一種納米靶向緩控釋系統(tǒng)的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種納米靶向緩控釋系統(tǒng)的制備方法，所述方法包括以下步驟：步驟（a):制備殼聚糖包裹后的羧基碳納米管；步驟（b):制備接枝透明質(zhì)酸的殼聚糖修飾羧基碳納米管；步驟（c)：制備最終負載藥物的納米靶向緩控釋系統(tǒng)。本發(fā)明方法溫和簡單，所制備的羧基碳納米管藥物納米緩控釋靶向載體水溶性和分散性好，載藥率高，在腫瘤環(huán)境下釋放藥物量大且能夠持續(xù)一段時間，而在正常生理環(huán)境下釋放藥物量非常小。
【專利說明】一種納米靶向緩控釋系統(tǒng)的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物載體領(lǐng)域，具體是一種碳納米管納米靶向緩控釋系統(tǒng)的制備方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前腫瘤是威脅人類健康的嚴重疾病，已成為人類死亡的第二大病因。據(jù)2013年 最新的調(diào)查數(shù)據(jù)，就中國而言，每10萬個人中就有286人患癌,而在這286人中就會有181 人因為癌癥而失去生命。目前對于癌癥的治療，主要有手術(shù)治療、放射治療和化學治療。由 于腫瘤具有轉(zhuǎn)移性，而相對于手術(shù)和放射治療的定點治療，化學治療能夠作用于人體整個 生命系統(tǒng)，因此化學治療具有不可或缺的作用。但是由于目前的傳統(tǒng)化療藥物存在選擇性 差，分散性差的缺點，導致在殺死腫瘤細胞的同時也對正常細胞產(chǎn)生毒性，引起各種嚴重的 毒副作用，而其差的水溶性則大大降低其生物利用度，直接影響其應用于人體。同時隨著抗 腫瘤藥物的長期使用，腫瘤細胞也產(chǎn)生了多藥耐藥性，其多藥耐藥基因的出現(xiàn)導致抗腫瘤 藥物的藥效相對降低。因此研究一種新型的結(jié)合化學治療的藥物傳遞系統(tǒng)用于減小藥物使 用限制和對正常細胞的毒副作用和增強其作用效果就顯得極其必要了。
[0003] 隨著研究發(fā)現(xiàn)，碳納米管作為一種新型的材料，有著很多獨特而優(yōu)越的性能，包括 細胞膜穿透性、高表面積、藥物負載性、生物相容性、容易進行表面修飾、無免疫原特性等， 而這些特性都特別適合作為納米藥物靶向緩控釋系統(tǒng)的核心部分。外來物質(zhì)進入細胞膜其 中一種方式就是胞吞作用，這種方式是需要耗能的，同時也需要通過細胞膜的曲率改變而 發(fā)生。有研究表明碳納米管表面能較高，可以為胞吞提供一定的能量，長度在lOOnm左右的 納米管在改變細胞膜曲率方面更為容易些，另外它的納米尺寸和疏水性質(zhì)為其穿透磷脂雙 分子層提供便利。碳納米管是有片層的石墨烯結(jié)構(gòu)卷曲成的管狀物質(zhì)，能夠與蒽環(huán)類的物 質(zhì)通過π-π共軛的方式作用，利用其巨大的表面積和管狀空心結(jié)構(gòu)，可以容納負載更多 的抗腫瘤藥物，而且這種負載方式是非共價作用，相對于共價作用，其在物理化學環(huán)境改變 下更容易進行解吸附。不過其水溶性差、容易團聚的缺點也是不容忽視的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對上述存在的問題，提供一種采用透明質(zhì)酸、殼聚糖修飾羧基碳納米管 制備納米靶向緩控釋系統(tǒng)的方法，即利用殼聚糖帶正電荷與帶負電荷的羧基碳納米管進行 物理包裹，然后利用透明質(zhì)酸的羧基與殼聚糖的氨基進行酰胺化接枝，以改善羧基碳納米 管的水溶性、分散性，以及賦予其緩控釋和靶向的功能。
[0005] 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：
[0006] -種納米靶向緩控釋系統(tǒng)的制備方法，所述方法包括以下步驟：
