一種治療2型糖尿病的基因工程干細胞的制作方法
【專利摘要】一種基因工程干細胞，它是選用betatrophin基因cDNA質(zhì)粒，應用腺相關病毒AAV6載體攜帶，轉(zhuǎn)導入間充質(zhì)干細胞，使之過表達betatrophin分子，即為betatrophin基因工程干細胞，可靜脈輸入人體，用于治療2型糖尿病，既調(diào)控刺激內(nèi)源胰島?細胞增殖，恢復衰竭的?細胞功能，還發(fā)揮干細胞的旁/自分泌的免疫調(diào)節(jié)及改善胰島素抵抗作用，根本改善2型糖尿病患者的預后。
【專利說明】—種治療2型糖尿病的基因工程干細胞

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)用生物材料及其制備方法，特別涉及用于治療2型糖尿病的基因工程干細胞及其制備方法。

【背景技術】
[0002]糖尿病是嚴重危害人類健康的疾病，在糖尿病患者中90-95%是2型糖尿病。2型糖尿病的發(fā)病機制是由于胰島β細胞對胰島素抵抗的長期代償，導致β細胞功能毀損，β細胞去分化、凋亡與丟失，以至最終不可逆的胰島β細胞功能衰竭及細胞數(shù)量銳減。重建內(nèi)源功能胰島β細胞是治愈糖尿病的唯一途徑。
[0003]近年來細胞生物學研究的一個重要發(fā)現(xiàn)是，新的β細胞產(chǎn)生都是來自于內(nèi)源β細胞的自我復制，并不是來源于胰島殘存的前體細胞，說明胰島β細胞還保留有潛在的自我復制及增殖能力，并且是在機體復雜內(nèi)環(huán)境中精密的調(diào)控的。有報道稱，胰島素、促黃體素、催產(chǎn)素、肝細胞生長因子、腸促胰島素-1 (GLP-1)、葡萄糖依賴促胰島素肽(GIP)等對β細胞增殖及胰島素分泌有調(diào)控作用，但最近的研究證椐表明，這些激素并不能特異的，強有力的調(diào)控胰島β細胞增殖。
[0004]2013年5月美國哈佛大學Peng Yi等發(fā)現(xiàn)了一個對胰島β細胞具有高度特異調(diào)控作用的因子，稱之為“Betatrophin”。所述betatrophin基因系正常人體19號染色體上的一個基因，由597個堿基構(gòu)成，如下序列:
ATGCCAGTGCCTGCTCTGTGCCTGCTCTGGGCCCTGGCAATGGTGACCCGGCCTGCCTCAGCGGCCCCCATGGGCGGCCCAGAACTGGCACAGCATGAGGAGCTGACCCTGCTCTTCCATGGGACCCTGCAGCTGGGCCAGGCCCTCAACGGTGTGTACAGGACCACGGAGGGACGGCTGACAAAGGCCAGGAACAGCCTGGGTCTCTATGGCCGCACAATAGAACTCCTGGGGCAGGAGGTCAGCCGGGGCCGGGATGCAGCCCAGGAACTTCGGGCAAGCCTGTTGGAGACTCAGATGGAGGAGGATATTCTGCAGCTGCAGGCAGAGGCCACAGCTGAGGTGCTGGGGGAGGTGGCCCAGGCACAGAAGGTGCTACGGGACAGCGTGCAGCGGCTAGAAGTCCAGCTGAGGAGCGCCTGGCTGGGCCCTGCCTACCGAGAATTTGAGGTCTTAAAGGCTCACGCTGACAAGCAGAGCCACATCCTATGGGCCCTCACAGGCCACGTGCAGCGGCAGAGGCGGGAGATGGTGGCACAGCAGCATCGGCTGCGACAGATCCAGGAGAGACTCCACACAGCGGCGCTCCCAGCCTGABetatrophin是編碼198個氨基酸的活性肽，其氨基酸序列如下:MPVPALCLLWALAMVTRPASAAPMGGPELAQHEELTLLFHGTLQLGQALNGVYRTTEGRLTKARNSLGLYGRTIELLGQEVSRGRDAAQELRASLLETQMEEDILQLQAEATAEVLGEVAQAQKVLRDSVQRLEVQLRSAWLGPAYREFEVLKAHADKQSHILWALTGHVQRQRREMVAQQHRLRQIQERLHTAALPA
