S-腺苷甲硫氨酸(sam)和超氧化物歧化酶(sod)在制備用于治療阿爾茨海默病的藥物中的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和超氧化物歧化酶(SOD)組合在制備用于治療阿爾茨海默病的藥物中的用途。
【專利說(shuō)明】s-腺苷甲硫氨酸（SAM)和超氧化物歧化酶（SOD)在制備用 于治療阿爾茨海默病的藥物中的用途
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2009年2月25日的、發(fā)明名稱為"S-腺苷甲硫氨酸（SAM)和 超氧化物歧化酶（S0D)在制備用于治療阿爾茨海默病的藥物中的用途"的中國(guó)專利申請(qǐng) 200980106484. 5 (PCT/EP2009/001323)的分案申請(qǐng)。【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及S-腺苷甲硫氨酸（SAM)和超氧化物歧化酶（S0D)在制備用于治療阿 爾茨海默病的藥物中的用途。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 阿爾茨海默?。ˋD)是一種分布非常廣泛的神經(jīng)退行性癡呆形式，其影響著相當(dāng) 大比例的世界上年齡超過(guò)70歲的人群，其中男人與女人的比率為1:2。AD的發(fā)病率在不斷 上升中，原因是更為常見(jiàn)的非遺傳性AD形式開(kāi)始于約70-75歲，而預(yù)期壽命由于生活標(biāo)準(zhǔn) 的提高和醫(yī)學(xué)與藥理學(xué)的進(jìn)步而增加。該疾病還以與染色體14、19和21的某些基因座中的 突變相關(guān)的遺傳傳遞形式存在（一個(gè)典型是唐氏綜合征個(gè)體）。家族型AD的早發(fā)約在50 歲出現(xiàn)，并且引起腦變性，之后在2-3年中死亡。該疾病的晚發(fā)形式也引起腦變性和死亡， 但是在10年或更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)。
[0005] 腦在神經(jīng)元之間的間隙中存在大量斑塊，并在神經(jīng)元中（尤其是在大腦皮質(zhì)、海 馬和杏仁核的神經(jīng)元中）、以及在具有認(rèn)知功能的腦的其它部分中存在典型的神經(jīng)原纖維 纏結(jié)。淀粉樣蛋白斑塊，也稱為老年斑，是β_淀粉樣蛋白（Αβ)肽的聚合物，Αβ肽衍生自 較大的蛋白：β-淀粉樣蛋白前體蛋白（ΑΡΡ)。ΑΡΡ是高保守的跨膜糖蛋白超家族的成員。
[0006] 在最近十年中，從事AD研究的科學(xué)家為了了解其病因?qū)W（尤其是分子機(jī)理）已經(jīng) 進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)。對(duì)分子組分及其調(diào)節(jié)的研究可以闡明其治療和診斷前景。注意力已經(jīng)集中 于早老蛋白（presenilins)，其在ΑΡΡ加工中的作用以及因而在Αβ產(chǎn)生中的作用似乎具有 高度意義。已經(jīng)證明，這些蛋白，即早老蛋白1(PS1)和早老蛋白2(PS2)，呈現(xiàn)酶活性或調(diào) 節(jié)其它酶（即分泌酶）的活性，分泌酶將APP裂解成通?？山到獾拇x物（α -分泌酶）或 Α β肽（β -和γ -分泌酶）。在家族性AD中，編碼PS1和PS2的基因的突變導(dǎo)致Α β的過(guò) 量生成和特別是同種型Α β-42(其是高度促淀粉狀變的）的蓄積。最近，關(guān)于PS1敲除小 鼠的實(shí)驗(yàn)證實(shí)分泌酶活性大幅降低，說(shuō)明PS1，不僅屬于γ-分泌酶復(fù)合物，也主要負(fù)責(zé) Αβ的生成和蓄積。關(guān)于β-分泌酶，據(jù)認(rèn)為BACE基因的產(chǎn)物可單獨(dú)行使β-分泌酶斷裂 作用。
[0007] 臨床上有用的和分泌酶抑制劑的開(kāi)發(fā)可以成為對(duì)抗阿爾茨海默病的重要 武器，并且是當(dāng)前神經(jīng)科學(xué)中最令人興奮的挑戰(zhàn)之一。已經(jīng)清楚地證明，PS1的活性不能被 完全抑制，因?yàn)樾枰@種蛋白加工轉(zhuǎn)導(dǎo)因子Notch-Ι，一種對(duì)很多干細(xì)胞（如與紅細(xì)胞生成 有關(guān)的那些）的成熟而言重要的因子。
