siRNA分子組合物及其在治療病理性瘢痕中的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及siRNA分子組合物及其在治療增生性瘢痕、瘢痕疙瘩中的用途。所述的siRNA分子組合物包含：序列為5′-CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU-3′的siRNA分子和5’-GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU-3’的siRNA分子。本發(fā)明證實上述siRNA分子組合物可以促進體外的增生性瘢痕、瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡，還對動物模型中的增生性瘢痕具有良好的治療效果。
【專利說明】S i RNA分子組合物及其在治療病理性瘢痕中的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和基因治療【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，是siRNA分子在治療增生性瘢痕、瘢痕疙瘩中的用途。

【背景技術(shù)】
[0002]皮膚是人體最大器官，具備防護、免疫、排泄等功能，其中最為重要的功能是防護、維持體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。當(dāng)皮膚的完整性受到較大破壞時，體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)出現(xiàn)不平衡，外界侵襲因子容易進入體內(nèi)，直接威脅到個體的生存。在物種進化的過程中，出現(xiàn)了創(chuàng)口的瘢痕愈合模式,這種愈合方式能最快地恢復(fù)皮膚的完整性,大大提高了物種的生存機率。因此,瘢痕是人體皮膚創(chuàng)口愈合不可或缺的產(chǎn)物。
[0003]但在創(chuàng)口愈合的過程中常常發(fā)生瘢痕的過度生長、異常增殖，形成病理性瘢痕，包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。這些瘢痕通常伴有痛癢癥狀，影響患者的功能和外觀。據(jù)文獻報道，40%-70%的外科手術(shù)術(shù)后患者以及91%的燒傷患者愈合后形成增生性瘢痕，整形外科門診通常有超過半數(shù)的患者因瘢痕就診。瘢痕疙瘩臨床表現(xiàn)為“蟹足樣”浸潤性生長，超出原損范圍。亞洲人種，尤其是中國人群，是瘢痕疙瘩的高發(fā)人群。目前對于增生性瘢痕、瘢痕疙瘩的治療方法包括手術(shù)方法和非手術(shù)方法，但都存在一定的局限性。如何改善、治療病理性瘢痕，一直是整形外科醫(yī)生關(guān)注的課題，同時也是大眾關(guān)心的問題。
[0004]增生性瘢痕病因主要包括創(chuàng)口張力過大、感染等。增生性瘢痕形成的機制包括成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化、成纖維細胞的增殖、過度血管化、細胞膠原分泌增加以及細胞外基質(zhì)過度堆積。在增生性瘢痕形成的機制研究中，對TGF-β (轉(zhuǎn)化生長因子-β)的研究最多。在TGF-β的三個亞型中，TGF-β I與增生性瘢痕的形成關(guān)系最為密切，TGF-β I參與了成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，并促進細胞分泌膠原和組織血管化。已有諸多的實驗報道，抑制TGF-β I的表達可以減輕增生性瘢痕。C0X-2 (環(huán)氧合酶-2)是PGE (前列腺素Ε)的前體酶，PGE是炎癥反應(yīng)的重要因子，對血管新生有促進作用。同時TGF-βΙ和C0X-2對于創(chuàng)口愈合過程當(dāng)中的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換都有一定的促進作用。目前關(guān)于C0X-2在治療增生性瘢痕中的研究較少，關(guān)于TGF-β I和C0X-2之間的作用也鮮有報道。
[0005]瘢痕疙瘩的主要病理表現(xiàn)是組織內(nèi)成纖維細胞異常增殖，細胞基質(zhì)大量沉積的一種皮膚纖維化疾病。瘢痕疙瘩具有侵襲性行為，因此也被視為一種皮膚的良性腫瘤。瘢痕疙瘩的形成機制研究中，TGF-β 1-smad通路是最主要的促進細胞外基質(zhì)沉積的通路。瘢痕疙瘩組織纖維化的形成機制復(fù)雜，已有諸多的研究，其中有文獻報道，瘢痕疙瘩組織中存在EMT (上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化)現(xiàn)象。TGF-β I和C0X-2均為EMT的重要通路。在肺纖維化、腎臟纖維化疾病研究中，C0X-2誘導(dǎo)上皮細胞發(fā)生ΕΜΤ，被認為是促進組織纖維化的重要因子。此夕卜，在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，C0X-2誘導(dǎo)EMT現(xiàn)象，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移。由此，TGF- β I和C0X-2與瘢痕疙瘩的形成具有一定的相關(guān)性。目前尚未見抑制TGF-β I和C0X-2治療瘢痕疙瘩報道。
