油酯、卵磷脂、三酰甘油等為載體材料，大多數(shù)為內(nèi)源性物質(zhì)，將藥物或造影劑包裹或內(nèi)嵌于類脂核中制成酸態(tài)固體膠粒給藥系統(tǒng)，具有毫微粒和脂質(zhì)體的雙重特點(diǎn)，起到避免藥物泄漏及良好的靶向性等優(yōu)點(diǎn)，因其表面具有強(qiáng)疏水性，能夠提聞網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞曬率，從而大大提聞了藥物或造影劑在肝臟中的濃度，具有顯著的被動(dòng)肝靶向作用。SLN還具有下列特點(diǎn):(1)毒性低，SLN對(duì)不同細(xì)胞毒性(半數(shù)細(xì)胞致死量)介于400-500 μδ/πι1之間；(2)SLN采用脂肪酸等類脂為主要材料，具有較低的代謝毒性；(3)與其它載體如右旋糖酐比較，SLN納米粒表面為強(qiáng)疏水性，在體內(nèi)易與調(diào)理蛋白結(jié)合，靜脈注射進(jìn)入機(jī)體后，很快被Kupffer細(xì)胞吞噬而被動(dòng)進(jìn)入肝臟，具有顯著的被動(dòng)肝靶向作用；(4) SLN具有細(xì)胞攝取及轉(zhuǎn)運(yùn)能力，為疾病確診后的即時(shí)靶向治療提供可能。
[0004]去唾液酸糖蛋白受體(Asialoglycoprotein receptor, ASGPR)又稱肝凝集素受體或肝細(xì)胞半乳糖受體，是一種完全由哺乳動(dòng)物肝竇狀隙的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞特異性表達(dá)的膜表面蛋白，能夠特異性地識(shí)別帶有半乳糖殘基的糖蛋白，每個(gè)肝細(xì)胞表面有多達(dá)5 X 15個(gè)受體，而在肝炎、肝硬化、肝癌或等肝轉(zhuǎn)移癌等肝臟疾病時(shí)，其數(shù)量和功能均有所下降。半乳糖(Gal)是ASGPR的特異性配體，是肝靶向基團(tuán)，具有誘導(dǎo)和提高肝細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)支架材料上的粘附性能，半乳糖受體介導(dǎo)的載體交聯(lián)物已成為肝靶向研究的熱點(diǎn)之一。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供具有雙重靶向作用的固體脂質(zhì)磁性納米粒。該磁性納米粒由F-68溶液(94%)、硬脂胺-半乳糖嫁接物(0.4%)、單甘脂(3.6%)、四氧化三鐵納米溶液(1%)及油酸乙醇(1%)等組成，其中的百分比為體積比。脂質(zhì)材料為單甘脂。
[0006]擬將經(jīng)Gal修飾后的SLN作為肝靶向特異對(duì)比劑載體，構(gòu)建經(jīng)USP1標(biāo)記的肝雙靶向特異對(duì)比劑，可能大大提高對(duì)比劑靶向性，而有望降低對(duì)比劑注射劑量，最終實(shí)現(xiàn)降低對(duì)比劑對(duì)全身毒副作用的目的。
[0007]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供固體脂質(zhì)磁性納米粒的制備方法，通過(guò)以下方案實(shí)現(xiàn):
(I)硬脂胺-半乳糖嫁接物的合成
取市售硬脂胺、乳糖酸和碳二亞胺(EDC，18.4 mmol)溶于一定量的無(wú)水乙醇中，在室溫下攪拌反應(yīng)72 h后，加水沉淀產(chǎn)物，離心分離后所得沉淀經(jīng)干燥后，得硬脂胺-半乳糖嫁接物，其結(jié)構(gòu)通過(guò)紅外光譜(FTIR)和氫譜核磁共振(1H NMR)進(jìn)行確證。
[0008](2)肝雙重靶向脂質(zhì)磁性納米粒的制備
以水性溶劑擴(kuò)散法制備脂質(zhì)磁性納米粒。具體方法為:將一定量油溶性的Fe3O4 (粒徑為5 nm，濃度為5 mg/ml)為核心的磁性納米粒溶液超聲分散于F-68溶液(Poloxamer 188，
0.1 %,w/v)中，探頭持續(xù)超聲30 min (600 w,工作2 s,間歇3 s)后,加入10 mg/ml的油酸乙醇溶液，探頭超聲5 min，以得到Fe3O4納米粒分散液。分別取單甘脂和硬脂胺-半乳糖嫁接物，并溶于一定量的無(wú)水乙醇中，水浴70°C加熱使其完全融解；在水浴70°C的超聲條件下，將脂質(zhì)的乙醇溶液快速注入到Fe3O4納米粒分散液中，持續(xù)超聲5 min后,最終得到肝雙祀向脂質(zhì)磁性納米粒。