[0007] 步驟（a):將羧基碳納米管分散于超純水中，加入殼聚糖溶液后進行超聲處理，然 后進行磁力攪拌處理，將攪拌后的混合液透析，真空干燥透析后的產(chǎn)物，得到殼聚糖包裹后 的羧基碳納米管；
[0008] 步驟（b):將殼聚糖包裹后的羧基碳納米管分散于磷酸緩沖液中，加入經(jīng)1-(3-二 甲氨基丙基）-3_乙基碳二亞胺（EDC)活化后的透明質(zhì)酸溶液進行超聲處理，然后加入 N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)進行磁力攪拌處理，將攪拌后的混合液透析，真空干燥透析后的 產(chǎn)物，得到接枝上透明質(zhì)酸的殼聚糖修飾羧基碳納米管；
[0009] 步驟（c):將接枝上透明質(zhì)酸后的殼聚糖修飾羧基碳納米管分散于磷酸緩沖液 中，加入蒽環(huán)類藥物，超聲處理，然后進行磁力攪拌處理，將攪拌后的混合液進行離心處理， 用磷酸緩沖液洗滌游離蒽環(huán)類藥物，最后對負載了藥物的接枝上透明質(zhì)酸的殼聚糖修飾羧 基碳納米管進行真空干燥，得到最終負載藥物的納米靶向緩控釋系統(tǒng)。
[0010] 優(yōu)選的，所用碳納米管為單壁羧基碳納米管或多壁羧基碳納米管。
[0011] 優(yōu)選的，所述羧基碳納米管水分散液濃度為1?10mg/ml。
[0012] 優(yōu)選的，所述殼聚糖溶液濃度要求為1?l〇mg/ml。
[0013] 優(yōu)選的，所述透明質(zhì)酸溶液濃度要求為1?10mg/ml。
[0014] 優(yōu)選的，所述殼聚糖與羧基碳納米管的質(zhì)量比為1 :1?1 :1〇,所述透明質(zhì)酸與殼 聚糖改性后的羧基碳納米管質(zhì)量比為1 :1?1 :1〇。
[0015] 優(yōu)選的，所述蒽環(huán)類藥物為阿霉素或者表阿霉素或者鹽酸阿霉素，所述蒽環(huán)類藥 物濃度為1?l〇mg/ml。
[0016] 優(yōu)選的，所述步驟（a)、（b)、（c)中超聲處理為20KHZ?100KHZ的頻率的超聲波處 理10?60min，所述的攪拌處理是在20?37°C下攪拌12?36小時，所述真空干燥溫度為 20 ?40°C。
[0017] 優(yōu)選的，所述透析處理用透析袋分子截留量為1000?20000Da。
[0018] 優(yōu)選的，所述步驟（c)中離心處理所用轉(zhuǎn)速為1000?5000rpm。
[0019] 殼聚糖是自然界中的一種帶正電的多糖，其優(yōu)越的生物相容性和生物降解性一直 被應用于藥物制劑中，它能夠通過靜電作用與帶負電的碳納米管復合，降低碳納米管的細 胞毒性，同時由于它的pKa在6. 5左右，使得它在生理pH下溶解度小，而在腫瘤pH (較酸性 環(huán)境）下溶解度增加，復合后的材料具備pH敏感性。為了使材料具備靶向功能，因此利用 酰胺化反應而接上透明質(zhì)酸。另外透明質(zhì)酸中大量的羧基也為材料的親水性改善提供幫 助。通過對這三種材料的研究，以碳納米管為核心，包裹殼聚糖以及接枝上透明質(zhì)酸制備的 納米藥物靶向緩控釋系統(tǒng)，其具有強大的載藥能力，定向選擇腫瘤細胞，pH敏感性緩控釋功 能，為腫瘤的有效治療和減小化療藥物毒副作用提供一種可能性。
[0020] 本發(fā)明方法溫和簡單，所制備的羧基碳納米管藥物納米緩控釋靶向載體水溶性和 分散性好，載藥率高，在腫瘤環(huán)境下釋放藥物量大且能夠持續(xù)一段時間，而在正常生理環(huán)境 下釋放藥物量非常小，通過細胞毒性實驗可以得出，相同濃度下使用該載藥系統(tǒng)對腫瘤細 胞的殺害作用大于單純用藥，而對普通細胞的傷害作用則遠小于單純用藥。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1不同修飾單壁碳納米管的透射電鏡圖：其中（a)單壁碳納米管，（b)殼聚糖 修飾的單壁碳納米管，（c)、（d)負載DOX (強力霉素）的透明質(zhì)酸殼聚糖修飾的單壁碳納米 管；