Betatrophin高度保守存在于哺乳類動物，作為分泌蛋白，betatrophin已在其轉(zhuǎn)染的293細胞(實驗用細胞)上清液及betatrophin基因過表達的小鼠血漿中檢出。人類betatrophin主要在肝臟表達。當應用定量PCR分析時,在胰島素受體拮抗劑S961誘導胰島素抵抗小鼠模型上，發(fā)現(xiàn)肝臟betatrophin上調(diào)6倍，白脂肪組織中上調(diào)4倍，均伴有胰島β細胞明顯增殖。當把betatrophin基因在小鼠上過表達，與無基因轉(zhuǎn)染對照組小鼠相t匕，胰島β細胞增殖率高達17倍，最高可達33倍。進一步，應用葡萄糖激發(fā)胰島素釋放試驗(GSIS)、葡萄糖耐量試驗證實了這些增殖的胰島β細胞具有正常調(diào)控糖代謝功能。
[0005]此外，發(fā)明人在對臍帶華通膠源間充質(zhì)干細胞(Wharton’ jelly mesenchymalstem cells, WJMSCs)的研究中發(fā)現(xiàn)，給予2型糖尿病患者靜脈或胰背動脈輸入臍帶華通膠源間充質(zhì)干細胞，可部分改善高血糖癥狀。分析認為，是華通膠源間充質(zhì)干細胞的旁/自分泌效應，調(diào)節(jié)了機體免疫功能，部分改善了胰島素抵抗及敏感性，從而部分改善了高血糖癥狀，但并沒有解決2型糖尿病功能β細胞缺乏的本質(zhì)問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術問題是，應用基因工程方法制備一種干細胞，將該干細胞輸入人體后能夠調(diào)控胰島β細胞增殖，恢復瀕于衰竭的β細胞功能，改善2型糖尿病患者的病情和預后。
[0007]本發(fā)明一種治療2型糖尿病的干細胞是按以下方法制備的:首先合成betatrophin基因cDNA質(zhì)粒,構(gòu)建腺相關病毒AAV6載體,應用AAV6載體攜帶betatrophin基因，然后將AAV6_Betatrophin基因轉(zhuǎn)導入人間充質(zhì)干細胞,使之過表達betatrophin分子，即為betatrophin基因工程干細胞,或稱betatrophin基因修飾干細胞,可靜脈輸入人體，用以調(diào)控胰島β細胞增殖，恢復瀕于衰竭的β細胞功能。
[0008]所述人間充質(zhì)干細胞可以是任何一種成體間充質(zhì)干細胞，如骨髓源間充質(zhì)干細胞、脂肪源間充質(zhì)干細胞；也可以是任何一種胚外來源的間充質(zhì)干細胞，如新生兒臍帶、臍血、胎盤等來源的間充質(zhì)干細胞；而其中優(yōu)選臍帶華通膠源間充質(zhì)干細胞。
[0009]本發(fā)明所稱“Betatrophin基因工程干細胞”英文名稱為“Betatrophin GeneEngineering Stem Ce lls，，。
[0010]制備Betatrophin基因工程干細胞的工藝流程如下:
(1)合成Betatrophin cDNA 質(zhì)粒；
(2)載體選擇與構(gòu)建:選擇腺相關病毒載體AAV6；
(3)構(gòu)建AAV6_betatrophin:檢測表達效率；
(4)制備間充質(zhì)干細胞:按當代醫(yī)學界公知的方法制備成體間充質(zhì)干細胞或胚外來源的間充質(zhì)干細胞。其中臍帶華通膠來源的間充質(zhì)干細胞按本發(fā)明人的ZL200910157731.6號中國專利方法制備；
(5)將AAV6-betatrophincDNA轉(zhuǎn)染入臍帶華通膠源間充質(zhì)干細胞的方法為:收集第二代或第三代間充質(zhì)干細胞，計數(shù)后使用無血清細胞培養(yǎng)基稀釋，間充質(zhì)干細胞濃度為
2X 15細胞/毫升，在75cm2的培養(yǎng)瓶中，加入10毫升間充質(zhì)干細胞懸液充分混勻，放置于37°C、飽和濕度、含5%C02的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。貼壁細胞達到60%~80%融合時，棄培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，加入 10 毫升 AAV6_betatrophin cDNA 轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，AAV6_betatrophin cDNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基的成份是無血清培養(yǎng)基，其中AAV6-betatrophin cDNA含量為2.68 X 110Vg/毫升，含Etoposide濃度為2μΜ。