高甘露糖蛋白質(zhì)和產(chǎn)生高甘露糖蛋白質(zhì)的方法
【專利摘要】本發(fā)明表征了一種生產(chǎn)高甘露糖葡糖腦苷脂酶(hmGCB)的方法，包括：提供一種能表達葡糖腦苷脂酶(GCB)的細(xì)胞；在防止去除遠離GCB前體寡糖的五糖核心的至少一個甘露糖殘基的條件下生產(chǎn)含有前體寡糖的GCB，從而生產(chǎn)一種hmGCB制劑。優(yōu)選地，防止去除遠離五糖核心的至少一個甘露糖殘基的條件是抑制1類加工甘露糖苷酶和/或2類加工甘露糖苷酶。本發(fā)明也表征了一種hmGCB制劑和使用hmGCB制劑的方法。
【專利說明】高甘露糖蛋白質(zhì)和產(chǎn)生高甘露糖蛋白質(zhì)的方法
[0001] 本申請是申請日為2001年8月17日、發(fā)明名稱為"高甘露糖蛋白質(zhì)和產(chǎn)生高甘露 糖蛋白質(zhì)的方法"的中國發(fā)明專利申請No. 01802801. 2的分案申請。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 戈謝?。℅aucher病）是一種常染色體隱性溶酶體貯積病，其特征在于溶酶體 酶葡糖腦苷脂酶（GCB)缺乏。GCB水解在白細(xì)胞和紅細(xì)胞膜中的鞘糖脂降解后形成的糖 脂葡糖腦苷脂。該酶的缺乏導(dǎo)致葡糖腦苷脂在位于戈謝病患者的肝臟、脾臟和骨髓中的 吞噬細(xì)胞溶酶體中大量積累。這些分子的積累引起多種臨床表現(xiàn)，包括脾腫大、肝腫大、 骨骼疾病、血小板減少和貧血（Beutler等人，戈謝病；《遺傳性疾病的代謝和分子基礎(chǔ)》 (McGraw-Hill, Inc.，紐約，1995)，第 2625-2639 頁）。
[0004] 該病患者的治療包括施用止痛劑以緩解骨痛、血液和血小板輸注，以及某些情況 下的脾切除術(shù)。對于骨腐爛的患者關(guān)節(jié)置換術(shù)有時也是必要的。
[0005] 用GCB進行酶置換治療已經(jīng)作為戈謝病的一種療法。當(dāng)前對戈謝病患者的治療包 括施用碳水化合物重建（remodel)的GCB，它來源于人胎盤或用GCB表達構(gòu)件轉(zhuǎn)染的中國倉 鼠卵巢（CHO)細(xì)胞，分別被稱為阿糖苷酶（alglucerase)或imiglucerase。這種治療極其 昂貴，部分是由于為了將該酶導(dǎo)向網(wǎng)狀內(nèi)皮來源細(xì)胞上的甘露糖受體，從GCB中除去糖以 暴露復(fù)合聚糖的三甘露糖基核心的成本。人胎盤組織的缺乏（在阿糖苷酶情況中）、復(fù)雜純 化方案和需要的相對大量的碳水化合物重建的GCB全都計入治療成本。
[0006] 發(fā)明概述
[0007] 本發(fā)明部分基于以下發(fā)現(xiàn)，防止去除遠離蛋白質(zhì)（如一種溶酶體貯積酶）前體寡 糖鏈五糖核心的一個或多個甘露糖殘基，能獲得高甘露糖蛋白質(zhì)，如高甘露糖葡糖腦苷脂 酶（hmGCB)。這些高甘露糖蛋白質(zhì)能用來將蛋白質(zhì)導(dǎo)向表達甘露糖受體的細(xì)胞。這些細(xì)胞 包括網(wǎng)狀內(nèi)皮來源的細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、枯否細(xì)胞和組織細(xì)胞。因此，這些高甘露糖蛋白 質(zhì)能用來例如將受體介導(dǎo)的胞吞輸送定向溶酶體，以治療多種溶酶體貯積病。
[0008] 特別是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)hmGCB可有效地定向甘露糖受體。甘露糖受體存在于巨噬細(xì)胞 和其它細(xì)胞（如樹突細(xì)胞、心肌細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞）上，有助于受體介導(dǎo)的胞吞。戈謝病 患者中GCB的缺乏導(dǎo)致葡糖腦苷脂主要在網(wǎng)狀內(nèi)皮來源的細(xì)胞（包括巨噬細(xì)胞、枯否細(xì)胞 和組織細(xì)胞）中積累。由于這些細(xì)胞在其表面表達甘露糖受體，能用hmGCB通過受體介導(dǎo) 的胞吞作用將校正酶的輸送有效地定向溶酶體，從而治療戈謝病。令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)巨噬 細(xì)胞對hmGCB的攝取比細(xì)胞分泌的GCB的攝取增多。
