具有仿生界面結(jié)構(gòu)的一體化骨軟骨支架及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有仿生界面結(jié)構(gòu)的一體化骨軟骨支架及其制備方法，屬于假體材料領(lǐng)域。本發(fā)明自上而下依次由軟骨層、鈣化層和軟骨下骨層組成，軟骨層是絲素蛋白溶液經(jīng)定向結(jié)晶、凍干而成的垂直取向性支架；鈣化層為絲素蛋白和羥基磷灰石構(gòu)成的致密區(qū)域，鈣化層與軟骨層、軟骨下骨層之間為一次凍干成形的有機(jī)連接；軟骨下骨層是由絲素蛋白和羥基磷灰石構(gòu)成，經(jīng)石蠟微球制孔、凍干、脫蠟而成的三維多孔結(jié)構(gòu)支架。本發(fā)明具有良好的生物相容性和可降解性，鈣化層與軟骨層及軟骨下骨層之間有機(jī)連接，起到隔離骨、軟骨微環(huán)境作用，利于種植的細(xì)胞在兩種微環(huán)境下更好的分化增殖，且制備技術(shù)可控性強(qiáng)，無需其它交聯(lián)劑或有毒試劑，應(yīng)用潛力巨大。
【專利說明】具有仿生界面結(jié)構(gòu)的一體化骨軟骨支架及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于假體材料領(lǐng)域，具體涉及一種具有仿生界面結(jié)構(gòu)的一體化骨軟骨支架 及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 由創(chuàng)傷、疾病、退變等原因造成的關(guān)節(jié)部位骨軟骨損傷是骨科臨床常見疾病，在我 國尤為多見，且呈逐年上升趨勢。目前對于這種軟骨合并軟骨下骨的損傷治療困難，效果尚 不能令人滿意，亟需研究理想的永久性修復(fù)重建措施，保守治療只能暫時緩解疼痛，不能阻 止疾病的發(fā)展；自體骨軟骨移植術(shù)來源有限，難以修復(fù)較大面積的缺損；異體骨軟骨移植 術(shù)存在免疫排斥反應(yīng)和傳播疾病的可能；人工關(guān)節(jié)置換術(shù)費用昂貴，翻修率較高。組織工程 技術(shù)的迅速發(fā)展，為關(guān)節(jié)骨軟骨損傷的再生修復(fù)提供了新的解決方案。
[0003] 曾有采用兩種不同支架材料分別構(gòu)建組織工程骨、軟骨組織，然后組裝到一起的 方法構(gòu)建組織工程骨一軟骨復(fù)合體。組裝的方法包括纖維蛋白凝膠粘合、無創(chuàng)傷縫線縫合 方法或者聚乳酸棒粘合固定等，但是構(gòu)建出的骨一軟骨復(fù)合體存在骨、軟骨部分結(jié)合欠佳 的問題。
[0004] 組織工程學(xué)是涉及細(xì)胞生物學(xué)、材料科學(xué)、工程學(xué)以及生物反應(yīng)器的一門交叉學(xué) 科，利用生命科學(xué)和工程學(xué)的基本原理和方法，構(gòu)建人體所需要組織，用于修復(fù)、替代因創(chuàng) 傷、疾病而無功能的組織或器官。組織工程研究的主要內(nèi)容包括：種子細(xì)胞、支架材料、生長 因子。種子細(xì)胞包括軟骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、脂肪源性干細(xì)胞以及經(jīng)過基因工程改造的 細(xì)胞等。目前國內(nèi)外關(guān)于組織工程骨-軟骨的研究主要集中于支架材料和種子細(xì)胞的選取 以及成骨和成軟骨部分的連接方式等方面， 中國專利申請201010140115. 2公開了"一種雙層仿生軟骨組織工程用支架制備方 法"。首先制備襯底，再在襯底表面制得雙層仿生軟骨支架，最后通過NaOH溶液浸潤襯底表 面的雙層仿生軟骨支架，從襯底上剝離即得到雙層仿生軟骨支架，本發(fā)明制備的雙層仿生 軟骨支架厚度薄，力學(xué)性能良好，一次成型，垂直孔與圓形孔之間連接緊密，不存在相互脫 離的問題；支架結(jié)構(gòu)接近天然軟骨結(jié)構(gòu)，軟骨支架可直接與含聚乳酸PLA/骨粉的襯底結(jié)合 形成骨軟骨支架，用于骨軟骨同時缺損的修復(fù)，軟骨層部分依然具有雙層結(jié)構(gòu)。
