A型原花青素二聚物與丙酮縮合物的結(jié)構(gòu)、制備及生物活性的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了原花青素丙酮縮合物的簡單合成方法，并提供了新型的原花青素二聚體丙酮縮合物。新化合物的結(jié)構(gòu)經(jīng)多種核磁共振及質(zhì)譜光譜解析定出。原花青素二聚體丙酮縮合物有較強的清除自由基活性及比原花青素本身顯著增強的抑制阿拉法葡萄糖苷酶活性。可能作為食品、化妝品等產(chǎn)品的抗氧化劑,也可作為有抑制阿拉法葡萄糖苷酶活性的抑制肥胖和II型糖尿病的藥物或保健品添加劑。
【專利說明】A型原花青素二聚物與丙酮縮合物的結(jié)構(gòu)、制備及生物活性

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及原花青素與丙酮縮合物的結(jié)構(gòu)、制備及活性，特別是新的A型原花青素丙酮縮合物的制備、結(jié)構(gòu)及抗氧化活性和抗阿拉法-葡萄糖苷酶活性。

【背景技術(shù)】
[0002]原花青素是一類具有很強生物活性的化合物，有保護心血管系統(tǒng)，降血糖，抗癌等活性(Nagao, T., Hase, T., Tokimitsu, 1.A green tea extract high incatechins reduces body fat and card1vascular risks in humans.0besity, 2007，15: 1473-1483; Yang, C.S., Wang, X.，Lu G., et al.C.Cancer prevent1nby tea: animal studies, molecular mechanisms and human relevance.Nat.Rev.Cancer, 2009，9: 429—439; Katiyarj S.K., Mukhtaj H.Tea ant1xidants in cancerchemoprevent1n.J.Cell B1chem Supplj 1997，27: 59-67.)。該類成分根據(jù)其聚合度的不同分為單倍體如兒荼素，或二聚體如原花青素Al。為了提高其生物活性和生物利用度，研究人員制備了多種低級性的兒荼素衍生物，其中兒荼素與丙酮縮合產(chǎn)生的具有平面結(jié)構(gòu)的兒荼素丙酮縮合物(I)具有很強的抗氧化作用，可顯著抑制游離基引起的DNA鏈斷裂并顯示出兒荼素本身沒有的抑制阿拉法葡萄糖苷酶活性。另外，由于原花青素結(jié)構(gòu)中含有多個酚羥基，極性過大導(dǎo)致其生物利用度不高，而兒荼素丙酮縮合物親脂性好，在體內(nèi)易通過生物膜，生物利用度提高，因此可提高體內(nèi)作用(Jan H.，Van Der Westhuizenj JacobusA.，et al.An unus ual react1n of flavan-3-ols with acetone of relevance to theformat1n of the tetracyclic ring system in peltogynoids.Tetrahedron, 1990，46: 7849-7854; Hakamataj I，Nakanishij 1., Masudaj Y., et al.Planar catechinanalogues with alkyl side chains: a potent ant1xidant and an alpha-glucosidaseinhibitor.J Am Chem Soc, 2006，128: 6524-6525; Fukuharaj K., Nakanishij 1.,Kansuij H.，et al.Enhanced radical-scavenging activity of a planar catechinanalogue.J Am Chem Soc, 2002，124: 5952-5953)。但是，原花青素聚合物的結(jié)構(gòu)易受反應(yīng)條件的影響發(fā)生復(fù)雜變化，迄今原花青素聚合物包括二聚物的丙酮縮合物尚未見報道。另外，已報道的兒茶素丙酮縮合物的合成方法采用對甲苯磺酸、三氟化硼乙醚或三氟甲磺酸三甲基硅脂為催化劑，刺激性及毒性較大。本發(fā)明采用微量濃硫酸為催化劑，合成方法更為簡單溫和。本發(fā)明得到的原花青素A型二聚物的丙酮縮合物是尚未見報道的新化合物。本發(fā)明公開新的A型原花青素二聚物的丙酮縮合物(2)的結(jié)構(gòu)、制備方法及抗氧化和抑制阿拉法葡萄糖苷酶活性。(見說明書附圖8 A型原花青素二聚物的丙酮縮合物(2)的結(jié)構(gòu))