間充質(zhì)干細胞在AAV6_betatrophin cDNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時后，吸棄AAV6-betatrophin cDNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，加入磷酸鹽緩沖液輕洗間充質(zhì)干細胞兩遍后，加入4毫升0.125%胰蛋白酶消化I~2分鐘，顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染AAV6-betatrophin cDNA后的間充質(zhì)干細胞完全脫離培養(yǎng)瓶底,加入200微升人血清混勻中和胰蛋白酶，將AAV6-betatrophin-間充質(zhì)干細胞懸液移入50毫升離心管中，以1500r/min速度離心10分鐘后棄上清，用生理鹽水再稀釋AAV6_betatrophin-間充質(zhì)干細胞,再以1500r/min速度離心10分鐘后棄上清洗漆2遍,用生理鹽水再稀釋AAV6_betatrophin-間充質(zhì)干細胞至2ml。
[0011]按本發(fā)明方法制得的AAV6-betatrophin_間充質(zhì)干細胞經(jīng)靜脈注射輸入。同時準備未經(jīng)轉(zhuǎn)染的純化間充質(zhì)干細胞IX 107，用生理鹽水稀釋至2ml，同時進行靜脈推注。適應癥為按1999年世界衛(wèi)生組織規(guī)定標準確診的2型糖尿病患者。
[0012]本發(fā)明將betatrophin基因轉(zhuǎn)導入間充質(zhì)干細胞,構(gòu)建betatrophin基因工程干細胞，借助干細胞作為載體使betatrophin在體內(nèi)長期表達。Betatrophin基因具有特異調(diào)控胰島β細胞自我增殖功能，干細胞具有旁分泌、自分泌效應、靶病變歸巢效應，表達大量生長因子、細胞因子及特異的干細胞趨化因子。Betatrophin基因與干細胞兩方面聯(lián)合，共同作用于2型糖尿病，既干預靶點調(diào)控刺激內(nèi)源胰島β細胞增殖，恢復衰竭的β細胞功能，同時發(fā)揮干細胞的旁/自分泌的免疫調(diào)節(jié)作用，兩者結(jié)合，有望取代胰島素每日注射，根本改善糖尿病患者的預后。

【具體實施方式】
[0013]以下通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0014]實施例1制備臍帶華通膠來源的間充質(zhì)干細胞
按ZL200910157731.6號中國專利記載的方法制備臍帶華通膠來源的間充質(zhì)干細胞。具體方法為:取人新鮮臍帶，以等滲的平衡鹽溶液或無血清培養(yǎng)基洗去臍帶殘留血液，去除臍動脈、臍靜脈及臍帶外膜，剝離華通膠并剪切成小塊，再以等滲的平衡鹽溶液或無血清培養(yǎng)液沖洗后，浸泡于0.05 - 0.3%膠原酶溶液中，置于35 - 37.5°C溫箱中10 — 30小時，組織塊消化，液體呈粘稠狀，然后加入相當于原液I 一 10倍量的含胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，分裝于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，置CO2培養(yǎng)箱，待細胞貼壁后更換含胎牛血清的培養(yǎng)基溶液，以后每隔2 - 4天換液一次，細胞貼壁融合后傳代培養(yǎng)；傳代培養(yǎng)2~4代，即時使用或冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0015]所稱“臍帶華通膠來源的原始間充質(zhì)干細胞”在生物學表型鑒定中，具有以下技術特征:①在標準培養(yǎng)條件下粘附于塑料制培養(yǎng)器皿生長；②表達⑶90、⑶105、⑶44 ；HLA-ABC ;不表達⑶45、⑶34，HLA-DR ;③體外可誘導分化為成骨細胞和脂肪細胞。本發(fā)明方法所用UW-MSCs細胞移植材料，可以即時使用剛剛完成傳代培養(yǎng)2 — 4代的UW-MSCs新鮮品，也可以使用冷凍保存的傳2 — 4代UW-MSCs備用品。