[0022] 圖2不同修飾單壁碳納米管對DOX(強力霉素）的載藥率；
[0023] 圖3不同修飾單壁碳納米管負載D0X(強力霉素）在不同pH下的釋放：其中（A) pH = 7. 4, (B)pH = 5. 5 ；
[0024] 圖4不同修飾單壁碳納米管對3T3成纖維細胞和Hela細胞的毒性圖；
[0025] 圖5不同濃度下各種修飾單壁碳納米管對Hela細胞的毒性圖。
[0026] 具體實施案例
[0027] 下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施 例。
[0028] 實施例1
[0029] 以成都有機化學研究所購買的羧基單壁碳納米管為原料，物理包裹上殼聚糖后， 通過接枝透明質(zhì)酸靶向化，以鹽酸阿霉素為模型藥物，得到透明質(zhì)酸靶向的殼聚糖改性羧 基單壁碳納米管鹽酸阿霉素靶向藥物載體，其具體步驟如下：
[0030] 步驟（a):將10mg羧基碳納米管分散于10ml超純水中，將10mg殼聚糖溶于5ml 醋酸緩沖溶液（稀酸溶液都可以溶解包括醋酸、硫酸、鹽酸等），將兩液混合后進行以80kHZ 超聲處理20min，然后37°C下進行磁力攪拌16小時，將攪拌后的混合液透析3日，24小時換 一次超純水，透析處理用透析袋分子截留量為lOOODa，真空干燥透析后的產(chǎn)物，得到殼聚糖 包裹后的羧基碳納米管。
[0031] 步驟（b) :10mg殼聚糖改性后的羧基碳納米管分散于20ml pH = 7. 4磷酸緩沖液 中，加入10mg透明質(zhì)酸、lOmgEDC · HCL與2mgNHS進行以80kHZ超聲處理20min，然后37°C 下進行磁力攪拌16小時，將攪拌后的混合液透析3日，每24小時換一次超純水，透析處理 用透析袋分子截留量為l〇〇〇Da，真空干燥透析后的產(chǎn)物，得到納米靶向緩控釋藥物載體。
[0032] 步驟（c):將10mg接枝上透明質(zhì)酸后的殼聚糖修飾羧基碳納米管分散于20mlpH =7. 4磷酸緩沖液中，加入15mg鹽酸阿霉素，以80kHZ超聲處理20min，然后37°C下進行磁 力攪拌16小時，將攪拌后的混合液以5000rpm轉(zhuǎn)速進行離心10min處理，用磷酸緩沖液洗 滌游離鹽酸阿霉素。最后對負載了鹽酸阿霉素的接枝上透明質(zhì)酸的殼聚糖修飾羧基碳納米 管進行真空干燥，得到最終負載藥物的納米靶向緩控釋系統(tǒng)。
[0033] 實施例2
[0034] 以成都有機化學研究所購買的羧基單壁碳納米管為原料，物理包裹上殼聚糖后， 通過接枝透明質(zhì)酸靶向化，以鹽酸阿霉素為模型藥物，得到透明質(zhì)酸靶向的殼聚糖改性羧 基單壁碳納米管鹽酸阿霉素靶向藥物載體，其具體步驟如下：
[0035] 步驟（a):將20mg羧基碳納米管分散于10ml超純水中，將2mg殼聚糖溶于2ml醋 酸緩沖溶液，將兩液混合后進行以l〇〇kHZ超聲處理20min，然后37°C下進行磁力攪拌24 小時，將攪拌后的混合液透析3日，24小時換一次超純水，透析處理用透析袋分子截留量為 20000Da，真空干燥透析后的產(chǎn)物，得到殼聚糖包裹后的羧基碳納米管。
[0036] 步驟（b):將20mg殼聚糖改性后的羧基碳納米管分散于10ml pH = 7. 4磷酸緩沖 液中，加入5mg透明質(zhì)酸、5mgEDC，HCL與2mgNHS進行以100kHZ超聲處理20min，然后37°C 下進行磁力攪拌24小時，將攪拌后的混合液透析3日，每24小時換一次超純水，透析處理 用透析袋分子截留量為20000Da，真空干燥透析后的產(chǎn)物，得到納米靶向緩控釋藥物載體。
[0037] 步驟（c):將10mg接枝上透明質(zhì)酸后的殼聚糖修飾羧基碳納米管分散于20mlpH =7· 4磷酸緩沖液中，加入15mg阿霉素，以lOOkHZ超聲處理20min，然后37°C下進行磁力 攪拌24小時，將攪拌后的混合液以2000rpm轉(zhuǎn)速進行離心lOmin處理，用磷酸緩沖液洗漆 游離阿霉素。最后對負載了阿霉素的接枝上透明質(zhì)酸的殼聚糖修飾羧基碳納米管進行真空 干燥，得到最終負載藥物的納米靶向緩控釋系統(tǒng)。