[0008] 可以在能夠表達(dá)與AD有關(guān)的基因的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中成功地研究DNA甲基化對(duì)基 因表達(dá)的調(diào)節(jié)。作為我們研究的結(jié)果，在與老化有關(guān)的調(diào)節(jié)機(jī)制方面已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)非常 有趣的跡象，即，老年人中DNA低甲基化的逐步整體增加以及在老年性癡呆患者中觀察到 的同型半胱氨酸蓄積。同型半胱氨酸蓄積和DNA低甲基化在代謝上相關(guān)，因?yàn)橥桶腚装?酸不能轉(zhuǎn)化成甲硫氨酸，使得代謝向著S-腺苷同型半胱氨酸的合成逆轉(zhuǎn)，已知s-腺苷同型 半胱氨酸是強(qiáng)DNA-甲基轉(zhuǎn)化酶抑制劑，并由此誘導(dǎo)DNA低甲基化。依照已經(jīng)成熟建立的理 論--很多基因在特定序列的胞嘧啶去甲基化時(shí)表達(dá)，這種生物化學(xué)方式可能導(dǎo)致未表達(dá) 的基因表達(dá)和正常表達(dá)的基因過(guò)表達(dá)。對(duì)于AD，這可能是事實(shí)，因?yàn)镻S1即γ -分泌酶的過(guò) 表達(dá)可以間斷地超過(guò)α-分泌酶活性，并由此產(chǎn)生Αβ肽，之后肽蓄積，并且可以在很多年 后引起該疾病。DNA甲基化在AD中的可能作用的再一跡象是發(fā)現(xiàn)：AD患者腦中存在低得多 的死后甲基供體水平。S-腺苷甲硫氨酸（SAM)的較低可得性可能容易地導(dǎo)致與ΑΡΡ代謝有 關(guān)的基因的表達(dá)改變或增加，從而最終導(dǎo)致Αβ肽在老年斑中的蓄積。
[0009] 已經(jīng)在表達(dá)APP、PSl、PS2、BACE、α-分泌酶、Y-分泌酶的其它組分以及Notchl的 成神經(jīng)細(xì)胞瘤系（SK-N-SH)上進(jìn)行了初步實(shí)驗(yàn)。用剝奪了葉酸、維生素 Β12和維生素 Β6的 培養(yǎng)基處理培養(yǎng)物（為了改變同型半胱氨酸的代謝），向培養(yǎng)基中加入不同濃度的SAM(以 平衡維生素剝奪的影響）。我們發(fā)現(xiàn)在剝奪了維生素 B的培養(yǎng)基中PS1和BACE表達(dá)增加， 并且在施用SAM后PS1和BACE表達(dá)顯著減少。在用Hpall/PCR對(duì)APP和PS1啟動(dòng)子進(jìn)行的 實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)PS1啟動(dòng)子的CpG位點(diǎn)之一的甲基化有顯著差異。我們得出結(jié)論，可以通 過(guò)施用外源性SAM使PS1基因部分沉默。SAM的施用可以減少PS1表達(dá)，恢復(fù)有利于α-分 泌酶的代謝平衡。還用TgCRNDS株轉(zhuǎn)基因小鼠和相應(yīng)對(duì)照進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)；這些小鼠的特征在 于存在人突變的APP基因，并因此可以在短時(shí)間內(nèi)形成淀粉樣蛋白斑塊。用完全飲食或缺 少B族維生素的飲食喂養(yǎng)這些動(dòng)物；再次，如在細(xì)胞中一樣，觀察到了 PS1和BACE表達(dá)的增 加。
[0010] 在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校虮磉_(dá)的改變具有增加和β-分泌酶活性以及由此過(guò) 度產(chǎn)生Αβ的作用，與用對(duì)照飲食處理的動(dòng)物相比，Αβ更快速地蓄積以形成老年斑。
[0011] 已經(jīng)在下述出版物中報(bào)告了上述數(shù)據(jù)：