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于改進兒茶素丙酮縮合物的合成方法，并提供新型的原花青素二聚體丙酮縮合物。新化合物的結(jié)構(gòu)經(jīng)解析多種核磁共振及質(zhì)譜光譜數(shù)據(jù)確定。原花青素二聚體丙酮縮合物有較強的清除自由基活性及比原花青素本身顯著增強的抑制阿拉法葡萄糖苷酶活性。同時衍生物比原花青素本身親脂性增加，有望更好地發(fā)揮體內(nèi)活性，并且也可能作為低極性食品、化妝品等產(chǎn)品的抗氧化劑。
[0004]其具體技術(shù)方案為:
原花青素丙酮縮合物的制備及結(jié)構(gòu)確定，包括以下步驟:
O原花青素丙酮縮合物的制備
將原花青素溶于3-10倍優(yōu)選7倍的丙酮中(原花青素mmol:丙酮ml)。混合物在冰水中冷卻，并滴加丙酮溶液體積0.3-1%，優(yōu)選0.8%的濃硫酸，在室溫下反應(yīng)30-300分鐘70分鐘后加入所用硫酸量5倍以上(重量比，優(yōu)選6倍)的碳酸鈉中和至pH=5-6 ；
2)原花青素丙酮縮合物的純化
上述反應(yīng)液用15倍以上冰水(優(yōu)選20倍)稀釋后進行反相硅膠C18色譜分離，水-甲醇梯度洗脫，得到原花青素丙酮縮合物；
3)原花青素丙酮縮合物的結(jié)構(gòu)確定測定分析生成物的核磁共振及質(zhì)譜數(shù)據(jù)。丙酮縮合物的特征是與原花青素相比，1H NMR中在δ 1.3-2.0 ppm間出現(xiàn)兩個甲基單峰信號(新縮合上的丙叉基)，質(zhì)譜分子量比原花青素原料增加 40 單位。進一步通過 HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlat1n,異核多鍵相關(guān))等二維核磁共振實驗確定結(jié)構(gòu)。
[0005]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
本發(fā)明所用反應(yīng)條件溫和，所用試劑刺激性及毒性小，得到的A型原花青素二聚物的丙酮縮合物是一類新化合物。這些原花青素丙酮縮合物均有較強的清除自由基活性并顯著抑制阿拉法葡萄糖酶活性。同時由于丙叉基的引入，親脂性增加，有望更好地發(fā)揮體內(nèi)活性，并且也可能作為低極性食品、化妝品等產(chǎn)品的抗氧化劑，或作用于阿拉法葡萄糖酶的保健食品或藥品用于肥胖或糖尿病。

【具體實施方式】
[0006]下面【具體實施方式】對本發(fā)明的制備方法和活性測定法作進一步詳細說明。
[0007]—種原花青素丙酮縮合物的制備方法及結(jié)構(gòu)，包括以下步驟:
O原花青素丙酮縮合物的制備
將原花青素溶于丙酮。混合物在冰水中冷卻后滴加催化量濃硫酸，在室溫下反應(yīng)后加入碳酸鈉中和.2)原花青素丙酮縮合物的純化
上述反應(yīng)液用冰水稀釋后進行反相硅膠C18色譜分離，水-甲醇梯度洗脫，得到原花青素丙酮縮合物。
[0008]實施例1:兒茶素丙酮縮合物的制備
將兒茶素(60 mg, 0.2 mmol)溶于丙酮(1.4 ml)?；旌衔镌诒欣鋮s，并滴加濃硫酸(0.012 ml)。在室溫下反應(yīng)70 min。反應(yīng)液加入碳酸鈉(0.12 g)中和至pH=5_6。加入20倍冰水稀釋，使用反相硅膠C18色譜柱分離，從30%甲醇洗脫部分得到43 mg化合物I (收率65%)?；衔颕的核磁圖譜數(shù)據(jù)與文獻報道的兒茶素平面衍生物一致。
[0009]實施例2:原花青素Al丙酮縮合物的制備