[0009] 因此，一方面，本發(fā)明表征一種生產(chǎn)高甘露糖葡糖腦苷脂酶（hmGCB)制劑的方法。 該方法包括：
[0010] 提供一種能表達GCB的細(xì)胞；和
[0011] 在防止去除遠離GCB前體寡糖的五糖核心的至少一個甘露糖殘基的條件下生產(chǎn) 含有前體寡糖的GCB，從而生產(chǎn)一種hmGCB制劑。
[0012] 在一個優(yōu)選實施方案中，GCB是人GCB。在一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞是人細(xì)胞。
[0013] 在一個優(yōu)選實施方案中，防止去除遠離五糖核心的一個或多個α 1，2甘露糖殘 基；遠離五糖核心的α 1，3甘露糖殘基；和/或防止去除遠離五糖核心的α 1，6甘露糖殘 基。優(yōu)選地，防止去除遠離五糖核心的一個或多個α 1，2甘露糖殘基。
[0014] 在一個優(yōu)選實施方案中，該方法包括使細(xì)胞接觸一種物質(zhì)，該物質(zhì)可防止去除遠 離GCB前體寡糖五糖核心的至少一個甘露糖殘基，例如防止去除遠離五糖核心的一個或多 個α 1，2甘露糖殘基，遠離五糖核心的α 1，3甘露糖殘基和/或遠離五糖核心的α 1，6甘 露糖殘基。優(yōu)選地，防止去除遠離五糖核心的一個或多個α 1，2甘露糖殘基。
[0015] 在一個優(yōu)選實施方案中，該方法包括使細(xì)胞接觸一種物質(zhì)，該物質(zhì)可防止去除遠 離GCB前體寡糖五糖核心的至少一個甘露糖殘基，其中該物質(zhì)是一種甘露糖苷酶抑制劑。 該甘露糖苷酶抑制劑可以是1類加工甘露糖苷酶抑制劑、2類加工甘露糖苷酶抑制劑或此 兩者。1類加工甘露糖苷酶抑制劑可以是kifunensine、deoxymannojirimycin或類似抑制 劑中的一種或多種。優(yōu)選地，1類加工甘露糖苷酶抑制劑是kifunensine。有用的2類加工甘 露糖苷酶抑制劑可包括苦馬?素、mannostatin、6_脫氧-1，4-雙脫氧-1，4-亞氨基-D-甘 露糖醇（6-脫氧-DM)和6-脫氧-6-氟-1，4-亞氨基-D-甘露糖醇（6-脫氧-6-氟-DM) 中的一種或多種。優(yōu)選地，2類加工甘露糖苷酶抑制劑是苦馬豆素。
[0016] 在一個優(yōu)選實施方案中，甘露糖苷酶抑制劑以約0· 025-20. 0 μ g/ml、0. 05-10 μ g/ ml、0. 05-5 μ g/ml、優(yōu)選地約 0· 1_2· 0 μ g/ml 的濃度存在。
[0017] 在一個優(yōu)選實施方案中，該方法還包括使細(xì)胞接觸1類加工甘露糖苷酶抑制劑 和2類加工甘露糖苷酶抑制劑。在一個優(yōu)選實施方案中，1類加工甘露糖苷酶抑制劑以 約 0· 025-20. 0 μ g/ml、0· 05-10 μ g/ml、0· 05-5 μ g/ml、優(yōu)選地約 0· 1-2. 0 μ g/ml 的濃度存 在；2類加工甘露糖苷酶抑制劑以約0. 025-20. 0 μ g/ml、0. 05-10 μ g/ml、0. 05-5 μ g/ml、優(yōu) 選地約0. 1-2. 0 μ g/ml的濃度存在；I類加工和2類加工甘露糖苷酶抑制劑的每一種以約 0· 025-20. 0 μ g/ml、0· 05-10 μ g/ml、0· 05-5 μ g/ml、優(yōu)選地約 0· 1-2. 0 μ g/ml 的濃度存在； 1類加工和2類加工甘露糖苷酶抑制劑的總濃度約為0. 025-40. 0 μ g/ml、0. 05-20 μ g/ml、 0· 05-10 μ g/ml，優(yōu)選地約 0· 1-4. 0 μ g/ml。