[0012] Fuso A. , Nicolia V. , Cavallaro R. A. , Ricceri L. , D' Anselmi F. , Coluccia P.，Calamandrei G.和Scarpa S. 2008.在小鼠中B族維生素剝奪誘導(dǎo)高同型半胱氨酸 血癥和腦S-腺苷同型半胱氨酸、耗竭腦S-腺苷甲硫氨酸并且增加 PS1和BACE表達(dá)以 及淀粉樣蛋白 _β 沉積（B_Vitamin Deprivation Induces Hyperhomocysteinemia and Brain S-adenosylhomocsyteine, Depletes Brain S-adenosylmethionine, and Enhances PS1 and BACE Expression and Amyloid-β Deposition in Mice). Mice. Mol. Cell. Neurosci. 37 :731_746〇
[0013] Fuso A. , Cavallaro R. A. , Zampelli A. , D' Anselmi F. , Piscopo P. , Confaloni A.和Scarpa S. 2007.在成神經(jīng)細(xì)胞瘤和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中通過(guò)同型半胱氨酸循環(huán) 的改變而差異地調(diào)節(jié) 分泌酶（Y_secretase is differe ntially modulated by alterations of Homocysteine cycle in neuroblastoma and glioblastoma cells). J.Alz.Dis. 11 :275-290。
[0014] Cavallaro R. A.，F(xiàn)uso A.，D，Anselmi F.和 Scarpa S. 2006.通過(guò) cDNA 微陣列 分析研究S_腺苷甲硫氨酸對(duì)CNS基因表達(dá)的影響（The effectof S-adenosylmethyonine on CNS gene expression studied by cDNA mycroarrays analysis). J. Alz. Disease. 9 ： 415-419。
[0015] Scarpa S.，Cavallaro R. A.，D' Anselmi F.和 Fuso A. 2006.通過(guò)甲基化使 基因沉默：對(duì)阿爾茨海默病的外遺傳干預(yù)（Gene silencing through methylation:an epigenetic intervention on Alzheimer Disease) · J. Alz. Disease. 9 :407_414〇
[0016] Fuso A.，Seminara L.，Cavallaro R. A. , D，Anselmi F.和 Scarpa S. 2004.同 型半胱氨酸/S-腺苷甲硫氨酸循環(huán)的改變使DNA甲基化狀態(tài)失衡，隨后上調(diào)β-淀粉樣 蛋白產(chǎn)生（Homocysteine/S-adenosylmethionine Cycle Alterations Unbalance DNA Methylation Status with Consequent Up-regulation of Beta-amyloid Production). Mol. Cell. Neurosci. 28(1) ：195-204〇
[0017] Scarpa S.，F(xiàn)uso A.，D，Anselmi F.，Cavallaro R. A. 2003. S_ 腺苷甲硫氨酸使早 老蛋白1基因沉默：對(duì)阿爾茨海默病的治療？（S-adenosylmethionine :a treatment for Alzheimer disease ? )FEBS Letters 541 (1-3):145-148。
[0018] Fuso A.，Cavallaro R. A. , OrriiL· , Buttarelli F. R.和 Scarpa S. 2001.在肌肉 分化中通過(guò)S_腺苷甲硫氨酸使基因沉默（Gene silencing by S-adenosylmethionine in muscle differentiation) .FEBS Letters 508(3) :337_340。