[0038] 實施例3
[0039] 以成都有機化學研究所購買的單壁碳納米管為原料，物理包裹上殼聚糖后，通過 接枝透明質(zhì)酸靶向化，以阿霉素為模型藥物，得到透明質(zhì)酸靶向的殼聚糖改性羧基單壁碳 納米管鹽酸阿霉素靶向藥物載體，其具體步驟如下：
[0040] 步驟（a):將10mg單壁碳納米管分散于1ml超純水中，將20mg殼聚糖溶于20ml 醋酸緩沖溶液，將兩液混合后進行以80kHZ超聲處理50min，然后20°C下進行磁力攪拌36 小時，將攪拌后的混合液透析3日，24小時換一次超純水，透析處理用透析袋分子截留量為 lOOOODa，真空干燥透析后的產(chǎn)物，得到殼聚糖包裹后的羧基碳納米管。
[0041] 步驟（b) :10mg殼聚糖改性后的單壁碳納米管分散于20ml pH = 7. 4磷酸緩沖液 中，加入lmg透明質(zhì)酸、2mgEDC · HCL與lmgNHS進行以80kHZ超聲處理50min，然后20°C下 進行磁力攪拌36小時，將攪拌后的混合液透析3日，每24小時換一次超純水，透析處理用 透析袋分子截留量為l〇〇〇〇Da，真空干燥透析后的產(chǎn)物，得到納米靶向緩控釋藥物載體。
[0042] 步驟（c):將10mg接枝上透明質(zhì)酸后的殼聚糖修飾單壁碳納米管分散于20mlpH =7. 4磷酸緩沖液中，加入15mg表阿霉素，以80kHZ超聲處理50min，然后20°C下進行磁力 攪拌36小時，將攪拌后的混合液以lOOOrpm轉(zhuǎn)速進行離心lOmin處理，用磷酸緩沖液洗漆 游離表阿霉素。最后對負載了表阿霉素的接枝上透明質(zhì)酸的殼聚糖修飾羧基碳納米管進行 真空干燥，得到最終負載藥物的納米靶向緩控釋系統(tǒng)。
[0043] 將不同修飾的載藥單壁碳納米管用Hela細胞和3T3成纖維細胞粒子進行細胞實 驗，結(jié)果用以分析材料對正常細胞和腫瘤細胞的毒性，從而評價材料的靶向性能、控釋性 能、抗腫瘤性能和生物相容性等。根據(jù)圖1?圖5可以看出，從單壁碳納米管、殼聚糖修飾單 壁碳納米管、透明質(zhì)酸殼聚糖修飾單壁碳納米管對兩種細胞的實驗數(shù)據(jù)可以看出，單壁碳 納米管本身帶有微弱毒性，用殼聚糖和透明質(zhì)酸修飾后，無論對3T3成纖維細胞還是Hela 細胞，毒性均明顯降低。同一種材料對兩種不同細胞的毒性作用也有所不同，材料對Hela 細胞的毒性是大于3T3成纖維細胞，所以Hela細胞較之于3T3成纖維細胞，在相同濃度下 攝取的材料更多，引起的毒性更大。
[0044] 實施例4 :
[0045] 以成都有機化學研究所購買的多壁碳納米管為原料，物理包裹上殼聚糖后，通過 接枝透明質(zhì)酸靶向化，以阿霉素為模型藥物，得到透明質(zhì)酸靶向的殼聚糖改性羧基單壁碳 納米管鹽酸阿霉素靶向藥物載體，其具體步驟如下：
[0046] 步驟（a):將10mg多壁碳納米管分散于10ml超純水中，將25mg殼聚糖溶于2. 5ml 醋酸緩沖溶液，將兩液混合后進行以20kHZ超聲處理60min，然后25°C下進行磁力攪拌24 小時，將攪拌后的混合液透析3天，每天換一次超純水，透析處理用透析袋分子截留量為 8000Da，真空干燥透析后的產(chǎn)物，得到殼聚糖包裹后的羧基碳納米管；
[0047] 步驟（b) :10mg殼聚糖改性后的單壁碳納米管分散于5ml pH = 7. 4磷酸鹽緩沖液 中，加入lmg透明質(zhì)酸、2mgEDOHCL與lmgNHS進行以lOOkHZ超聲處理30min，然后25°C下 進行磁力攪拌24小時，將攪拌后的混合液透析3天，每天換一次超純水，透析處理用透析袋 分子截留量為8000Da，真空干燥透析后的產(chǎn)物，得到納米靶向緩控釋藥物載體；