[0018] 在一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞具有至少一種高爾基體加工甘露糖苷酶的突變，如 敲除。該突變可以是降低基因表達、降低蛋白質(zhì)或活性水平，或改變甘露糖苷酶分布，或其 它翻譯后修飾如糖鏈加工的突變。該突變可以降低高爾基體加工甘露糖苷酶活性水平，例 如降低基因表達，如無效突變，如缺失、移碼或插入。在一個優(yōu)選實施方案中，該突變是敲 除，例如甘露糖苷酶基因中的敲除。該突變能影響結(jié)構(gòu)（和蛋白質(zhì)活性），例如可以是一種 溫度敏感突變或截短。在一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞具有1類加工甘露糖苷酶、2類加工甘 露糖苷酶、1類加工甘露糖苷酶和2類加工甘露糖苷酶的突變，例如敲除。在一個優(yōu)選實施 方案中，1類加工甘露糖苷酶是：高爾基體甘露糖苷酶IA ;高爾基體甘露糖苷酶IB ;高爾基 體甘露糖苷酶IC ;或其組合。在一個優(yōu)選實施方案中，2類加工甘露糖苷酶是高爾基體甘露 糖苷酶II。
[0019] 在一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞包含一種核酸序列，如反義分子或核酶，它能結(jié)合或 滅活一種細(xì)胞甘露糖苷酶核酸序列，如mRNA，并抑制該蛋白質(zhì)的表達。在一個優(yōu)選實施方案 中，該核酸序列是：1類加工甘露糖苷酶反義分子；2類加工甘露糖苷酶反義分子；1類加工 甘露糖苷酶反義分子和2類加工甘露糖苷酶反義分子兩者。在一個優(yōu)選實施方案中，1類加 工甘露糖苷酶是：高爾基體甘露糖苷酶IA ;高爾基體甘露糖苷酶IB ;高爾基體甘露糖苷酶 IC ;及其組合。在一個優(yōu)選實施方案中，2類加工甘露糖苷酶是高爾基體甘露糖苷酶II。
[0020] 在一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞包含一種可結(jié)合并抑制甘露糖苷酶的分子，如一種 外源分子。該分子可以是，例如一種單鏈抗體、胞內(nèi)蛋白或競爭性或非競爭性抑制劑。
[0021] 在一個優(yōu)選實施方案中，hmGCB分子包含一條至少含4個甘露糖殘基的糖鏈。例 如，hmGCB分子具有至少一條含5個甘露糖殘基的糖鏈，hmGCB分子具有至少一條含6個甘 露糖殘基的糖鏈，hmGCB分子具有至少一條含7個甘露糖殘基的糖鏈，hmGCB分子具有至少 一條含8個甘露糖殘基的糖鏈，hmGCB分子具有至少一條含9個甘露糖殘基的糖鏈。優(yōu)選 地，hmGCB分子具有至少一條含5個、8個或9個甘露糖殘基的糖鏈。
[0022] 在一個優(yōu)選實施方案中，產(chǎn)生的hmGCB (-種或多種hmGCB分子或整個制劑）中甘 露糖殘基與GIcNAc殘基之比大于3個甘露糖殘基比2個GIcNAc殘基，優(yōu)選地，甘露糖與 61。嫩。之比為4:2、5:2、6:2、7:2、8:2、9:2，更優(yōu)選地，甘露糖與61〇嫩。之比為5:2、8:2或 9:2 〇
[0023] 在一個優(yōu)選實施方案中，在hmGCB分子的1、2、3或4條糖鏈上防止去除遠離五糖 核心的一個或多個甘露糖殘基。
[0024] 在一個優(yōu)選實施方案中，制劑中至少30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、98%、99%或全部的hmGCB分子含有至少1條、優(yōu)選地2條、3條或4條糖 鏈，其中防止去除遠離五糖核心的一個或多個甘露糖殘基。