[0019] US 2002/025926和US 2004/0048827中也提出SAM治療AD的用途。后一文獻(xiàn)證 明SAM干擾β-分泌酶、早老蛋白1和2以及β-淀粉樣蛋白前體基因表達(dá)的能力。如下 報(bào)告，在所述專利申請(qǐng)后用標(biāo)記的（氚化的）SAMe進(jìn)行的研究證明該分子具有在口服施用 后到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的能力。
[0020] 在US 5519058和CN 1099224中提出了 S0D在治療AD中的有益作用。
[0021] 在US 2003/129261和W0 2005/041996中公開(kāi)了包含SAM和S0D以及數(shù)種活性成 分的藥物組合物，用于除AD之外的病癥。
[0022] 發(fā)明概述
[0023] 現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)S-腺苷甲硫氨酸與超氧化物歧化酶（S0D)組合施用時(shí)，其活性 可以令人驚訝地得到提高。這種酶不僅被證明能夠促進(jìn)S-腺苷甲硫氨酸通過(guò)血腦屏障，而 且能與SAM協(xié)同地相互作用以減少由于維生素 B缺乏而引起過(guò)表達(dá)的PS1和BACE基因的 表達(dá)。
[0024] 因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及包含S-腺苷甲硫氨酸或其衍生物和超氧化物歧化 酶的產(chǎn)品，該產(chǎn)品為用于在阿爾茨海默病治療中同時(shí)、分開(kāi)或相繼施用的組合制劑的形式。
[0025] 由于SAM和S0D的毒性極低，所以劑量可在較大范圍內(nèi)變化，并且將取決于多種因 素，例如患者的體重、性別和年齡。但是，一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于SAM，劑量可為200至2000mg/天， 對(duì)于S0D則可為50至lOOOrng/天。
[0026] SAM可以就此或以其穩(wěn)定鹽的形式（例如甲苯磺酸鹽、丁烷二磺酸鹽、甲苯磺酸二 硫酸鹽、二甲苯磺酸二硫酸鹽或單甲苯磺酸二硫酸鹽）施用，優(yōu)選口服施用。一種有利的施 用形式是在W0 2006/131382中描述的富含SAM的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) 細(xì)胞。
[0027] 通過(guò)發(fā)酵自釀酒酵母菌株獲得（如 申請(qǐng)人:提交的W0 2006/131382中描述）的 S0D，也可以支撐在麥醇溶蛋白薄膜上或者使用其它胃保護(hù)技術(shù)而口服施用。作為口服途徑 的替代，可以胃腸外施用，例如通過(guò)肌內(nèi)注射，SAM和S0D。
[0028] 這些制劑的實(shí)例包括用丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物薄膜包衣的片劑、腸溶膠囊 (gastroresistant capsules)、微囊等。
[0029] SAM和SOD可以存在于同一劑量單位中或分開(kāi)配制和施用：在此情況下，可以提供 以分開(kāi)的劑型包含兩種藥物以及包含有關(guān)其相繼、同時(shí)或分開(kāi)使用的說(shuō)明書(shū)的試劑盒。
[0030] 附圖概述
[0031] 圖la和lb顯示SAM和S0D在小鼠中對(duì)由剝奪了維生素 B的飲食誘導(dǎo)的PS1和 BACE過(guò)表達(dá)的影響。
[0032] 圖2顯示在SK-N-BE系成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞中S0D和谷胱甘肽（GSH)，單獨(dú)和與SAM 組合，對(duì)PS 1和BACE過(guò)表達(dá)的影響。
[0033] 圖3顯示口服施用SAM 400 μ g/天后在小鼠腦中氚標(biāo)記的SAM的水平。
