一種銀杏葉提取物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種銀杏葉提取物及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明所述的銀杏葉提取物中總銀杏萜內(nèi)酯的含量為6％～12％(w/w)，總黃酮含量為30％～70％(w/w)，原花青素含量為20％～60％(w/w)，總銀杏萜內(nèi)酯％+總黃酮％+原花青素％>90％，且總黃酮醇苷含量20％～50％(w/w)，其可作為制備用于預(yù)防或治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如糖尿病性白內(nèi)障、糖尿病性視神經(jīng)病變或糖尿病性視網(wǎng)膜脂血癥的食品、保健食品或藥品。其制備方法包括：乙醇水溶液提取銀杏葉，提取液濃縮至稠膏，冷水浸提稠膏，過濾后，濾液用大孔樹脂吸附分離，洗脫液濃縮干燥后得銀杏葉提取物。
【專利說明】一種銀杏葉提取物及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及天然植物提取物，具體涉及從一種銀杏葉提取物及其制備方法和應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 各國藥典中收載的銀杏葉提取物活性成分為黃酮和內(nèi)酯，如《中國藥典》2010年 第一版收載銀杏葉提取物含量測定僅限定總黃酮醇苷和銀杏內(nèi)酯的含量分別不得低于 0. 40%、0. 25%。但近年來，越來越多的報道提示原花青素是植物界中抗氧化能力最強(qiáng)的成 分之一，對心腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等的預(yù)防和治療均具有很好的作用。而且，銀杏葉 中含有資源豐富的原花青素，其在銀杏葉干品中的含量可達(dá)0.5%?4%，甚至更高。因此， 從銀杏葉中同時提取黃酮、內(nèi)酯、原花青素用于開發(fā)藥物具有良好的發(fā)展前景。
[0003] 但目前為止，銀杏葉中的原花青素開發(fā)利用還比較缺乏，大部分文獻(xiàn)研究仍然集 中在提高總黃酮、內(nèi)酯的含量方面，提取物中原花青素的含量仍然偏低，如CN1660224公 開了一種葡萄提取物1-99%、銀杏葉提取物1-99%的抗氧化組合物，葡萄提取物含有原 花青素（葡萄籽中的原花青素成分與銀杏葉中的原花青素成分不同，后者抗氧化能力強(qiáng) 于前者）和白藜蘆醇，銀杏葉提取物含有黃酮類物質(zhì)，或同時含有黃酮類物質(zhì)和內(nèi)酯類物 質(zhì)；CN100421680公開了銀杏葉提取物及其制備方法和應(yīng)用，銀杏葉提取物中銀杏總黃酮 >64%，銀杏總內(nèi)酯>11 %，原花青素類化合物含7-10 %。
[0004] 因此，開發(fā)一種原花青素、黃酮、內(nèi)酯含量都較高的銀杏葉提取物，對于銀杏葉的 綜合利用、疾病的治療都具有重要的價值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供了一種銀杏葉提取物及其制備方法和應(yīng)用，該提取物中銀 杏萜內(nèi)酯、黃酮和原花青素三者的含量超過90%，其中，總銀杏萜內(nèi)酯的含量為6%?12% (w/w)，總黃酮含量為30 %?70 % (w/w)，原花青素含量為20 %?60 % (w/w)，且總黃酮醇 苷含量20 %?50% (w/w)。
[0006] 為了獲得更好的藥理活性，上述銀杏葉提取物中，總銀杏萜內(nèi)酯的含量為6%? 12% (w/w)，總黃酮含量為40 %?60 % (w/w)，原花青素含量為30 %?50 % (w/w)，且總黃 酮醇苷含量24%?32% (w/w)，原花青素/總黃酮醇苷含量比值1?2。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供了一種銀杏葉提取物的制備方法，具體制備步驟如下：
[0008] 1)銀杏葉經(jīng)粉碎后，用乙醇溶液30?90% (v/v)提取，共2?3次，每次1?3 小時，每次乙醇溶液用量為銀杏葉的3?10倍，獲得提取液；
[0009] 2)回收提取液至黑色黏稠狀浸膏；
[0010] 3)浸膏冷卻至低于30°C，用水浸提浸膏，水的用量為浸膏的3?10倍，浸提時間 為1?48小時；