將原花青素 Al (95 mg, 0.16 mmol) (Zhang H，Yeriguij Yang Y，Ma C.Structures and ant1xidant and intestinal disaccharidase inhibitory activitiesof A-typeproanthocyanidins from peanut skin.J Agric Food Chemj 2013， 61:8814-8820)溶于丙酮(1.75 ml)，混合物在冰水中冷卻，并滴加濃硫酸(0.012 ml)。在室溫下反應(yīng)70 min。反應(yīng)液加入碳酸鈉(0.12 g)中和至pH=5_6。加入20倍冰水稀釋，使用反相硅膠C18色譜柱分離，得到30.9 mg化合物2，收率33% (附圖1)。該化合物是未見文獻報道的新化合物，通過綜合分析多種光譜數(shù)據(jù)(附圖3-7)確定了結(jié)構(gòu)?；衔?的1H及13CNMR數(shù)據(jù)如附圖9所示；
化合物2:類白色粉末，ES1-MS負離子模式測得準分子離子峰[Μ-Η] m/z 615.3，分子式為C35H32O12，提示化合物2比原料Al多一個丙叉基。13C NMR圖譜中δ 75.80 (C_2,丨)、30.70 (C-廣')和27.01 (C-廣')和1H NMR圖譜中的兩個單峰δ 1.509 (H-廣')和1.570(Η-1/ ')為新結(jié)合的丙叉基信號。13C NMR圖譜(附圖9)碳信號δ 99.02 (C_2)，66.49 (C-3), 28.13 (C_4)，74.56 (C~2r )，66.32 (C-3/ )，26.84 (C-4,)，為黃酮中的雜環(huán)碳所產(chǎn)生的(C和I環(huán))，提示其分子結(jié)構(gòu)中有二個黃烷單元，同時在1H NMR圖譜(附圖 9)中有 H-4' (F環(huán))[δ 2.537，dd (15.5, 10.5) ; 3.023，dd (15.5, 6.0)]及H-4 (C環(huán))[δ 4.523，d (3.5)]信號，均與原料Al的雜環(huán)部分相對應(yīng)。在低磁場δ 6.5-7.3之間的芳香質(zhì)子信號區(qū)域，化合物2比Al少一個質(zhì)子信號，說明Al的B環(huán)或E環(huán)中有一個碳上的質(zhì)子被取代。丙叉基的連接位置根據(jù)HMBC中的δ 6.62的!1-15'與δ 75.80的02'，和有遠程耦合(附圖2)決定。并且和底物相比，C-16'的化學(xué)位移由120.68變?yōu)?34.44，明確丙叉基是與E環(huán)上C-16'及F環(huán)上的3' -O連接。以上證據(jù)確定了化合物2的結(jié)構(gòu)如附圖2所示；
[0010]實施例3 =DPPH (I, 1- 二苯基苦基苯肼)自由基清除實驗
DPPH自由基清除實驗參考Ma等的方法(Ma J.N., WangS.L., Zhang K., etal.Chemical components and ant1xidant activity of the peels of commercialapple-shaped pear (fruit of pyrus pyrifolia cv.pingguoli).J Food Sci, 2012,10，1097 - 1102)。DPPH用甲醇溶解成濃度為0.1 mM的溶液，然后用DMSO稀釋到2.5，5，10和20 μ g/ml四種不同濃度。將10 μ I待測樣品溶液和190 μ I DPPH溶液混合于96孔板，對照組用10 μ I DMSO (二甲亞砜)代替樣品溶液，顏色對照組用190 μ I甲醇代替DPPH溶液，其余操作和樣品組相同?；靹蚝髮⑷M樣品同時置避光室溫反應(yīng)20 min，通過酶標儀于520 nm處測定反應(yīng)物的吸光度(A)，樣品清除能力百分率按如下公式計算，結(jié)果見附圖10:
Effect %=100X[Acontrol - (Asample -Acolor)] /Acontrol上式中Effect %為DPPH自由基清除率，Acontrol為對照組的吸光度，Asample為樣品組的吸光度，Acolor為顏色對照組的吸光度。
[0010]實施例4: a -葡萄糖苷酶抑制活性