[0034] 圖4顯示在處理一周后對(duì)人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞中淀粉樣蛋白-β產(chǎn)生的測(cè)量。
[0035] 圖5顯示SAM和S0D對(duì)用維生素 Β剝奪飲食處理的小鼠的紅細(xì)胞和腦中氧化狀態(tài) 的影響。
[0036] 現(xiàn)在借助于下述舉例說(shuō)明性藥理學(xué)試驗(yàn)更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
[0037] 實(shí)施例1 -基因表達(dá)
[0038] 具體來(lái)說(shuō)，測(cè)試藥理學(xué)濃度（400 μ g/天）的SAM對(duì)TgCRND8小鼠和相應(yīng)的野生型 對(duì)照的作用。
[0039] 基因表達(dá)通道
[0040] 從細(xì)胞培養(yǎng)物和均漿的腦中提取RNA，并合成CDNA。0. 5 μ g總CDNA用于每個(gè)實(shí)時(shí) 反應(yīng)，使用SYBR-Green試劑在0pticon2 DNA Engine (MJ Research)上進(jìn)行。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)線 性擴(kuò)增曲線，先前已經(jīng)確定了每對(duì)引物的擴(kuò)增效率。將實(shí)驗(yàn)樣品與特定基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線比 較來(lái)確定存在于標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中的特定cDNA的量。標(biāo)準(zhǔn)獲自通過(guò)陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增的高度純化的 PCR產(chǎn)物。將總cDNA水平相對(duì)于β-肌動(dòng)蛋白對(duì)照（管家基因）標(biāo)準(zhǔn)化。
[0041] 結(jié)果表明，SAM也可以體內(nèi)逆轉(zhuǎn)由剝奪性飲食誘導(dǎo)的PS1和BACE過(guò)表達(dá)（圖1)， 并且甚至可以使其減至比對(duì)照飲食還低的水平。
[0042] 由于同型半胱氨酸代謝與甲基化和氧化還原反應(yīng)兩者均有關(guān)，所以我們測(cè)試了 各種抗氧化劑對(duì)兩種基因表達(dá)的影響。用SK-N-BE系成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞獲得的第一數(shù)據(jù) 表明，S0D和谷胱甘肽（GSH)兩者均抑制由維生素剝奪誘導(dǎo)的PS1和BACE過(guò)表達(dá)，盡管 比SAM的抑制程度低。但是，有趣的是注意到，當(dāng)一起施用S0D和SAM時(shí)，它們呈現(xiàn)協(xié)同效 應(yīng)（圖2)，其進(jìn)一步使兩種基因的表達(dá)減至比單獨(dú)用SAM觀察到的水平更低的水平（低 15-20% ) 〇
[0043] 實(shí)施例2 - SAM攝取
[0044] 在細(xì)胞和小鼠上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以證明SAM跨過(guò)血腦屏障。
[0045] 對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)物，將100 μ M SAM加至F14細(xì)胞培養(yǎng)基（根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，完全培養(yǎng) 基或剝奪維生素 B的培養(yǎng)基）中，在96小時(shí)后終止培養(yǎng)。