[0005] 中國專利申請201210088049. 8公開了一種"一種組織工程軟骨支架材料及其制 備方法和裝置"。本發(fā)明的軟骨支架材料由上至下依次為表層、中層和鈣化層；表層由凍干 軟骨基質(zhì)和II型膠原組成，基質(zhì)纖維在水平方向平行分布；中層由凍干軟骨基質(zhì)、GAG、X型 膠原和II型膠原及TGF-β組成，基質(zhì)纖維呈縱向排列；鈣化層由凍干軟骨基質(zhì)、GAG和X型 膠原及煅燒骨粉組成，其纖維呈三維交錯分布。有利于支架材料植入后與軟骨下骨的融合， 促進(jìn)軟骨下骨的再生；在復(fù)合軟骨細(xì)胞后，能夠用于全層軟骨缺損修復(fù)，再生的軟骨組織具 有與天然軟骨一致的空間結(jié)構(gòu)和蛋白組分；適于膝關(guān)節(jié)等負(fù)重部位關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)，再生 抗壓強(qiáng)度較大的新生軟骨，提高軟骨支架表面的耐磨性和抗壓能力。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的骨和軟骨部分結(jié)合欠佳的缺點而提出的，其 目的是提供一種具有仿生界面結(jié)構(gòu)的一體化骨軟骨支架及其制備方法。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案是： 一種具有仿生界面結(jié)構(gòu)的一體化骨軟骨支架，所述支架自上而下依次由軟骨層1、鈣化 層2和軟骨下骨層3組成，所述軟骨層1為絲素蛋白構(gòu)成的垂直取向性支架，所述鈣化層2 為絲素蛋白和羥基磷灰石構(gòu)成的致密區(qū)域，所述軟骨下骨層3為絲素蛋白和羥基磷灰石構(gòu) 成的三維多孔結(jié)構(gòu)支架；鈣化層2與軟骨層1、軟骨下骨層3之間有機(jī)連接。
[0008] 所述鈣化層2和軟骨下骨層3中的絲素蛋白與羥基磷灰石的質(zhì)量比例均為1:1。
[0009] 所述軟骨下骨層3的三維多孔結(jié)構(gòu)的孔徑范圍為250 μ πΓ425 μ m。
[0010] 所述鈣化層2的厚度小于500 μ m。
[0011] 所述軟骨層1與軟骨下骨層3的厚度比例為1 :1。
[0012] 一種具有仿生界面結(jié)構(gòu)的一體化骨軟骨支架的制備方法，包括以下步驟： a. 石蠟微球模板制備 將石蠟微球放入聚乙烯模具中，烘干備用； b. 鈣化層2和軟骨下骨層3的制備 將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%絲素蛋白溶液和10%羥基磷灰石溶液按質(zhì)量比1:1的混勻，加入石 蠟微球模板中，抽吸真空，混合液充分填充，且高出石蠟微球模板一定距離，液氮冷卻后，室 溫靜置； c. 軟骨層1的制備 待鈣化層2表面微融后，將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的絲素蛋白溶液2mL緩慢加入模具中的鈣化 層2上，-80°C冷凍干燥成型； d. 絲素變構(gòu)和脫蠟 成型后從聚乙烯模具中取出，無水乙醇浸泡，濾蠟，晾干，即得骨軟骨支架。
[0013] 所述絲素蛋白溶液的制備包括以下步驟： ① 蠶絲脫膠：按質(zhì)量比1:200將天然蠶絲加入0. 02mol/L的Na2C03溶液中，煮沸，反復(fù) 水洗，更換Na2C0 3溶液后重復(fù)煮沸、水洗，然后通風(fēng)晾干，得絲素絲； ② 絲素絲溶解液：按質(zhì)量比1:4將絲素絲加入0. 8g/mL的溴化鋰溶液中，60°C水浴中 磁力攪拌獲得； ③ 透析脫鹽：將絲素絲溶解液倒入截留分子量為1200(Γ14000的透析袋中，透析3天， 每天換水，離心，取上清，轉(zhuǎn)入截留分子量為3500的透析袋中，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的聚乙二醇 溶液中透析，離心取上清即得； 所述石蠟微球的制備包括以下步驟： ① 配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的聚乙烯醇溶液，加熱融化； ② 稱取60g石蠟塊，切碎，加入1080ml蒸餾水中，再加入120ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%聚乙烯 醇，加熱攪拌，冷卻，2(Γ80目篩網(wǎng)依次疊放，過篩； ③ 篩得石蠟微球用水反復(fù)沖洗，酒精除水、晾干，取4(Γ60目石蠟微球備用。