[0009]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述固體脂質(zhì)磁性納米粒在制備對(duì)肝臟具有雙重靶功能的磁共振對(duì)比劑中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明在我們前期的研究工作基礎(chǔ)上，采用乳糖酸(LA)和硬脂胺(ODA)之間的化學(xué)耦合反應(yīng)制備半乳糖-硬脂胺嫁接物，在此基礎(chǔ)上，以單甘脂為脂質(zhì)材料，采用水性溶劑擴(kuò)散法制備對(duì)肝臟具有雙重靶向功能的脂質(zhì)磁性納米粒。該材料的出現(xiàn)、以及經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的載體應(yīng)用研究，將大大推動(dòng)肝臟的靶向磁共振對(duì)比劑發(fā)展。
[0011]本發(fā)明所提供的固體脂質(zhì)磁性納米粒，可制備成一種對(duì)肝臟具有主動(dòng)和被動(dòng)雙重靶向功能的新型磁共振特異對(duì)比劑，可應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。利用這種對(duì)比劑，有望實(shí)現(xiàn)安全、快速的肝靶向分子影像成像；提高我國(guó)磁共振對(duì)比劑研發(fā)的自主創(chuàng)新能力；為開拓我國(guó)磁共振新型對(duì)比劑的研發(fā)，提供理論與技術(shù)基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1為本發(fā)明肝組織雙靶向脂質(zhì)磁性納米粒的制備路線圖。
[0013]圖2為嫁接物的紅外光譜。
[0014]圖3為嫁接物的1H核磁共振圖譜。
[0015]圖4為脂質(zhì)磁性納米粒的透射電子顯微鏡(TEM)觀察。
[0016]圖5為脂質(zhì)磁性納米粒與L02細(xì)胞系共孵育48 h后細(xì)胞的存活情況。
[0017]圖6為脂質(zhì)磁性納米粒在L02細(xì)胞上不同時(shí)間點(diǎn)(I h、4 h和12 h)的攝取情況。
[0018]圖7為不同鐵濃度(Pg/ml)的脂質(zhì)磁性納米粒的T2*WI磁共振圖像。

【具體實(shí)施方式】
[0019]本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0020]實(shí)施例一:硬脂胺-半乳糖嫁接物的合成
取市售硬脂胺(ODA，Mw:269.5)、乳糖酸(LA，Mw:358.3)和碳二亞胺(EDC，18.4 mmol)溶于一定量的無(wú)水乙醇中，在室溫下攪拌反應(yīng)72 h后，加水沉淀產(chǎn)物，離心分離后所得沉淀經(jīng)干燥后，得硬脂胺-半乳糖嫁接物。將冷凍干燥后的嫁接物樣品經(jīng)傅里葉紅外光譜儀檢測(cè)樣品表面官能基團(tuán)。將嫁接物溶于D2O中，濃度為20 mg/ml，用核磁共振儀進(jìn)行檢測(cè)并記錄核磁共振氫譜，對(duì)其特征峰進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。
[0021]參見圖2，結(jié)果顯示，在LA、ODA和Gal-ODA的紅外光譜中，LA在1730(^1及1070cm—1附近出現(xiàn)了 LA尖銳的羧基特征吸收峰和羥基的C-O伸縮振動(dòng)峰，但在Gal-ODA的紅外光譜圖中LA的羧基特征吸收峰消失，但羥基的C-O伸縮振動(dòng)峰卻出現(xiàn)在了 Gal-ODA的紅外光譜中。另外，ODA在3000CHT1附近的烷基(-CH2-)特征吸收峰在Gal-ODA中得以完整的保留下來(lái)。說(shuō)明LA的羧基和ODA中的氨基已成功結(jié)合在了一起。
[0022]參見圖3，結(jié)果顯示，LA的核磁共振氫譜圖上，在化學(xué)位移12.01-13.12 ppm處，出現(xiàn)了一個(gè)明顯的單信號(hào)峰，該峰可歸屬于LA中的羧基峰，而在Gal-ODA的核磁共振氫譜圖中可以看出，該處的單信號(hào)峰已經(jīng)消失；在化學(xué)位移7.25-7.83 ppm處出現(xiàn)了一個(gè)不規(guī)整的寬峰信號(hào)，該峰歸屬于酰胺中的-NH-質(zhì)子峰信號(hào)；在化學(xué)位移4.79 -5.46 ppm處，Gal-ODA的核磁共振氫譜圖上出現(xiàn)了一個(gè)尖銳的質(zhì)子峰信號(hào)，該峰與LA上的-O-CH-O-質(zhì)子峰相對(duì)應(yīng)。說(shuō)明ODA已經(jīng)成功嫁接到了 LA上。
[0023]實(shí)施例二:
1、脂質(zhì)磁性納米粒的制備及理化性質(zhì)測(cè)定
以水性溶劑擴(kuò)散法制備脂質(zhì)磁性納米粒。具體方法為:將一定量油溶性的Fe3O4 (粒徑為5 nm，濃度為5 mg/ml)為核心的磁性納米粒溶液超聲分散于F-68溶液(Poloxamer 188，
0.1 %,w/v)中，探頭持續(xù)超聲30 min (600 w,工作2 s,間歇3 s)后,加入10 mg/ml的油酸乙醇溶液，探頭超聲5 min，以得到Fe3O4納米粒分散液。分別取單甘脂和硬脂胺-半乳糖嫁接物，并溶于一定量的無(wú)水乙醇中，水浴70°C加熱使其完全融解；在水浴70°C的超聲條件下，將脂質(zhì)的乙醇溶液快速注入到Fe3O4納米粒分散液中，持續(xù)超聲5 min后,最終得到肝雙靶向脂質(zhì)磁性納米粒。參見圖1。