[0046] 對(duì)于小鼠，通過(guò)飼喂探測(cè)針（probe needle)而口服施用400 μ g/天的SAM，并在2 個(gè)月后處死動(dòng)物；根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，用完全飲食或剝奪了維生素 B的飲食喂養(yǎng)動(dòng)物。通過(guò)具有 Varian HPLC系統(tǒng)的HPLC來(lái)分析SAM水平。將細(xì)胞和勻漿的腦在蒸餾水中裂解，并用1.5M PCA沉淀大分子。在實(shí)驗(yàn)樣品之前和之后計(jì)算了標(biāo)準(zhǔn)SAM曲線。對(duì)于氚標(biāo)記的SAM的分析， 如上所述處理細(xì)胞，但是處理小鼠4天以使放射性藥物暴露最小化。將細(xì)胞和勻漿的腦在 蒸餾水中裂解。對(duì)裂解的腦的一部分進(jìn)行超聲處理，并進(jìn)行離心以分離膜和細(xì)胞器；另一部 分在超聲處理后用高氯酸（PCA)處理，從而分離大分子。用β計(jì)數(shù)器通過(guò)閃爍法來(lái)測(cè)量放 射性SAM的攝取。
[0047] 發(fā)現(xiàn)SAM的胞內(nèi)水平由1 μ Μ(對(duì)照）增至2. 5-3 μ M。為了確定這種增長(zhǎng)是否是由 于外源性SAM的攝取引起的而不是在該分子的升高胞外濃度存在下內(nèi)源儲(chǔ)備物的增加，用 放射性SAM進(jìn)行了試驗(yàn)。將100 μ Μ氚標(biāo)記的SAM (SAM [3H])加至SK-N-BE細(xì)胞培養(yǎng)物中， 通過(guò)細(xì)胞裂解物和放射性計(jì)數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)攝取。在細(xì)胞裂解物中得到1. 5 μ Μ的SAM放射性計(jì) 數(shù)；此值相當(dāng)于使用非氚標(biāo)記的SAM得到的值的1至2. 5倍增加，清楚地表明該胞內(nèi)增長(zhǎng)是 由于外源性SAM的攝取引起的。
[0048] 在用400 μ g/天SAM 口服處理的小鼠的腦裂解物中發(fā)現(xiàn)了 SAM水平的類似增長(zhǎng)； 再次，用400和800 μ g/天濃度的SAM[3H]進(jìn)行了另外的試驗(yàn)。在用400 μ g SAM處理的小 鼠中，總腦裂解物中增長(zhǎng)的放射性相當(dāng)于〇. 5ngSAM/腦，而在用800 μ g SAM處理的小鼠中 為 lng SAM/ 腦（圖 3)。
[0049] 也對(duì)總腦裂解物的一部分進(jìn)行超聲處理，并離心獲得澄清裂解物（細(xì)胞質(zhì)），該澄 清裂解物的再一部分用高氯酸（PCA)沉淀以除去蛋白質(zhì)（可溶性裂解物）。有趣的是注意 至IJ，得自用800 μ g SAM處理的小鼠的可溶裂解物顯示相當(dāng)于0. 5ng SAM的放射性水平（而 總裂解物和澄清裂解物呈現(xiàn)更高的水平），說(shuō)明鍵合外源性SAM的過(guò)量甲基官能團(tuán)與其它 細(xì)胞分子綴合。
[0050] 實(shí)施例3 -成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的淀粉樣蛋白產(chǎn)生
[0051] 方法：培養(yǎng)基和細(xì)胞培養(yǎng)物
[0052] 將成神經(jīng)細(xì)胞瘤SK-N-BE人細(xì)胞系維持在具有10% FCS的F14培養(yǎng)基中，并轉(zhuǎn)移 至完全分化培養(yǎng)基（對(duì)照培養(yǎng)基，具有1 % FCS+10 μ Μ視黃酸）或轉(zhuǎn)移至缺少葉酸、維生素 Β12和維生素 Β6的分化培養(yǎng)基（Β缺乏）。每隔一天對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行再喂養(yǎng)，并96天后終止。
[0053] 動(dòng)物和飲食