[0014] 所述濾蠟技術(shù)應(yīng)用索氏提取器，溶劑為正己烷或者環(huán)己烷。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明中構(gòu)建了一種具有仿生界面結(jié)構(gòu)的一體化骨軟骨支架，使其結(jié)構(gòu)更接近于生理 環(huán)境，是一種骨軟骨復(fù)合組織再生和重建領(lǐng)域的新模式，為構(gòu)建組織工程骨軟骨復(fù)合物提 供了新思路，給進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。所采用的材料屬于天然材料，具有良好的生 物相容性和可降解性，而且材料來源廣泛。鈣化層與軟骨層及軟骨下骨層有機(jī)連接，即利用 未發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變的絲素溶液本身互溶，可以將骨-軟骨兩部分支架很好的連接起來，同時 制備連接鈣化層，起到隔離骨、軟骨微環(huán)境作用，利于種植的細(xì)胞在兩種微環(huán)境下更好的分 化增殖。同時該支架制備技術(shù)可控性強(qiáng)，無需其它交聯(lián)劑或有毒試劑，應(yīng)用潛力巨大。本發(fā) 明在成分、形態(tài)、力學(xué)特性上接近于人體關(guān)節(jié)的"透明軟骨-界面結(jié)構(gòu)-軟骨下骨"細(xì)胞外 基質(zhì)結(jié)構(gòu)，并且結(jié)合緊密避免分層。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1是本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2是掃描電鏡觀察下的本發(fā)明結(jié)構(gòu)圖； 圖3是掃描電鏡觀察下的軟骨層縱切面圖； 圖4是掃描電鏡觀察下的軟骨層橫截面圖； 圖5是掃描電鏡觀察下的軟骨下骨層圖； 圖6是本發(fā)明中軟骨部分HE染色圖； 圖7是本發(fā)明中軟骨下骨部分HE染色圖； 圖8是本發(fā)明中軟骨部分甲苯胺藍(lán)染色圖； 圖9是本發(fā)明中軟骨下骨部分鈣結(jié)節(jié)染色圖； 圖10是掃描電鏡下細(xì)胞粘附在軟骨支架取向微孔結(jié)構(gòu)表面圖； 圖11是掃描電鏡下細(xì)胞充盈在軟骨下骨支架孔隙中的結(jié)構(gòu)圖； 圖12是LIVE/DEAD染色顯示細(xì)胞充盈于軟骨支架取向結(jié)構(gòu)中的結(jié)構(gòu)圖； 圖13是LIVE/DEAD染色顯示細(xì)胞粘附于軟骨支架微孔結(jié)構(gòu)圖； 圖14是LIVE/DEAD染色顯示細(xì)胞充盈于軟骨下骨支架孔隙中結(jié)構(gòu)圖。
[0017] 其中： 1.軟骨層 2.鈣化層 3.軟骨下骨層。

【具體實施方式】
[0018] 下面結(jié)合說明書附圖及實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明： 如圖1所示，一種具有仿生界面結(jié)構(gòu)的一體化骨軟骨支架，所述支架自上而下依次由 軟骨層1、鈣化層2和軟骨下骨層3組成，所述軟骨層1為絲素蛋白構(gòu)成的垂直取向性支架； 所述鈣化層2為絲素蛋白和羥基磷灰石構(gòu)成的致密區(qū)域，鈣化層2與軟骨層1、軟骨下骨層 3之間有機(jī)連接；所述軟骨下骨層3為絲素蛋白和羥基磷灰石構(gòu)成的三維多孔結(jié)構(gòu)支架。
[0019] 所述的軟骨層1為6%的絲素蛋白溶液經(jīng)定向結(jié)晶、凍干而成。
[0020] 所述鈣化層2和軟骨下骨層3中的絲素蛋白與羥基磷灰石的質(zhì)量比例均為1: 1，鈣 化層2與軟骨層1、軟骨下骨層3 -次凍干成形。所述鈣化層2的厚度小于500 μ m。
[0021] 所述軟骨下骨層3的三維多孔結(jié)構(gòu)的孔徑范圍為250 μ πΓ425 μ m，軟骨下骨層3采 用石蠟微球制孔的方法，經(jīng)凍干、脫蠟即得。
[0022] 所述軟骨層1與軟骨下骨層3的厚度比例為1:1。