[0016]實施例2 將 AAV6-betatrophin cDNA 轉(zhuǎn)染入 WJMSCs，制備 AAV6-betatrophin-WJMSCs
收集第二代或第三代的臍帶華通膠源間充質(zhì)干細胞(WJMSCs)，計數(shù)后使用完全細胞培養(yǎng)液稀釋，WJMSCs濃度為2 X 15細胞/毫升，在75cm2的培養(yǎng)瓶中，加入10毫升WJMSCs懸液充分混勻，放置于37°C、飽和濕度、含5%C02的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。貼壁細胞達到60%~80%融合時，棄培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，加入10毫升AAV6-betatrophin cDNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，培養(yǎng)48小時后，吸棄AAV6-betatrophin cDNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，加入磷酸鹽緩沖液輕洗WJMSCs兩遍后，加入4毫升0.125%胰蛋白酶消化I~2分鐘，顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后的臍帶華通膠源間充質(zhì)干細胞完全脫離培養(yǎng)瓶底后，加入2毫升含10%血清的培養(yǎng)基和胰蛋白酶，將AAV6-betatrophin-ffJMSCs懸液移入50毫升離心管中，以速度1500r/min離心1min后棄上清，用生理鹽水稀釋AAV6-betatrophin_WJMSCs至0.5ml,進行靜脈推注。本實施例所述劑量為一只大鼠應用量。
[0017]上述完全細胞培養(yǎng)液的成分為:8%~10%小牛血清，90%~92%DMEM_F12培養(yǎng)基。
[0018]上述AAV6_betatrophin cDNA 轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基的成份為:AAV6_betatrophin cDNA 含量為 2.68 X 110Vg/ 毫升、8% ~10% 小牛血清，90%_92% DMEM-F12 培養(yǎng)基，含 Etoposide 濃度為2 μ M。
[0019]實施例3 Betatrophin基因工程干細胞治療2型糖尿病有效性及安全性實驗觀察
以大鼠為實驗動物，按下述步驟進行實驗觀察。
[0020]①合成betatrophin cDNA 質(zhì)粒；
②構(gòu)建AAV6_betatrophin ;
③按實施例1方法制備三代WJMSCs；
④按實施例2方法制備AAV6-betatrophin_WJMSCs,備用；
⑤建立大鼠2型糖尿病模型:以高脂高糖飼料喂養(yǎng)另加小劑量左鏈菌素(STZ)腹腔注射建立大鼠2型糖尿病模型。高脂高糖飼料成分為:豬油18%、蔗糖20%、蛋黃3%、基礎飼料59%。高糖高脂飼料喂養(yǎng)2個月的大鼠誘發(fā)出胰島素抵抗，禁食12小時，腹腔注射STZ，STZ劑量為30mg/kg。STZ注射5d后測定尾靜脈隨機血糖，隨機血糖>16.7mmol/L者為2型糖尿病造模成功；
⑥隨機分組:a.經(jīng)鼠尾靜脈注射試驗品AAV6-betatrophin-WJMSCs；b.對照品WJMSCs-AAV6-EGFP (綠色熒光蛋白基因);注射量為:每只大鼠WJMSCs-AAV6_betatrophin2 X 111 或 WJMSCs-AAV6-EGFP 2 X 111 ；
⑦隨訪觀察:觀測項目包括每日二次血糖測定，定期血漿胰島素、C肽、血脂測定，糖耐量試驗，短時效胰島素耐量試驗(ITT):胰島素釋放試驗(IRTs)，胰島素敏感指數(shù)(ISI)測定；
⑧觀察betatrophin-WMSCs移植后的安全性，動態(tài)觀察血CD3，CD4，IgG，IgM等T、B細胞功能變化，進行致腫瘤性相關檢查；