[0048] 步驟（c):將10mg接枝上透明質(zhì)酸后的殼聚糖修飾多壁碳納米管分散于30ml、pH =7. 4磷酸緩沖液中，加入20mg鹽酸阿霉素，以lOOkHZ超聲處理30min，然后25°C下進行 磁力攪拌24小時，將攪拌后的混合液以5000rpm轉(zhuǎn)速進行離心處理20min，用磷酸鹽緩沖液 洗滌游離鹽酸阿霉素。最后對負載了鹽酸阿霉素的接枝上透明質(zhì)酸的殼聚糖修飾羧基碳納 米管進行真空干燥，得到最終負載藥物的納米靶向緩控釋系統(tǒng)。
[0049] 實施例4得到的負載阿霉素后的殼聚糖透明質(zhì)酸的改性多壁碳納米管抗癌藥物 靶向緩控釋載體具有較好的水溶性，載藥率較單壁碳納米管稍大，可達121. 35± 1. 64%。
【權(quán)利要求】
1. 一種納米靶向緩控釋系統(tǒng)的制備方法，其特征在于：所述方法包括以下步驟： 步驟（a):將羧基碳納米管分散于超純水中，加入殼聚糖溶液后進行超聲處理，然后進 行磁力攪拌處理，將攪拌后的混合液透析，真空干燥透析后的產(chǎn)物，得到殼聚糖包裹后的羧 基碳納米管； 步驟（b):將殼聚糖包裹后的羧基碳納米管分散于磷酸緩沖液中，加入經(jīng)1-(3-二甲氨 基丙基）-3-乙基碳二亞胺活化后的透明質(zhì)酸溶液進行超聲處理，然后加入N-羥基琥珀酰 亞胺進行磁力攪拌處理，將攪拌后的混合液透析，真空干燥透析后的產(chǎn)物，得到接枝上透明 質(zhì)酸的殼聚糖修飾羧基碳納米管； 步驟（c):將接枝上透明質(zhì)酸后的殼聚糖修飾羧基碳納米管分散于磷酸緩沖液中，力口 入蒽環(huán)類藥物，超聲處理，然后進行磁力攪拌處理，將攪拌后的混合液進行離心處理，用磷 酸緩沖液洗滌游離蒽環(huán)類藥物，最后對負載了藥物的接枝上透明質(zhì)酸的殼聚糖修飾羧基碳 納米管進行真空干燥，得到最終負載藥物的納米靶向緩控釋系統(tǒng)。
2. 如權(quán)利要求1所述的納米靶向緩控釋系統(tǒng)的制備方法，其特征在于：所述碳納米管 為單壁羧基碳納米管或多壁羧基碳納米管。
3. 如權(quán)利要求1所述的納米靶向緩控釋系統(tǒng)的制備方法，其特征在于：所述羧基碳納 米管水分散液濃度為1?l〇mg/ml。
4. 如權(quán)利要求1所述的納米靶向緩控釋系統(tǒng)的制備方法，其特征在于：所述殼聚糖溶 液濃度要求為1?l〇mg/ml。
5. 如權(quán)利要求1所述的納米靶向緩控釋系統(tǒng)的制備方法，其特征在于：所述透明質(zhì)酸 溶液濃度要求為1?l〇mg/ml。
6. 如權(quán)利要求1所述的納米靶向緩控釋系統(tǒng)的制備方法，其特征在于：所述殼聚糖與 羧基碳納米管的質(zhì)量比為1 :1?1 :1〇,所述透明質(zhì)酸與殼聚糖改性后的羧基碳納米管質(zhì)量 比為1 :1?1 :10。
7. 如權(quán)利要求1所述的納米靶向緩控釋系統(tǒng)的制備方法，其特征在于：所述蒽環(huán)類藥 物為阿霉素或者表阿霉素或者鹽酸阿霉素，所述蒽環(huán)類藥物濃度為1?l〇mg/ml。
8. 如權(quán)利要求1所述的納米靶向緩控釋系統(tǒng)的制備方法，其特征在于：所述步驟（a)、 (b)、（c)中超聲處理為20KHZ?100KHZ的頻率的超聲波處理10?60min，所述的攪拌處理 是在20?37°C下攪拌12?36小時，所述真空干燥溫度為20?40°C。
9. 如權(quán)利要求1所述的納米靶向緩控釋系統(tǒng)的制備方法，其特征在于：所述透析處理 用透析袋分子截留量為1000?20000Da。
10. 如權(quán)利要求1所述的納米靶向緩控釋系統(tǒng)的制備方法，其特征在于：所述步驟（c) 中離心處理所用轉(zhuǎn)速為1000?5000rpm。
【文檔編號】A61K47/36GK104208010SQ201410406552
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年8月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月18日
【發(fā)明者】郭瑞, 熊勝全 申請人:廣州貝奧吉因生物科技有限公司