[0023] -種具有仿生界面結(jié)構(gòu)的一體化骨軟骨支架的制備方法，包括以下步驟： a. 石蠟微球模板制備 將0. 5g 4(Γ60目的石蠟微球置于聚乙烯模具中，輕輕壓平，置于55°C烤箱70min融固， 室溫冷卻； b. 鈣化層2和軟骨下骨層3的制備 分別取質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為10%絲素蛋白溶液和羥基磷灰石溶液各lg混勻，滴加到盛有石蠟 微球的聚乙烯模具中，真空抽吸，使混合液充盈到石蠟微球之間，吸去多余液體，僅留石蠟 微球表面薄層，即混合液高出石蠟微球模板300 μ m，液氮冷卻后，室溫靜置20min ; c. 軟骨層1的制備 待鈣化層2表面微融后，將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的絲素蛋白溶液輕輕滴到絲素蛋白溶液和羥 基磷灰石混合液上面，高度以滴滿模具為宜，約2mL ;將已經(jīng)-80°C冷卻的金屬塊放在模具 上，水平放置于_80°C冰箱中過夜，凍干； d. 絲素變構(gòu)和脫蠟 將凍干的支架從聚乙烯模具中取出，無水乙醇浸泡2h，晾干后放到盛有環(huán)己烷的索氏 提取器中濾蠟48h，脫去石蠟，晾干即得。
[0024] 其中所述石蠟微球的制備包括以下步驟： ① 配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的聚乙烯醇溶液，加熱融化2h ; ② 稱取60g石蠟塊，切碎，加入1080ml蒸餾水中，再加入120ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%聚乙烯 醇溶液，加熱攪拌，冷卻過篩，篩網(wǎng)大小從20目~80目依次疊放； ③ 將篩網(wǎng)中的石蠟微球用自來水反復(fù)沖洗，酒精除水、晾干，按大小分類包裝，取4(Γ60 目石蠟微球備用。
[0025] 其中所述質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為10%的絲素蛋白溶液的制備包括以下步驟： ① 蠶絲脫膠：將40g天然蠶絲加入8kg 0. 02mol/L的Na2C03溶液中，煮沸30min,蒸饋 水洗10次，更換Na 2C03溶液，重復(fù)上述操作，清洗后置于通風(fēng)處晾干，即得絲素絲； ② 絲素絲溶解：稱取8〇g溴化鋰定容蒸餾水100ml溶解，稱取晾干的絲素絲20g，緩慢 塞入溴化鋰溶液中，60°C水浴磁力攪拌4h ; ③ 透析脫鹽：將絲素絲溶解液倒入截留分子量為13000的透析袋中，透析3天，每天更 換蒸饋水3次，llOOOrpm離心15min，取上清，倒入截留分子量為3500的透析袋中，于質(zhì)量 分?jǐn)?shù)15%的聚乙二醇溶液中透析10h，llOOOrpm離心15min，取上清即為絲素蛋白溶液； ④ 絲素蛋白溶液濃度測量：準(zhǔn)確量取5組lml絲素蛋白溶液，置于培養(yǎng)皿中，55°C干燥 過夜，用分析天平準(zhǔn)確測量空培養(yǎng)皿、干燥前和干燥后培養(yǎng)皿的重量，計算出絲素蛋白溶液 的濃度和密度。
[0026] ⑤據(jù)絲素蛋白濃度測量結(jié)果，添加適量的蒸餾水，配制成10%的絲素蛋白溶液，攪 拌均勻； 其中10%絲素蛋白溶液和10%羥基磷灰石溶液混合液的制備方法如下： 采用納米級羥基磷灰石，稱取lkg的羥基磷灰石粉末，按照質(zhì)量比1:10添加蒸餾水 l〇kg制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%羥基磷灰石溶液，置于搖床lh混勻；按照質(zhì)量比1:1的比例，取 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%絲素蛋白溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%羥基磷灰石溶液各lkg混合，利用超聲振 蕩器將二者結(jié)合在一起，即得10%絲素蛋白溶液和10%羥基磷灰石溶液混合液。
[0027] 本發(fā)明中具有仿生界面結(jié)構(gòu)的一體化骨軟骨支架的體式顯微鏡、掃描電鏡檢測： 圖2是掃描電鏡觀察下（X100)的本發(fā)明結(jié)構(gòu)圖，如圖2所示，本發(fā)明一體化支架體式 顯微鏡下觀察3部分層次明顯，一體化支架鈣化層2明顯，軟骨層1與鈣化層2、鈣化層2與 軟骨下骨層3之間連接緊密。