[0006]中國專利文獻CN201010260249.8，申請日2010.08.24，發(fā)明名稱為“促進皮膚傷口無疤痕愈合的siRNA及應(yīng)用”，公開了促進皮膚傷口無疤痕愈合的siRNA分子、靶向多個傷口無疤痕愈合相關(guān)基因的多個siRNA分子的雞尾酒組合、以siRNA分子或者其雞尾酒組合作為有效成分的藥物組合物，通過細胞實驗以及小鼠和豬皮膚創(chuàng)傷模型證明了該藥物組合物可以促進因外傷、外科手術(shù)或糖尿病皮膚潰瘍等造成的皮膚傷口達到無疤痕愈合，其中siRNA分子可以靶向那些造成傷口病理性修復(fù)或不良反應(yīng)的基因，siRNA雙鏈有不同的長度和不同的末端，可以靶向人、小鼠及豬細胞同一基因的同源序列，雞尾酒組合中的多個siRNA能同時抑制傷口炎癥和血管再生的各種相關(guān)基因，藥效更顯著，藥物組合物中組氨酸-賴氨酸聚合物、樹枝狀聚合物或脂質(zhì)體等藥物載體能以納米顆粒的形式增強siRNA導(dǎo)入皮膚組織。但是該文獻公開的是將siRNA應(yīng)用于創(chuàng)口在愈合過程中促進愈合并減少疤痕形成，創(chuàng)口治療和已形成的瘢痕治療是完全不同的兩個概念，涉及不同的生理過程，而目前關(guān)于用siRNA來治療已形成的增生性瘢痕、瘢痕疙瘩還未見報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種siRNA分子組合物。
[0008]本發(fā)明另一的目的是，提供上述SiRNA分子組合物的用途以及給藥途徑。
[0009]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
siRNA分子組合物，所述的siRNA分子組合物包含:序列為 5 ' -CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU-3 ' 的 siRNA 分子和序列為5' -GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU-3，的 siRNA 分子。
[0010]優(yōu)選地，所述的siRNA分子組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。[0011 ] 優(yōu)選地，所述的藥學(xué)上可接受的載體選自組氨酸和賴氨酸的聚合物。
[0012]所述的siRNA分子組合物治療增生性瘢痕、瘢痕疙瘩的給藥途徑包括局部組織注射和局部涂抹結(jié)合微針芽刺。
[0013]為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
如上所述的siRNA分子組合物在制備治療增生性瘢痕、瘢痕疙瘩的藥物中的用途。
[0014]所述的治療增生性瘢痕是指治療已形成的增生性瘢痕，優(yōu)選地，所述的治療增生性瘢痕、瘢痕疙瘩是指消退已形成的增生性瘢痕或減小已形成的增生性瘢痕、瘢痕疙瘩的體積。
[0015]如上所述的siRNA分子組合物在制備誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細胞或瘢痕疙瘩成纖維細胞調(diào)亡的藥物中的用途。
[0016]本文中，所述的“增生性瘢痕”和“瘢痕疙瘩”是指創(chuàng)口愈合的過程中、感染過程中或其他病理過程中發(fā)生的瘢痕的過度生長，其機制包括成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化、成纖維細胞的增殖、過度血管化、細胞膠原分泌增加以及細胞外基質(zhì)過度堆積。只要與上述機制相同的病理過程，均納入本發(fā)明所述的“增生性瘢痕”、“瘢痕疙瘩”的范疇。
[0017]本發(fā)明優(yōu)點在于:
本發(fā)明應(yīng)用TGF- β I和C0X-2聯(lián)合siRNA方法，對體外的增生性瘢痕、瘢痕疙瘩成纖維細胞進行TGF-β I和C0X-2表達的敲低，可以達到促進成纖維細胞凋亡的效果；此外，在動物模型中，證實TGF- β I和C0X-2聯(lián)合siRNA對增生性瘢痕的消退具有良好的治療效果；局部組織注射和局部涂抹結(jié)合微針穿刺，是可靠的TGF-β I和C0X-2聯(lián)合siRNA在體給藥途徑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是體外實驗中瘢痕成纖維細胞的鏡下形態(tài)。
[0019]圖2是體外實驗基因沉默效應(yīng)檢測中目的基因TGF- β 1、C0X-2mRMA表達情況。
[0020]圖3是體外實驗基因沉默效應(yīng)檢測中相關(guān)目的基因a -SM, Col Ial、Col3almRMA表達情況。
[0021]圖4是體外實驗a -SMA免疫熒光染色結(jié)果。
[0022]圖5是體外實驗Annexin V/PI流式細胞凋亡檢測結(jié)果。
[0023]圖6體外實驗細胞上清羥脯氨酸含量檢測結(jié)果。
[0024]圖7是是體內(nèi)實驗局部組織注射給藥后siRNA分子熒光檢測結(jié)果。