[0025] 在一個優(yōu)選實施方案中，hmGCB制劑是一種相對異源的制劑。優(yōu)選地，除了五糖 核心外，hmGCB 中不到 80%、70%、60%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、 10 %、5 %或1 %的糖鏈含有相同數(shù)量的甘露糖殘基。例如，除五糖核心之外含有相同數(shù)量 甘露糖殘基的糖鏈與含有不同數(shù)量甘露糖殘基的糖鏈之比約為：60% :40% ;50% :50% ; 40% :60%;30% :70%;25% :75%;20% :80%;15% :85%;10% :90%;5%或更低：95% 或更1?。
[0026] 在一個優(yōu)選實施方案中，高爾基體甘露糖苷酶IA和/或IB和/或IC的活性被抑 制，hmGCB 制劑中至少約 60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%的糖 鏈含有5個或5個以上甘露糖殘基，例如5、6、7、8和/或9個甘露糖殘基。在一個優(yōu)選實 施方案中，高爾基體甘露糖苷酶I的活性被抑制，含有5個或更多甘露糖殘基的糖鏈與含有 4個或更少甘露糖殘基的糖鏈之比約為：60% :40% ;70% :30% ;75% :25% ;80% :20% ; 85% :15% ;90% :10% ;95% :5% ;99% :1% ;或 100% :0%。
[0027] 在一個優(yōu)選實施方案中，高爾基體甘露糖苷酶II的活性被抑制，hmGCB制劑中至 少約60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%的糖鏈含有5個或5個 以上甘露糖殘基，例如5、6、7、8和/或9個甘露糖殘基。在一個優(yōu)選實施方案中，高爾基 體甘露糖苷酶Π 的活性被抑制，含有5個或更多甘露糖殘基的糖鏈與含有4個或更少甘 露糖殘基的糖鏈之比約為：60% :40% ;70% :30% ;75% :25% ;80% :20% ;85% :15% ; 90% :10% ;95% :5% ;99% :1% ;或 100% :0%。
[0028] 在一個優(yōu)選實施方案中，該細(xì)胞包含一種含有GCB編碼區(qū)的外源核酸序列。在一 個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞還包含一種調(diào)節(jié)序列，一種內(nèi)源或外源調(diào)節(jié)序列，其作用是調(diào)節(jié)外 源GCB編碼區(qū)的表達。
[0029] 在一個優(yōu)選實施方案中，該細(xì)胞包含一種外源調(diào)節(jié)序列，其作用是調(diào)節(jié)內(nèi)源GCB 編碼序列的表達，例如，調(diào)節(jié)序列整合到細(xì)胞基因組中，使其調(diào)節(jié)內(nèi)源GCB編碼序列的表 達。
[0030] 在一個優(yōu)選實施方案中，調(diào)節(jié)序列包括下列之一種或多種：啟動子、增強子、上游 激活序列（UAS)、支架結(jié)構(gòu)附著區(qū)或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。在一個優(yōu)選實施方案中，調(diào)節(jié)序列 包括：來自金屬硫蛋白-I基因（例如小鼠金屬硫蛋白-I基因）的調(diào)節(jié)序列、來自SV-40基 因的調(diào)節(jié)序列、來自巨細(xì)胞病毒基因的調(diào)節(jié)序列、來自膠原蛋白基因的調(diào)節(jié)序列、來自肌動 蛋白基因的調(diào)節(jié)序列、來自免疫球蛋白基因的調(diào)節(jié)序列、來自HMG-CoA還原酶基因的調(diào)節(jié) 序列，或來自EF-Ια基因的調(diào)節(jié)序列。