[0028] 圖3是掃描電鏡觀察下（X500)的軟骨層縱切面圖，圖4是掃描電鏡觀察下 (X 500)的軟骨層橫截面圖。
[0029] 如圖3、4所示，軟骨層具有明顯的仿生取向微孔結(jié)構(gòu)，分布均勻； 圖5是掃描電鏡觀察下（X 250)的軟骨下骨層圖，如圖5所示，軟骨下骨層3具有良好 的三維多孔結(jié)構(gòu)，孔隙均勻，連通性好。
[0030] 本發(fā)明具有仿生界面結(jié)構(gòu)的一體化骨軟骨支架的生物相容性： 將脂肪干細(xì)胞分別向軟骨以及成骨誘導(dǎo)后，分別種植到支架的軟骨、軟骨下骨部分，經(jīng) 病理組織學(xué)染色、掃描電鏡、LIVE/DEAD染色觀察。
[0031] 圖6是本發(fā)明中軟骨部分HE染色圖（X 200)，圖7是本發(fā)明中軟骨下骨部分HE染 色圖（X 100)，圖8是本發(fā)明中軟骨部分甲苯胺藍(lán)染色圖，圖9是本發(fā)明中軟骨下骨部分鈣 結(jié)節(jié)染色圖（X 100)。
[0032] 如圖6、所示，組織學(xué)染色顯示經(jīng)誘導(dǎo)的脂肪干細(xì)胞均勻粘附于支架的孔隙中， 軟骨細(xì)胞呈球形，分泌大量蛋白多糖等基質(zhì)，成骨細(xì)胞呈梭形，有大量鈣結(jié)節(jié)沉積。
[0033] 圖10是掃描電鏡下（X 1000)細(xì)胞粘附在軟骨支架取向微孔結(jié)構(gòu)表面圖，圖11是 掃描電鏡下（X 500)細(xì)胞充盈在軟骨下骨支架孔隙中的結(jié)構(gòu)圖。
[0034] 如圖10、11所示，掃描電鏡觀察，細(xì)胞均勻粘附在支架上； 圖12是LIVE/DEAD染色顯示細(xì)胞充盈于軟骨支架取向結(jié)構(gòu)中的結(jié)構(gòu)圖，圖13是LIVE/ DEAD染色顯示細(xì)胞粘附于軟骨支架微孔結(jié)構(gòu)圖，圖14是LIVE/DEAD染色顯示細(xì)胞充盈于軟 骨下骨支架孔隙中結(jié)構(gòu)圖。
[0035] 如圖12~14所示，LIVE/DEAD染色觀察（X 200)，經(jīng)誘導(dǎo)的脂肪干細(xì)胞分別在軟骨 支架和軟骨下骨支架上呈綠色熒光，代表細(xì)胞存活良好。
[0036] 本發(fā)明的主要優(yōu)點如下： ①提出了根據(jù)仿生學(xué)原理模擬關(guān)節(jié)的"透明軟骨-界面結(jié)構(gòu)-軟骨下骨"天然結(jié)構(gòu)， 研制"骨支架-界面結(jié)構(gòu)-軟骨支架"的設(shè)計理念；并提出利用未發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變的SF溶液 本身互溶，將三部分支架緊密連接，既隔離了骨、軟骨微環(huán)境，又加強(qiáng)了軟骨、骨部分的力學(xué) 強(qiáng)度。
[0037] ②軟骨層1為仿生取向微孔結(jié)構(gòu)，軟骨下骨層3具備高貫通性和孔隙率的 Macro-micro結(jié)構(gòu)，界面結(jié)構(gòu)組成類似于天然軟骨興化層2,使其結(jié)構(gòu)功能更接近于生理， 是一種骨-軟骨復(fù)合組織再生和重建領(lǐng)域的新模式。
[0038] ③軟骨層1、軟骨下骨層3具有良好的孔隙結(jié)構(gòu)和連通性，有利于細(xì)胞遷移入支架 內(nèi)部及營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)移。
【權(quán)利要求】
1. 一種具有仿生界面結(jié)構(gòu)的一體化骨軟骨支架，其特征在于：所述支架自上而下依次 由軟骨層（1)、鈣化層（2)和軟骨下骨層（3)組成，所述軟骨層（1)為絲素蛋白構(gòu)成的垂直取 向性支架，所述鈣化層（2)為絲素蛋白和羥基磷灰石構(gòu)成的致密區(qū)域，所述軟骨下骨層（3) 為絲素蛋白和羥基磷灰石構(gòu)成的三維多孔結(jié)構(gòu)支架；鈣化層（2)與軟骨層（1)、軟骨下骨層 (3)之間有機(jī)連接。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有仿生界面結(jié)構(gòu)的一體化骨軟骨支架，其特征在于： 所述鈣化層（2 )和軟骨下骨層（3 )中的絲素蛋白與羥基磷灰石的質(zhì)量比例均為1:1。