[0011] 4)浸提液過濾，濾液用大孔樹脂吸附分離，用乙醇溶液進(jìn)行洗脫，獲得洗脫液；
[0012] 5)洗脫液干燥后即得銀杏葉提取物。
[0013] 作為優(yōu)選方案，
[0014] 步驟1)中，銀杏葉經(jīng)粉碎后，用乙醇溶液60% (v/v)提取，共提取3次，每次1小 時，每次乙醇溶液用量為銀杏葉的8倍。
[0015] 步驟2)中，回收提取液至黑色黏稠狀浸膏，該黑色黏稠狀浸膏在50°C時，相對密 度為1. 25?L 30。
[0016] 步驟3)中，浸膏冷卻至室溫后，用4?25°C水浸提8?24h，水的用量為浸膏的6 倍。
[0017] 步驟4)浸提液過濾，濾液用HPD417大孔樹脂吸附，水洗后，用乙醇溶液50% (v/ v)洗脫，獲得洗脫液；
[0018] 步驟5)洗脫液干燥后即得銀杏葉提取物。
[0019] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的銀杏葉提取物所含的銀杏原花青素含量高達(dá) 20-60% (w/w)，總黃酮醇苷為20-50% (w/w)，該銀杏葉提取物具有較好的抗氧化作用，可 以改善模型小鼠的神經(jīng)功能，可用于預(yù)防或治療糖尿病性白內(nèi)障、糖尿病性視神經(jīng)病變、糖 尿病性視網(wǎng)膜脂血癥等。且當(dāng)該銀杏葉提取物中原花青素：黃酮醇苷含量比例在1 :1?2 : 1之間時，上述作用更強(qiáng)。因此，本發(fā)明制備的銀杏葉提取物，其可作為制備用于預(yù)防或治療 神經(jīng)系統(tǒng)疾病的食品、保健食品或藥品。
[0020] 本發(fā)明以銀杏葉為原料，通過醇提、濃縮至稠膏、水浸提、樹脂純化步驟制備目標(biāo) 產(chǎn)物，獲得銀杏葉提取物。本發(fā)明取得以下有益效果：
[0021] 1、本發(fā)明提供了一種銀杏葉提取物，銀杏萜內(nèi)酯、黃酮和原花青素三者的含量 >90%，總銀杏萜內(nèi)酯的含量為6%?12% (w/w)，總黃酮含量為40%?60% (w/w)，原花青 素含量為30 %?50 % (w/w)，且總黃酮醇苷含量24%?32 % (w/w)，原花青素/總黃酮醇 苷含量比值1?2,具有更好的藥理活性。
[0022] 2、本發(fā)明提供了一種銀杏葉提取物制備方法，包括醇提、濃縮至稠膏、水浸提、樹 脂純化四個過程，操作簡單，對儀器設(shè)備的要求低、成本低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0023] 3、本發(fā)明提供的銀杏葉提取物制備方法中的步驟3回收提取液至黑色黏稠狀浸 膏，用水浸提該稠膏，所得浸提液可以很好的分離溶液和沉淀，僅用濾紙即可以濾清浸提 液，成本低、速度快、且最大程度的保留了原花青素成分，使提取物中的原花青素含量達(dá)到 20%以上，具有更好的藥理活性。
[0024] 4、本發(fā)明提供了一種制備預(yù)防或治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物，可用于治療糖尿病性 白內(nèi)障、糖尿病性視神經(jīng)病變、糖尿性視網(wǎng)膜脂血癥。 具體實施方案：
[0025] 下面的實施例，用于進(jìn)一步說明和描述本發(fā)明，但并不意味著本發(fā)明僅限于此。
[0026] 實施例1 :原花青素、總黃酮、總黃酮醇苷、總萜內(nèi)酯含量測定方法
[0027] 1.原花青素含量測定
[0028] 1. 1供試品溶液：精密稱取試樣粉末100mg，置50ml容量瓶中，精密加甲醇30mL， 超聲處理20min，放冷至室溫后，加甲醇至刻度，搖勻，取上清液，即得。
[0029] 1. 2原花青素對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：取原花青素對照品30mg，精密稱定，置50ml容 量瓶中，精密加甲醇30mL，超聲處理20min，放冷至室溫后，加甲醇至刻度，搖勻，吸取原花 青素對照品溶液〇. 〇, 1. 〇,2. 0,3. 0,4. 0,5. OmL，分別置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。 分別取lml入10ml西林瓶中，再依次加入0. 2ml硫酸鐵銨溶液，6ml鹽酸-正丁醇（5 :95， V/V)，搖勻，密封，置沸水浴水解40min,水解結(jié)束立即置冰水中冷卻，于546nm波長處測吸 光度值。以吸光度為縱坐標(biāo)，對照品濃度為橫坐標(biāo)（mg/mL)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0030] 1. 3樣品測定：精密吸取供試品溶液lmL，照"1. 2"自"入10ml西林瓶中"起，在 546nm波長處測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中含原花青素的濃度，計算樣品中 原花青素的含量。