⑨分別在滿一個月、滿兩個月時各處死一批大鼠，進行以下檢查:a.免疫熒光檢測:胰腺、肝、白脂肪組織免疫熒光染色，應用抗Myc-DDK抗體觀察betatrophin表達水平，應用Κ?67抗體觀察胰島β細胞分裂增殖狀態(tài)，應用抗胰島素抗體行胰島β細胞成熟鑒定，應用共聚焦顯微鏡雙標抗體鑒定2型糖尿病經(jīng)betatrophin-WMSCs移植后胰島β細胞增殖率；b.組織病理檢測:胰腺、肝、脂肪進行HE染色病理組織檢查；c.胰腺、肝、脂肪組織免疫組織檢測betatrophin、胰島素、C肽水平。
[0021]結(jié)果:大鼠經(jīng)高脂高糖飲食1.5月后，較基礎飼養(yǎng)前體重平均增加1.4±0.3倍，血糖較前增加33.6 ±4.1%，血脂較前增加18.2 ±3.8%,經(jīng)STZ誘導后96%大鼠都出現(xiàn)了典型2型糖尿病特征，平均隨機血糖25.6±4.8 mmol/L ;血清胰島素平均3.1±0.3mU/L ;血清C肽平均0.43±0.1 ;而經(jīng)WJMSCs-AAV6_betatrophin cDNA移植后，3天血糖開始下降，7天血糖下降到移植前水平2/3-1/2，14天后血糖基本穩(wěn)定在隨機血糖8.1-11.3 mmol/L，偶有波動；移植后前7天胰島素用量逐漸減少，7-14天間斷應用，14天后基本停用胰島素，偶爾個例血糖波動曾加用普通胰島素Iul ;血清胰島素升至平均7.0±0.6 mU/L ;血清C肽平均
1.3±0.4;而對照組血糖持續(xù)在25-33 mmol/L，血清C肽0.26±0.1 ;每日外源補充人胰島素30R, 1/2死于一周內(nèi)，I月存活僅1/5。
[0022]實施例4體內(nèi)對比觀察betatrophin基因工程干細胞,或單獨betatrophin基因靜脈輸入有效性與安全性對比
80只Wester大鼠，63只成功誘導成2型糖尿病模型，另設8只空白健康對照，63只2型糖尿病大鼠按治療隨機分為:①單獨細胞組，給予WJMSCs-AAV6-EGFP ;②基因工程干細胞組，給予WJMSCs-AAV6_betatrophin ;③單獨基因組,給予AAV6_betatrophin 對照組，給予AAV6-EGFP。每組12只大鼠，分批存活I個月、2個月，全部按實施例3所列技術指標觀察。
[0023]本實驗目的是為了鑒定直接注射AAV6_betatrophin是否可達到上述WJMSCs-AAV6-betatrophin同樣效果，故本組增加單獨AAV6_betatrophin及對照AAV6-EGFP ;并與原 WJMSCs-AAV6_betatrophin 及 WJMSCs_AAV6_EGFP 實驗組對比觀察對 2型糖尿病的治療效果。
[0024]結(jié)果:在WJMSCs-AAV6-betatrophin 及 WJMSCs-AAV6_EGFP 組發(fā)現(xiàn)上述類似實驗結(jié)果，但直接基因注射(AAV6-betatix)phin)結(jié)果顯示:2型糖尿病大鼠經(jīng)鼠尾靜脈注射AAV6-betatrophin后,5天內(nèi)血糖未下降,需持續(xù)外源補充胰島素,但6天后血糖有下降趨勢，胰島素用量逐漸減少，14天隨機血糖水平為13.6±3.2mmol/L，至20天逐漸下降到隨機血糖9.2-11.6mmol/L,30天保持穩(wěn)定。而個別大鼠血糖始終未降，分折可能與注射方法不當?shù)纫蛩赜嘘P。
[0025]綜上發(fā)現(xiàn)表明:WJMSCs聯(lián)合betatrophin,由于借助WJMSCs的旁/自分泌效應，顯示W(wǎng)JMSCs-AAV6-betatrophin對于胰島β細胞及其介導的糖代謝效應顯著優(yōu)于單獨AAV6-betatrophin 注射。
【權利要求】
1.一種基因工程干細胞，可靜脈輸入人體，用于對2型糖尿病的治療，其特征在于，它是按以下方法制作的:首先合成betatrophin基因cDNA質(zhì)粒,構(gòu)建腺相關病毒AAV6載體，應用AAV6載體攜帶betatrophin基因，然后將AAV6_betatrophin基因轉(zhuǎn)導入間充質(zhì)干細胞，使之過表達betatrophin分子，即為betatrophin基因工程干細胞。
2.根據(jù)權利要求1所述的基因工程干細胞，其特征在于，制備該基因工程干細胞所使用的間充質(zhì)干細胞為骨髓源間充質(zhì)干細胞、脂肪源間充質(zhì)干細胞或任何一種成體間充質(zhì)干細胞。