[0031] 在一個優(yōu)選實施方案中，該細(xì)胞是一種真核細(xì)胞。在一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞是 真菌、植物或動物來源的，例如脊椎動物來源的。在一個優(yōu)選實施方案中，該細(xì)胞是一種哺 乳動物細(xì)胞，例如初級或次級哺乳動物細(xì)胞，例如成纖維細(xì)胞、造血干細(xì)胞、成肌細(xì)胞、角化 細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、含有血液有形成分的細(xì)胞、肌細(xì)胞和 這些體細(xì)胞的前體；轉(zhuǎn)化的或無限增殖化細(xì)胞系。優(yōu)選地，該細(xì)胞是人細(xì)胞。在本方法中有 用的無限增殖化人細(xì)胞系的例子包括但不限于：Bowes黑素瘤細(xì)胞（ATCC保藏號CRL9607)、 Daudi細(xì)胞（ATCC保藏號CCL213)、HeLa細(xì)胞和HeLa細(xì)胞衍生物（ATCC保藏號CCL2CCL2. 1 和 CCL2. 2)、HL-60 細(xì)胞（ATCC 保藏號 CCL240)、HT-1080 細(xì)胞（ATCC 保藏號 CCL121)、Jurkat 細(xì)胞（ATCC保藏號TIB152)、KB癌細(xì)胞（ATCC保藏號CCL17)、K-562白血病細(xì)胞（ATCC保 藏號CCL243)、MCF-7乳腺癌細(xì)胞（ATCC保藏號BTH22)、M0LT-4細(xì)胞（ATCC保藏號1582)、 Namalwa 細(xì)胞（ATCC 保藏號 CRL1432)、Raji 細(xì)胞（ATCC 保藏號 CCL86)、RPMI8226 細(xì)胞（ATCC 保藏號CCL155)、U-937細(xì)胞（ATCC保藏號1593)、WI-28VA13亞系2R4細(xì)胞（ATCC保藏號 CCL155) XCRF-CEM細(xì)胞（ATCC保藏號 CCL119)和 2780AD 卵巢癌細(xì)胞（Van Der Blick等人， Cancer Res. 48:5927-5932, 1988)，以及人細(xì)胞與其它種的細(xì)胞融合產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞。在 另一個實施方案中，無限增殖化細(xì)胞系可以是人細(xì)胞系之外的細(xì)胞系，如CHO細(xì)胞系、COS 細(xì)胞系。在另一個實施方案中，細(xì)胞可以來自克隆細(xì)胞株或克隆細(xì)胞系。
[0032] 在一個優(yōu)選實施方案中，提供能表達hmGCB的細(xì)胞群體，至少30%、40%、50%、 60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或全部細(xì)胞產(chǎn)生至少含有1條糖鏈、優(yōu) 選地2、3或4條糖鏈的hmGCB分子，它們含有特定數(shù)量的甘露糖殘基。
[0033] 在一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞在含有至少一種甘露糖苷酶抑制劑的培養(yǎng)基中培 養(yǎng)。在一個優(yōu)選實施方案中，該方法還包括從培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中獲得hmGCB。
[0034] 另一方面，本發(fā)明表征了一種生產(chǎn)hmGCB制劑的方法。該方法包括：
[0035] 提供一種能表達GCB的細(xì)胞；和
[0036] 在抑制I類加工甘露糖苷酶活性和2類加工甘露糖苷酶活性以防止去除遠離GCB 前體寡糖五糖核心的至少一個甘露糖殘基的條件下生產(chǎn)含有前體寡糖的GCB，從而生產(chǎn) hmGCB制劑。
[0037] 在一個優(yōu)選實施方案中，GCB是人GCB。在一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞是人細(xì)胞。
[0038] 在一個優(yōu)選實施方案中，防止去除遠離五糖核心的一個或多個α 1，2甘露糖殘 基；防止去除遠離五糖核心的α 1，3甘露糖殘基；和/或防止去除遠離五糖核心的α 1，6甘 露糖殘基。優(yōu)選地，防止去除遠離五糖核心的一個或多個α?，2甘露糖殘基。