[0031] 2.總黃酮含量測定
[0032] 2. 1供試品溶液：精密稱取試樣粉末lOOmg，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25mL，密 塞，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷至室溫，稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離 心，取上清液作為供試品溶液。
[0033] 2. 2蘆丁對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：精密吸取蘆丁對照品溶液0. 0,1. 0, 2. 0, 3. 0,4. 0， 5.0,6.〇1^，分別置251^量瓶中，加水至61^，加入5%亞硝酸鈉溶液11^，搖勻，放置611^11， 加10%硝酸鋁溶液lmL，搖勻放置6min，加氫氧化鈉試液10mL，搖勻，再加水至刻度，搖勻， 放置15分鐘，以0. OmL對照品溶液制得的溶劑為空白，在波長510nm處分別測定吸收度值。 以吸光度為縱坐標(biāo)，對照品濃度為橫坐標(biāo)（mg/mL)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0034] 2. 3樣品測定：精密吸取供試品溶液2mL，至25mL量瓶中，照"2. 2"自"加水至6mL" 起，在510nm波長處測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中含總黃酮的濃度，計算樣 品中總黃酮的含量。
[0035] 3.總黃酮醇苷含量測定
[0036] 3. 1供試品溶液的制備：精密稱取試樣粉末35mg，置250ml茄型瓶，加甲醇-25% 鹽酸（4 :1)混合液25ml，90°C加熱回流30分鐘，回流結(jié)束時取出放冷，提取液轉(zhuǎn)移至50ml 容量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得。
[0037] 3. 2對照品溶液制備：分別精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過夜的槲皮素對照品、 山奈素對照品、異鼠李素對照品（中國藥品生物制品檢定所），加甲醇制成每lml分別含 30ug、30ug、20ug的混合液，即得。
[0038] 3. 3HPLC測定（理論板數(shù)按槲皮素峰計算不低于2500):以十八烷基硅烷鍵合硅膠 為填充劑；甲醇-〇. 4%磷酸溶液（50 :50)為流動相；檢測波長：360nm ;進(jìn)樣量：10ul ;
[0039] 3.4含量計算：總黃酮苷含量=(槲皮素含量+山奈素含量+異鼠李素含 量）X2. 51
[0040] 4.總萜內(nèi)酯的含量測定
[0041] 4. 1供試品溶液制備：精密稱取試樣粉末150mg，置10ml容量瓶中，加甲醇適量， 超聲處理30min，取出放冷后甲醇定容；精密量取5ml，過酸性氧化鋁柱（200-300目，3g，內(nèi) 徑lcm，甲醇濕法裝柱），用甲醇25ml洗脫；收集洗脫液，回收至干，殘渣用5ml甲醇轉(zhuǎn)移至 l〇ml容量瓶中，加水約4. 5ml，超聲30min ;超聲結(jié)束后取出放冷，加甲醇定容，搖勻即得。
[0042] 4. 2對照品溶液制備：取內(nèi)酯對照品適量，精密稱定，加50%甲醇分別制成每lml 含銀杏內(nèi)酯A 0. 14mg、銀杏內(nèi)酯B 0.08mg、銀杏內(nèi)酯C 0.06mg、白果內(nèi)酯0. 20mg的混合溶 液，即得。