3.根據(jù)權利要求1所述的基因工程干細胞，其特征在于，制備該基因工程干細胞所使用的間充質(zhì)干細胞為新生兒臍帶、臍血、胎盤來源的間充質(zhì)干細胞或任何一種胚外來源的間充質(zhì)干細胞。
4.根據(jù)權利要求3所述的基因工程干細胞，其特征在于，制備該基因工程干細胞所使用的間充質(zhì)干細胞為臍帶華通膠源間充質(zhì)干細胞。
5.根據(jù)權利要求4所述的基因工程干細胞，其特征在于，所述臍帶華通膠源間充質(zhì)干細胞是按以下方法制作的:取人新鮮臍帶，以等滲的平衡鹽溶液或無血清培養(yǎng)基洗去臍帶殘留血液，去除臍動脈、臍靜脈及臍帶外膜，剝離華通膠并剪切成小塊，再以等滲的平衡鹽溶液或無血清培養(yǎng)液沖洗后，浸泡于0.05 - 0.3%膠原酶溶液中，置于35 - 37.5°C溫箱中10 - 30小時，組織塊消化，液體呈粘稠狀，然后加入相當于原液I 一 10倍量的含胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，分裝于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，置CO2培養(yǎng)箱，待細胞貼壁后更換含胎牛血清的培養(yǎng)基溶液，以后每隔2 - 4天換液一次，細胞貼壁融合后傳代培養(yǎng)；傳代培養(yǎng)2 — 4代，即時使用或冷凍保存?zhèn)溆谩?br> 6.根據(jù)權利要求5所述的基因工程干細胞,其特征在于,將AAV6-betatrophincDNA轉(zhuǎn)染入臍帶華通膠源間充質(zhì)干細胞的方法為:收集第二代或第三代間充質(zhì)干細胞，計數(shù)后使用無血清細胞培養(yǎng)基稀釋，間充質(zhì)干細胞濃度為2X 15細胞/毫升，在75cm2的培養(yǎng)瓶中，加入10毫升間充質(zhì)干細胞懸液充分混勻，放置于37°C、飽和濕度、含5%C02的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；貼壁細胞達到60%~80%融合時，棄培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，加入10毫升AAV6-betatrophin cDNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，AAV6-betatrophin cDNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基的成份是無血清培養(yǎng)基，其中 AAV6_betatrophin cDNA 含量為 2.68X 1icVg/毫升，含 Etoposide 濃度為2μΜ;間充質(zhì)干細胞在AAV6-betatrophin cDNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時后，吸棄AAV6-betatrophin cDNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基,加入磷酸鹽緩沖液輕洗間充質(zhì)干細胞兩遍后，加入4毫升0.125%胰蛋白酶消化I~2分鐘，顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染AAV6-betatrophincDNA后的間充質(zhì)干細胞完全脫離培養(yǎng)瓶底，加入200微升人血清混勻中和胰蛋白酶，將AAV6-betatrophin_間充質(zhì)干細胞懸液移入50毫升離心管中，以1500r/min速度離心10分鐘后棄上清，用生理鹽水再稀釋AAV6-betatrophin-間充質(zhì)干細胞,再以1500r/min速度離心10分鐘后棄上清洗漆2遍,用生理鹽水再稀釋AAV6-betatrophin-間充質(zhì)干細胞至2ml。
【文檔編號】A61K48/00GK104164451SQ201410388700
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月9日 優(yōu)先權日:2014年8月9日
【發(fā)明者】高連如, 張寧坤, 楊曄, 朱智明 申請人:高連如