[0039] 在一個優(yōu)選實施方案中，該方法可包括：使細(xì)胞接觸一種抑制1類加工甘露糖苷 酶活性的物質(zhì)和一種抑制2類加工甘露糖苷酶活性的物質(zhì)，從而防止去除遠離GCB前體寡 糖五糖核心的至少一個甘露糖殘基。在一個優(yōu)選實施方案中，這些物質(zhì)防止去除遠離五糖 核心的一個或多個α 1，2甘露糖殘基。
[0040] 在一個優(yōu)選實施方案中，該方法包括使細(xì)胞接觸一種抑制1類加工甘露糖苷酶活 性的物質(zhì)和一種抑制2類加工甘露糖苷酶活性的物質(zhì)，其中這些物質(zhì)是1類加工甘露糖苷 酶抑制劑和2類加工甘露糖苷酶抑制劑。在一個優(yōu)選實施方案中，1類加工甘露糖苷酶抑 制劑可以是kifunensine、deoxymannojirimycin或類似抑制劑中的一種或多種。優(yōu)選地， 1類加工甘露糖苷酶抑制劑是kifunensine。在一個優(yōu)選實施方案中，2類加工甘露糖苷酶 抑制劑可以是苦馬豆素、mannostatin、6_脫氧-DIM和6-脫氧-6-氟-DIM中的一種或多 種。優(yōu)選地，2類加工甘露糖苷酶抑制劑是苦馬豆素。
[0041] 在一個優(yōu)選實施方案中，1類加工甘露糖苷酶抑制劑以約0.025-20. 0 μ g/ml、 0.05-1(^8/1111、0.05-5以8/1111、優(yōu)選地約0.1-2.(^8/1111的濃度存在；2類加工甘露糖苷 酶抑制劑以約 〇· 025-20. 0μ g/ml、0. 05-10μ g/ml、0. 05-5μ g/ml、優(yōu)選地約 0· 1-2. 0μ g/ ml的濃度存在；1類加工和2類加工甘露糖苷酶抑制劑的每一種以約0. 025-20. 0 μ g/ml、 0· 05-10 μ g/ml、0. 05-5 μ g/ml、優(yōu)選地約(λ 1-2. 0 μ g/ml的濃度存在；1類加工和2類加工 甘露糖苷酶抑制劑的總濃度約為〇. 025-40. 0 μ g/ml、0. 05-20 μ g/ml、0. 05-10 μ g/ml、優(yōu)選 地約 0· 1_4· 0 μ g/ml。
[0042] 在一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞具有I類甘露糖苷酶和2類甘露糖苷酶的突變，如敲 除。該突變可以是降低基因表達、降低蛋白質(zhì)或活性水平或改變甘露糖苷酶分布或甘露糖 苷酶的其它翻譯后修飾如糖鏈加工的突變。該突變可以降低1類加工甘露糖苷酶和/或2 類加工甘露糖苷酶活性水平，例如降低基因表達，如無效突變，如缺失、移碼或插入。在一 個優(yōu)選實施方案中，該突變是甘露糖苷酶基因中的敲除。該突變能影響結(jié)構(gòu)（和蛋白質(zhì)活 性），例如可以是一種溫度敏感突變體。在一個優(yōu)選實施方案中，1類加工甘露糖苷酶是：高 爾基體甘露糖苷酶IA ;高爾基體甘露糖苷酶IB ;高爾基體甘露糖苷酶IC ;或其組合。在一 個優(yōu)選實施方案中，2類加工甘露糖苷酶是：高爾基體甘露糖苷酶II。
[0043] 在一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞包含1類加工甘露糖苷酶反義分子和2類加工甘露 糖苷酶反義分子。在一個優(yōu)選實施方案中，1類加工甘露糖苷酶是：高爾基體甘露糖苷酶 IA ;高爾基體甘露糖苷酶IB ;高爾基體甘露糖苷酶IC ;其組合。在一個優(yōu)選實施方案中，2 類加工甘露糖苷酶是高爾基體甘露糖苷酶II。
[0044] 在一個優(yōu)選實施方案中，該細(xì)胞包含一種可結(jié)合并抑制甘露糖苷酶的分子，如一 種外源分子。該分子可以是，例如一種單鏈抗體、胞內(nèi)蛋白或競爭性或非競爭性抑制劑。