a-葡萄糖苷酶抑制活性實驗參考Ma等人的方法(Ma CM, Sato N, Li XY, et al.Flavan-3-ol contents, ant1-oxidative and a -glucosidase inhibitory activitiesof Cynomorium songaricum.Food Chem，2010, 118: 116-119)。將 2 mM對硝基苯胺溶于100 mM磷酸鉀緩沖液中，制得pH 7.0底物溶液。取10 μ I樣品溶液和80 μ I底物溶液混合于96孔板，對照組中使用10 μ I DMSO代替樣品溶液。每孔加入10 // L酶溶液(0.4U/ml,用酶標儀測定 405 nm 處的吸光度；在 37° C 下培養(yǎng)20 min后，再次測定405 nm處的吸光度，每份樣品測量3次，其抑制率公式如下: Inhibit1n%=100X[ (Δ Acontrol-Δ Asample) / Δ Acontrol]
上式中Inhibit1n。/。為百分抑制率，AAcontrol為對照組培養(yǎng)后的吸光度增值，AAsample為樣品組培養(yǎng)后的吸光度增值；
首先測量樣品濃度在100 μ g/ml時的抑制率，將抑制率超過50%的樣品稀釋4個濃度，分別為125、25、5和I u g/ml，分別測定抑制率，建立標準曲線，計算出IC5tl值，結(jié)果見附圖10兒茶素、原花青素Al及其丙酮縮合物的生物活性: aEC50:受試化合物還原50% DPPH時的濃度。IC5tl:受試化合物抑制50%酶活性時的濃度
b阿卡波糖為臨床用作用于α-葡萄糖苷酶的抗糖尿病藥物，在這里作為陽性對照；兒茶素與原花青素Al本身沒有表現(xiàn)出抑制α -葡萄糖苷酶的活性，而這兩個化合物的丙酮縮合物顯示出了明顯的抑制α-葡萄糖苷酶活性，特別是新化合物-Al丙酮縮合物⑵比已知的兒茶素丙酮縮合物(I)活性更強2倍以上。食物中的碳水化合物經(jīng)過唾液和十二指腸中α-淀粉酶的作用消化為麥芽糖糖等二糖，這些二糖在小腸α-葡萄糖苷酶作用下水解為葡萄糖進而被吸收入血，過高的α-葡萄糖苷酶活性會引起餐后血糖快速升高。服用α-葡苷酶抑制劑可以降低II型糖尿病患者餐后血糖，不增加胰島β細胞負擔，同時促進未消化的二糖從腸道排出，因此該類藥物研發(fā)有很好的實用意義。本實驗首次制備得到的原花青素二聚體丙酮縮合物具有抗氧化活性和顯著的抑制α-葡萄糖苷酶活性，對發(fā)現(xiàn)新的α -葡苷酶抑制劑用于肥胖和II型糖尿病患者有重要意義。
[0011]本實驗合成原花青素丙酮縮合物的操作簡單，反應(yīng)條件溫和，可通過常規(guī)試劑反應(yīng)得到，適用于大批量生產(chǎn)。
[0012]以上所述，為本發(fā)明較佳的【具體實施方式】，本發(fā)明的保護范圍不受限于此，任何熟悉本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，通過簡單變化或等效替換得到的技術(shù)方案均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0013]【專利附圖】

【附圖說明】:
附圖1原花青素Al丙酮縮合物(2)的生成
附圖2原花青素Al丙酮縮合物(2)在HMBC圖譜中的主要相關(guān)峰
附圖3 化合物2的1HNMR譜圖
附圖4 化合物2的13CNMR譜圖
附圖5 化合物2的H-H COSY譜圖
附圖6 化合物2的HSQC譜圖
附圖7 化合物2的HMBC譜圖
附圖8 A型原花青素二聚物的丙酮縮合物(2)的結(jié)構(gòu)
附圖9化合物2與原花青素Al的1H和13C NMR數(shù)據(jù)對比
附圖10兒茶素、原花青素Al及其丙酮縮合物的生物活性。
【權(quán)利要求】
1.原花青素二聚體丙酮縮合物的結(jié)構(gòu)。
2.原花青素二聚體丙酮縮合物的簡易制備方法，特指用少量硫酸催化的丙酮溶液反應(yīng)法。
3.權(quán)利要求1所述原花青素二聚體丙酮縮合物純品或以其為組分的混合物作為抗氧化劑在食品、化妝品和藥品中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述原花青素二聚體丙酮縮合物純品或以其為組分的混合物作為阿拉法葡萄糖酶 抑制劑在防治肥胖或糖尿病的保健食品或藥品中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P39/06GK104130268SQ201410394266
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月12日
【發(fā)明者】馬超美, 張慧文, 張玉 申請人:內(nèi)蒙古大學(xué)