[0025]圖8是體內(nèi)外用涂抹結(jié)合微針穿刺給藥后siRNA分子熒光檢測結(jié)果。
[0026]圖9是體內(nèi)實驗瘢痕動物模型的瘢痕組織塊大體形態(tài)結(jié)果。
[0027]圖10是體內(nèi)實驗瘢痕動物模型的瘢痕組織塊體積測量結(jié)果。
[0028]圖11是體內(nèi)實驗人增生性瘢痕組織塊植入模型的瘢痕組織中目的基因TGF- β 1、C0X-2、α-SMA、Collal 的表達情況。
[0029]圖12是體內(nèi)實驗瘢痕動物模型的瘢痕組織HE、Masson染色結(jié)果，α -SM,⑶31、VEGF免疫組化染色結(jié)果。
[0030]圖13是體內(nèi)實驗瘢痕動物模型的瘢痕組織內(nèi)羥脯氨酸含量檢測結(jié)果。
[0031]圖14是體內(nèi)實驗瘢痕動物模型的瘢痕組織內(nèi)成纖維細胞發(fā)生凋亡的檢測結(jié)果。
[0032]圖15是體內(nèi)實驗瘢痕動物模型的瘢痕組織內(nèi)成纖維細胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象與對照組比較的統(tǒng)計學(xué)結(jié)果。

【具體實施方式】
[0033]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0034]實施例1 I實驗材料
1.1 SiRNA有效成分
TGF-β I siRNA 分子:5' -CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU-3' (SEQ ID N0.1)；
COX-2 siRNA 分子:5’ -GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU-3，(SEQ ID N0.2)；
藥物載體:縮氨酸(ΗΚΡ)，組氨酸和賴氨酸的聚合物；
STP705 (siRNA雞尾酒):將上述TGF-β I siRNA分子、COX-2 siRNA分子和HKP形成納米顆粒，其中TGF-βΙ siRNA分子、COX-2 siRNA分子拷貝數(shù)比例為1:1，兩種siRNA分子與HKP的重量比為1:4。以上藥物由蘇州圣諾生物有限公司提供。
[0035]抗體
兔抗人 α _ 肌動蛋白(α _SMA, alpha smooth muscle Actin)單克隆抗體(ab5694,Abeam, 1wa，USA)，免疫組化染色一抗稀釋比例1:200，免疫熒光染色一抗稀釋比例1:100 ；兔抗人CD31單克隆抗體(ab38264，Abeam, 1wa, USA)，免疫組化染色一抗稀釋比例1:50 ；兔抗人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF, vascular endothelial growth factor)單克隆抗體(cat.#1909-1, Epitomics, California, USA),免疫組化染色一抗稀釋比例 1: 50。
[0036]用引物

【權(quán)利要求】
1.SiRNA分子組合物，其特征在于，所述的SiRNA分子組合物包含:序列為 5 ' -CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU-3 '的 siRNA 分子和序列為5' -GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU-3，的 siRNA 分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的siRNA分子組合物，其特征在于，所述的siRNA分子組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的siRNA分子組合物，其特征在于，所述的藥學(xué)上可接受的載體選自組氨酸和賴氨酸的聚合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的siRNA分子組合物，其特征在于，所述的siRNA分子組合物治療增生性瘢痕、瘢痕疙瘩的給藥途徑包括局部組織注射和局部涂抹結(jié)合微針穿刺。
5.權(quán)利要求1-3所述的siRNA分子組合物在制備治療增生性瘢痕、瘢痕疙瘩的藥物中的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述的治療增生性瘢痕、瘢痕疙瘩是指消退已形成的增生性瘢痕、瘢痕疙瘩或減小已形成的增生性瘢痕、瘢痕疙瘩的體積。
7.權(quán)利要求1-3所述的siRNA分子組合物在制備誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細胞或瘢痕疙瘩成纖維細胞調(diào)亡的藥物中的用途。
【文檔編號】A61P17/02GK104174032SQ201410381766
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月6日
【發(fā)明者】周佳, 劉凱, 黃曉璐, 李青峰 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院