[0045] 在一個優(yōu)選實施方案中，1類加工甘露糖苷酶活性和2類加工甘露糖苷酶活性能 被不同機制抑制。例如，細(xì)胞接觸抑制1類加工甘露糖苷酶的物質(zhì)（如I類甘露糖苷酶抑 制劑）能抑制1類加工甘露糖苷酶的活性，使用一種2類甘露糖苷酶敲除和/或包含2類 甘露糖苷酶反義分子的細(xì)胞能抑制2類加工甘露糖苷酶。在另一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞 接觸抑制2類甘露糖苷酶的物質(zhì)（如2類甘露糖苷酶抑制劑）能抑制2類加工甘露糖苷酶 的活性，使用一種1類甘露糖苷酶敲除和/或包含1類甘露糖苷酶反義分子的細(xì)胞能抑制 1類加工甘露糖苷酶。
[0046] 在一個優(yōu)選實施方案中，hmGCB分子包含一條至少含4個甘露糖殘基的糖鏈。例 如，hmGCB分子具有至少一條含5個甘露糖殘基的糖鏈，hmGCB分子具有至少一條含6個甘 露糖殘基的糖鏈，hmGCB分子具有至少一條含7個甘露糖殘基的糖鏈，hmGCB分子具有至少 一條含8個甘露糖殘基的糖鏈，hmGCB分子具有至少一條含9個甘露糖殘基的糖鏈。優(yōu)選 地，hmGCB分子具有至少一條含5個、8個或9個甘露糖殘基的糖鏈。
[0047] 在一個優(yōu)選實施方案中，產(chǎn)生的hmGCB ( -種或多種hmGCB分子或整個制劑）中甘 露糖殘基與GIcNAc殘基之比大于3個甘露糖殘基比2個GIcNAc殘基，優(yōu)選地，甘露糖與 61。嫩。之比為4:2、5:2、6:2、7:2、8:2、9:2，更優(yōu)選地，甘露糖與61〇嫩(3之比為8:2或9:2。
[0048] 在一個優(yōu)選實施方案中，在hmGCB分子的1、2、3或4條糖鏈上防止去除遠離五糖 核心的一個或多個甘露糖殘基。
[0049] 在一個優(yōu)選實施方案中，制劑中至少30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、98%、99%或全部的hmGCB分子含有至少1條、優(yōu)選地2條、3條或4條糖 鏈，其中防止去除遠離五糖核心的一個或多個甘露糖殘基。
[0050] 在一個優(yōu)選實施方案中，hmGCB制劑是一種相對異源的制劑。優(yōu)選地，除了五糖核 心外，hmGCB 制劑中不到 80%、70%、60%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、 10%、5%或1%的糖鏈含有相同數(shù)量的甘露糖殘基。例如，除五糖核心之外含有相同數(shù)量 甘露糖殘基的糖鏈與含有不同數(shù)量甘露糖殘基的糖鏈之比約為：60% :40% ;50% :50% ; 40% :60%;30% :70%;25% :75%;20% :80%;15% :85%;10% :90%;5%或更低：95% 或更1?。
[0051] 在一個優(yōu)選實施方案中，1類加工甘露糖苷酶如高爾基體甘露糖苷酶IA和/或高 爾基體甘露糖苷酶IB和/或高爾基體甘露糖苷酶IC的活性，2類加工甘露糖苷酶如高爾 基體甘露糖苷酶Π 的活性被抑制，hmGCB制劑中至少約60%、70%、75%、80%、85%、90%、 95%、98%、99%或100%的糖鏈含有5個或5個以上的甘露糖殘基，例如5、6、7、8和/或 9個甘露糖殘基。在一個優(yōu)選實施方案中，1類加工甘露糖苷酶如高爾基體甘露糖苷酶IA 和/或高爾基體甘露糖苷酶IB和/或高爾基體甘露糖苷酶IC的活性，2類加工甘露糖苷 酶如高爾基體甘露糖苷酶II的活性被抑制，含有5個或更多甘露糖殘基的糖鏈與含有4個 或更少甘露糖殘基的糖鏈之比分別約為：60% :40% ;70% :30% ;75% :25% ;80% :20% ; 85% :15% ;90% :10% ;95% :5% ;99% :1% ;或 100% :0%。
[0052] 在一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞包含一種含有GCB編碼區(qū)的外源核酸序列。在一個 優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞還包含一種調(diào)節(jié)序列，一種內(nèi)源或外源調(diào)節(jié)序列，其作用是調(diào)節(jié)外源 GCB編碼區(qū)的表達。