[0024]取脂質(zhì)磁性納米粒溶液適量，用一定量的去離子水進(jìn)行稀釋，用3000 HS粒度及表面電位分析儀分別測(cè)定納米粒的粒徑、表面電位及多分散指數(shù)。
[0025]將一定濃度的脂質(zhì)磁性納米粒樣品滴于覆蓋有碳膜的銅網(wǎng)(300目)上，用濾紙吸去多余的液體后，用2 % (w/v)磷鎢酸進(jìn)行染色I(xiàn) min，干燥后透射電鏡觀察其形態(tài)及粒徑大小。
[0026]經(jīng)測(cè)定，脂質(zhì)磁性納米粒的粒徑、多分散指數(shù)及表面電位見表I。
[0027]參見圖4，結(jié)果顯示，脂質(zhì)磁性納米粒具有較好的粒徑分布，外觀呈球形或橢圓形，大小近乎均勻一致，其內(nèi)可見包裹的黑色Fe3O4納米顆粒。
表1:脂質(zhì)磁性納米粒的粒徑、多分散指數(shù)及表面電位_
[0028]樣品__多分散指數(shù)(PI)粒徑(nm) Zeta電位(mV)
脂質(zhì)磁性納米粒 I 0.24±0.0353.47士3.39 -30.68±?.Ι0
2、脂質(zhì)磁性納米粒細(xì)胞毒性研究本研究采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT Assay)對(duì)制備的脂質(zhì)磁性納米粒的細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，用含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為5 X 14個(gè)/ml，然后接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔0.2ml, 37°C, 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，待細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng)后，加入不同濃度的脂質(zhì)磁性納米粒溶液，以未處理的空白細(xì)胞為對(duì)照，每孔設(shè)3個(gè)平行組。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μ?的MTT溶液(濃度為5.0 mg/ml),于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，棄去上清液，每孔加入100 μ? 二甲基亞砜，恒溫振蕩20 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。
[0029]參見圖5，結(jié)果顯示，在L02細(xì)胞培養(yǎng)液中各加入不同F(xiàn)e3O4含量(最大濃度100 μδ/ml)的脂質(zhì)磁性納米粒并孵育48 h后，L02細(xì)胞的存活率都高于80%，結(jié)果表明本研究所制備的脂質(zhì)磁性納米粒具有低毒性，其應(yīng)用將得益于對(duì)臨床接受磁共振造影檢查患者的安全性。
[0030]3、脂質(zhì)磁性納米粒細(xì)胞攝取
取適量的異硫氰基熒光素(FITC)溶解于10 ml的無(wú)水乙醇中，加入一定量的硬脂胺-半乳糖嫁接物，室溫下避光攪拌反應(yīng)24 h。然后加入100 ml的去離子水，析出物用布氏漏斗過(guò)濾，室溫下自然干燥，以獲得異硫氰基熒光素標(biāo)記的嫁接物粉末，避光保存?zhèn)溆谩?br> [0031]將一定量油溶性的Fe3O4 (粒徑為5 nm，濃度為5 mg/ml)為核心的磁性納米粒溶液超聲分散于F-68溶液(Poloxamer 188,0.1 %，w/v)中,探頭持續(xù)超聲30 min (600 w, X作2 S，間歇3 s)后,加入10 mg/ml的油酸乙醇溶液,探頭超聲5 min,以得到Fe3O4納米粒分散液。分別取單甘脂和異硫氰基熒光素標(biāo)記的嫁接物，并溶于一定量的無(wú)水乙醇中，水浴70°C加熱使其完全融解；在水浴70°C的超聲條件下，將脂質(zhì)的乙醇溶液快速注入到Fe3O4納米粒分散液中，持續(xù)超聲5 min后，最終得到硫氰基熒光素標(biāo)記的脂質(zhì)磁性納米粒溶液。