[0043] 4. 3HPLC測定：色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-四氫呋喃-水 (25 :10 :65)為流動相；檢測器：蒸發(fā)光散射檢測；流速：1. Oml/min ;柱溫：30°C;進(jìn)樣量：對 照品溶液l〇ul、20ul，供試品溶液10-20ul。理論板數(shù)按白果內(nèi)酯峰計算應(yīng)不低于3000。 [0044] 4. 4含量計算：用外標(biāo)兩點對數(shù)方程分別計算銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C 和白果內(nèi)酯的含量，即得。
[0045] 實施例2 :提取溶劑的選擇
[0046] 稱取15g銀杏葉，置250ml茄型瓶，分別加入7倍量提取溶劑（30%乙醇、40%乙 醇、50 %乙醇、60 %乙醇、70 %乙醇、80 %乙醇、90 %乙醇），分別回流提取3次，每次提取lh， 測定原花青素、總黃酮、總黃酮醇苷和總萜內(nèi)酯轉(zhuǎn)移率。
[0047] 表1提取溶劑對有效成分轉(zhuǎn)移率的影響
[0048]

【權(quán)利要求】
1. 一種銀杏葉提取物，其特征在于，總銀杏萜內(nèi)酯的含量為6%?12% (w/w)，總黃酮 含量為30%?70% (w/w)，原花青素含量為20%?60% (w/w)，總銀杏萜內(nèi)酯％ +總黃酮％ +原花青素％ >90 %,且總黃酮醇苷含量20 %?50 % (w/w)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種銀杏葉提取物，其特征在于，總銀杏萜內(nèi)酯的含量為 6%?12% (w/w)，總黃酮含量為40%?60% (w/w)，原花青素含量為30%?50% (w/w)， 總銀杏萜內(nèi)酯％ +總黃酮％ +原花青素％ >90%，且總黃酮醇苷含量24%?32% (w/w)，原 花青素/總黃酮醇苷的含量比值為1?2。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種銀杏葉提取物，其特征在于，銀杏葉提取物中總銀杏萜 內(nèi)酯的含量為8% (w/w)，總黃酮含量為39% (w/w)，原花青素含量為48% (w/w)，且總黃酮 醇苷含量24% (w/w)。
4. 權(quán)利要求1或2或3所述的一種銀杏葉提取物的制備方法，其特征在于，1)銀杏葉 經(jīng)粉碎后，用乙醇溶液30?90% (v/v)提取，共2?3次，每次1?3小時，每次乙醇溶液 用量為銀杏葉的3?10倍，獲得提取液；2)回收提取液至黑色黏稠狀浸膏；3)浸膏冷卻至 低于30°C，用水浸提浸膏，水的用量為浸膏的3?10倍，浸提時間為1?48小時；4)浸提 液過濾，濾液用大孔樹脂吸附分離，用乙醇溶液進(jìn)行洗脫，獲得洗脫液；5)洗脫液干燥后即 得銀杏葉提取物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種銀杏葉提取物的制備方法，其特征在于：1)銀杏葉經(jīng)粉 碎后，用60%乙醇溶液（v/v)提取3次，每次1小時，每次乙醇溶液用量為銀杏葉的8倍；2) 回收提取液至黑色黏稠狀浸膏；3)浸膏冷卻至室溫后，用4?25°C水浸提8?24h，水的用 量為浸膏的6倍；4)浸提液過濾，濾液用HPD417大孔樹脂吸附，水洗后，用50% (v/v)乙醇 洗脫，獲得洗脫液；5)洗脫液干燥后即得銀杏葉提取物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種銀杏葉提取物的制備方法，其特征在于，步驟2)中回收 提取液至黑色黏稠狀浸膏，該黑色黏稠狀浸膏在50°C時，相對密度為1. 25?1. 30。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種銀杏葉提取物，其可用于制備預(yù)防或治療神經(jīng) 系統(tǒng)疾病的保健食品或藥品。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種新銀杏葉提取物，其可用于制備預(yù)防或治療糖 尿病性白內(nèi)障、糖尿病性視神經(jīng)病變或糖尿病性視網(wǎng)膜脂血癥的食品、保健食品或藥品。
【文檔編號】A61P27/12GK104147054SQ201410389198
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月8日
【發(fā)明者】喬洪翔, 王如偉, 胡江寧, 陳琳, 何厚洪, 瞿偉, 陳玲芳, 呂麗麗 申請人:浙江康恩貝制藥股份有限公司, 浙江康恩貝藥品研究開發(fā)有限公司