[0054] 在約3周齡時(shí)，將小鼠有系統(tǒng)地分配至對(duì)照飲食組或不足飲食組，隨意獲取食物 和水。對(duì)照（ΑΙΝ-93Μ ;飲食A :葉酸mg 1. 98 ;維生素 Β12 mgO. 025 ;維生素 Β6 mg 7)和實(shí)驗(yàn) 飲食（AIN-93M B ;飲食B，缺少葉酸、維生素 B12和維生素 B6)購(gòu)自Mucedola(意大利）。兩種 飲食均含有1 %磺胺噻唑以便借助于腸細(xì)菌抑制葉酸生成，并確保唯一的葉酸來(lái)源是飲食。 而且，其它三個(gè)動(dòng)物組接受SAM (800 μ g/天）或SOD (10U/天）或兩種藥物（SAM400 μ g/天 和SOD 5U/天）的組合。處理一周后，將小鼠麻醉并處死，得到腦和血液。通過(guò)心穿刺將血 液收集于含有EDTA 2g/dl的試管中，并立即離心，分離出血漿和紅細(xì)胞，然后貯存于-80°C 下。用PBS灌注腦，然后移出。
[0055] 淀粉樣蛋白分析
[0056] 用 50mM TRIS-HC1 pH 7.4、150mM NaCl、0. 2 % Nonidet P-40、l % CHAPS, 2mM EDTA、PMSF(200 μ M)、亮抑酶肽（1 μ M)、抑胃酶肽A(1 μ M)和鈣蛋白酶抑制劑 1(5 μ M)對(duì)勻漿的腦進(jìn)行裂解。蛋白質(zhì)提取物使用Α β 1-42免疫測(cè)定試劑盒（BioSource International, Belgium)用于 ELISA 試驗(yàn)；ELISA 試劑盒保證在 10pg/mL(1-42)之前的良 好線性靈敏性。所有測(cè)量均進(jìn)行一式三次。
[0057] 統(tǒng)計(jì)分析
[0058] 計(jì)算單向AN0VA，并使用Bonferroni事后檢驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)所報(bào)告的任何顯著性差異 (p〈0. 05)。
[0059] 結(jié)果
[0060] 從圖4中所報(bào)告的數(shù)據(jù)，SAM與SOD之間的協(xié)同作用是顯而易見(jiàn)的，并被下文報(bào)告 的統(tǒng)計(jì)分析所確證（總是參考圖4)。
[0061] B def.相對(duì)于 Ctrl :ρ〈0· 001
[0062] B def.+SAM 和 B def.+SOD 相對(duì)于 B def. :ρ〈0·001
[0063] B def.+SAM+SOD 相對(duì)于 B def. :ρ〈0·001
[0064] B def. +SAM+S0D 相對(duì)于 B def. +SAM 和 B def. +S0D :p〈0. 001。
【權(quán)利要求】
1. s-腺苷甲硫氨酸（SAM)和超氧化物歧化酶（SOD)組合在制備用于治療阿爾茨海默病 的藥物中的用途。
2. 如權(quán)利要求1所要求的用途，其中所述藥物抑制PS1和BACE的過(guò)表達(dá)。
3. 如權(quán)利要求1或2所要求的用途，其中所述藥物是口服施用的。
4. 如權(quán)利要求1的用途，其中所述藥物為產(chǎn)品，其以用于在阿爾茨海默病治療中同時(shí)、 分開(kāi)或相繼施用的組合制劑的形式包含（i)S-腺苷甲硫氨酸和（ii)超氧化物歧化酶作為 唯一的活性成分。
5. 如權(quán)利要求4所要求的用途，其中S-腺苷甲硫氨酸為甲苯磺酸鹽、丁烷二磺酸鹽、 甲苯磺酸二硫酸鹽、二甲苯磺酸二硫酸鹽或單甲苯磺酸二硫酸鹽的形式，或包含于富含SAM 的釀酒酵母細(xì)胞中。
6. 權(quán)利要求1的用途，其中SAM以200至2000mg/天的劑量施用，SOD以50至lOOOmg/ 天的劑量施用。
7. 產(chǎn)品，包含（i)S-腺苷甲硫氨酸或其衍生物和（ii)超氧化物歧化酶作為唯一的活性 成分，所述產(chǎn)品為用于在阿爾茨海默病治療中同時(shí)、分開(kāi)或相繼施用的組合制劑的形式。
8. 如權(quán)利要求7所要求的產(chǎn)品，其中SAM為甲苯磺酸鹽、丁烷二磺酸鹽、甲苯磺酸二硫 酸鹽、二甲苯磺酸二硫酸鹽或單甲苯磺酸二硫酸鹽的形式，或包含于富含SAM的釀酒酵母 細(xì)胞中。
【文檔編號(hào)】A61P25/28GK104189895SQ201410384204
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2009年2月25日 優(yōu)先權(quán)日:2008年2月29日
【發(fā)明者】S·斯卡爾帕, A·富索, R·達(dá)米亞尼, M·羅西尼 申請(qǐng)人:諾西斯有限公司