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有仿生界面結(jié)構(gòu)的一體化骨軟骨支架，其特征在于： 所述軟骨下骨層（3)的三維多孔結(jié)構(gòu)的孔徑范圍為250 μ πΓ425 μ m。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有仿生界面結(jié)構(gòu)的一體化骨軟骨支架，其特征在于： 所述鈣化層（2)的厚度小于500 μ m。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有仿生界面結(jié)構(gòu)的一體化骨軟骨支架，其特征在于： 所述軟骨層（1)與軟骨下骨層（3)的厚度比例為1 :1。
6. 按照權(quán)利要求1所述的一種具有仿生界面結(jié)構(gòu)的一體化骨軟骨支架的制備方法，其 特征在于：包括以下步驟： a. 石蠟微球模板制備 將石蠟微球放入聚乙烯模具中，烘干備用； b. 鈣化層（2)和軟骨下骨層（3)的制備 將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%絲素蛋白溶液和10%羥基磷灰石溶液按質(zhì)量比1:1的混勻，加入石 蠟微球模板中，抽吸真空，混合液充分填充，且高出石蠟微球模板一定距離，液氮冷卻后，室 溫靜置； c. 軟骨層（1)的制備 待鈣化層（2)表面微融后，將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的絲素蛋白溶液2mL緩慢加入模具中的鈣 化層（2)上，-80°C冷凍干燥成型； d. 絲素變構(gòu)和脫蠟 成型后從聚乙烯模具中取出，無水乙醇浸泡，濾蠟，晾干，即得骨軟骨支架。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種具有仿生界面結(jié)構(gòu)的一體化骨軟骨支架的制備方法，其 特征在于：所述絲素蛋白溶液的制備包括以下步驟： ① 蠶絲脫膠：按質(zhì)量比1:200將天然蠶絲加入0. 02mol/L的Na2C03溶液中，煮沸，反復(fù) 水洗，更換Na2C0 3溶液后重復(fù)煮沸、水洗，然后通風(fēng)晾干，得絲素絲； ② 絲素絲溶解液：按質(zhì)量比1:4將絲素絲加入0. 8g/mL的溴化鋰溶液中，60°C水浴中 磁力攪拌獲得； ③ 透析脫鹽：將絲素絲溶解液倒入截留分子量為1200(Γ14000的透析袋中，透析3天， 每天換水，離心，取上清，轉(zhuǎn)入截留分子量為3500的透析袋中，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的聚乙二醇 溶液中透析，離心取上清即得。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種具有仿生界面結(jié)構(gòu)的一體化骨軟骨支架的制備方法，其 特征在于：所述石蠟微球的制備包括以下步驟： ① 配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的聚乙烯醇溶液，加熱融化； ② 稱取60g石蠟塊，切碎，加入1080ml蒸餾水中，再加入120ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%聚乙烯 醇，加熱攪拌，冷卻，2(Γ80目篩網(wǎng)依次疊放，過篩； ③篩得石蠟微球用水反復(fù)沖洗，酒精除水、晾干，取4(Γ60目石蠟微球備用。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種具有仿生界面結(jié)構(gòu)的一體化骨軟骨支架的制備方法，其 特征在于：所述濾蠟技術(shù)應(yīng)用索氏提取器，溶劑為正己烷或者環(huán)己烷。
【文檔編號】A61L27/56GK104117097SQ201410397070
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年8月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月14日
【發(fā)明者】楊強(qiáng), 徐寶山, 丁曉明, 馬信龍, 趙艷紅, 王連永 申請人:天津市天津醫(yī)院