[0032]以人正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞為模型細(xì)胞，在37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞至呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，離心收集，按每孔I X 15個(gè)細(xì)胞的密度接種24孔培養(yǎng)板，孵箱內(nèi)預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)。在培養(yǎng)液中加入異硫氰基熒光素標(biāo)記的脂質(zhì)磁性納米粒溶液孵育。培養(yǎng)一定時(shí)間后，用激光共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果顯示，脂質(zhì)磁性納米粒能快速被細(xì)胞所攝取。圖6為脂質(zhì)磁性納米粒與L02細(xì)胞共孵育后的熒光顯微鏡照片。由圖6可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，所觀察到的綠色熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，L02細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)磁性納米粒的攝取逐漸增多，即脂質(zhì)磁性納米粒在L02細(xì)胞系上的攝取具有時(shí)間依賴性。
[0033]實(shí)施例三:脂質(zhì)磁性納米粒樣品磁共振掃描
通過(guò)測(cè)定磁共振掃描的T2*弛豫時(shí)間的變化來(lái)衡量脂質(zhì)磁性納米粒的磁敏感性。將制備好的不同濃度(0、1、10、15、25、50、100 μδ/πι1)的脂質(zhì)磁性納米粒懸液分別裝入2.0 ml的Eppendorf管內(nèi)，放置在裝滿水的試管盒中，在GE 3.0T全身磁共振下用八通道頭線圈進(jìn)行掃描。
[0034]參見圖7，結(jié)果顯示，在ESWAN圖像上隨著脂質(zhì)磁性納米粒懸液中終鐵濃度的增力口，T2*信號(hào)強(qiáng)度逐漸減低，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所制備的脂質(zhì)磁性納米粒具有負(fù)性強(qiáng)化效果，即在一定濃度范圍之內(nèi)，脂質(zhì)磁性納米粒濃度越高，其負(fù)性強(qiáng)化效果越明顯。結(jié)果提示，本發(fā)明可作為磁共振對(duì)比劑具有應(yīng)用于體內(nèi)外成像的可行性。
[0035]無(wú)需進(jìn)一步詳細(xì)闡述，相信采用前面所公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用本發(fā)明。因此，前面的實(shí)施方案應(yīng)理解為僅是舉例說(shuō)明，而并非以任何方式限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。所以本發(fā)明的主要范圍將由附屬的權(quán)利要求及其等同體來(lái)確定。
【權(quán)利要求】
1.一種雙重祀向固體脂質(zhì)磁性納米粒，其特征在于，該磁性納米粒由94%F-68溶液、0.4%硬脂胺-半乳糖嫁接物、3.6%單甘脂、1%四氧化三鐵及1%油酸乙醇組成。
2.權(quán)利要求1所述的一種雙重靶向固體脂質(zhì)磁性納米粒的制備方法，其特征在于，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn): (1)硬脂胺-半乳糖嫁接物的合成 取市售硬脂胺、乳糖酸和碳二亞胺，溶于無(wú)水乙醇中，在室溫下攪拌反應(yīng)72 h后，加水沉淀產(chǎn)物，離心分離后所得沉淀經(jīng)干燥后，得硬脂胺-半乳糖嫁接物，其結(jié)構(gòu)通過(guò)紅外光譜和氫譜核磁共振進(jìn)行確證； (2)肝雙重靶向脂質(zhì)磁性納米粒的制備 將油溶性的粒徑為5 nm，濃度為5 mg/ml的Fe3O4為核心的磁性納米粒溶液超聲分散于F-68溶液中，探頭持續(xù)超聲30 min,加入10 mg/ml的油酸乙醇溶液,探頭超聲5 min,以得到Fe3O4納米粒分散液，分別取單甘脂和硬脂胺-半乳糖嫁接物，并溶于無(wú)水乙醇中，水浴70°C加熱使其完全融解，在水浴70°C的超聲條件下，將脂質(zhì)的乙醇溶液快速注入到Fe3O4納米粒分散液中，持續(xù)超聲5 min后,最終得到肝雙祀向脂質(zhì)磁性納米粒。
3.權(quán)利要求1所述的固體脂質(zhì)磁性納米粒在制備對(duì)肝臟具有雙重靶向功能的磁共振對(duì)比劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K49/18GK104174038SQ201410353518
【公開日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2014年7月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月24日
【發(fā)明者】余日勝, 朱修良, 杜永忠, 揭麗勇, 陳英, 施丹, 王穎 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)