[0053] 在一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞包含一種外源調(diào)節(jié)序列，其作用是調(diào)節(jié)內(nèi)源GCB編 碼序列的表達，例如，調(diào)節(jié)序列整合到細(xì)胞基因組中，使其調(diào)節(jié)內(nèi)源GCB編碼序列的表達。
[0054] 在一個優(yōu)選實施方案中，調(diào)節(jié)序列包括下列之一種或多種：啟動子、增強子、上游 激活序列（UAS)、支架結(jié)構(gòu)附著區(qū)或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。在一個優(yōu)選實施方案中，調(diào)節(jié)序列 包括：來自金屬硫蛋白-I基因（例如小鼠金屬硫蛋白-I基因）的調(diào)節(jié)序列、來自SV-40基 因的調(diào)節(jié)序列、來自巨細(xì)胞病毒基因的調(diào)節(jié)序列、來自膠原蛋白基因的調(diào)節(jié)序列、來自肌動 蛋白基因的調(diào)節(jié)序列、來自免疫球蛋白基因的調(diào)節(jié)序列、來自HMG-CoA還原酶基因的調(diào)節(jié) 序列，或來自EF-Ια基因的調(diào)節(jié)序列。
[0055] 在一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞是一種真核細(xì)胞。在一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞是 真菌、植物或動物來源的，例如脊椎動物來源的。在一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞是一種哺乳 動物細(xì)胞，例如初級或次級哺乳動物細(xì)胞，例如成纖維細(xì)胞、造血干細(xì)胞、成肌細(xì)胞、角化細(xì) 胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、含有血液有形成分的細(xì)胞、肌細(xì)胞和這 些體細(xì)胞的前體；轉(zhuǎn)化的或無限增殖化細(xì)胞系。優(yōu)選地，該細(xì)胞是人細(xì)胞。在本方法中有用 的無限增殖化人細(xì)胞系的例子包括但不限于：Bowes黑素瘤細(xì)胞（ATCC保藏號CRL9607)、 Daudi細(xì)胞（ATCC保藏號CCL213)、HeLa細(xì)胞和HeLa細(xì)胞衍生物（ATCC保藏號CCL2、CCL2. 1 和 CCL2. 2)、HL-60 細(xì)胞（ATCC 保藏號 CCL240)、HT-1080 細(xì)胞（ATCC 保藏號 CCL121)、Jurkat 細(xì)胞（ATCC保藏號TIB152)、KB癌細(xì)胞（ATCC保藏號CCL17)、K-562白血病細(xì)胞（ATCC保 藏號CCL243)、MCF-7乳腺癌細(xì)胞（ATCC保藏號BTH22)、M0LT-4細(xì)胞（ATCC保藏號1582)、 Namalwa 細(xì)胞（ATCC 保藏號 CRL1432)、Raji 細(xì)胞（ATCC 保藏號 CCL86)、RPMI8226 細(xì)胞（ATCC 保藏號CCL155)、U-937細(xì)胞（ATCC保藏號1593)、WI-28VA13亞系2R4細(xì)胞（ATCC保藏號 CCL155) XCRF-CEM細(xì)胞（ATCC保藏號 CCL119)和 2780AD 卵巢癌細(xì)胞（Van Der Blick等人， Cancer Res. 48:5927-5932, 1988)，以及人細(xì)胞與其它種的細(xì)胞融合產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞。在 另一個實施方案中，無限增殖化細(xì)胞系可以是人細(xì)胞系之外的細(xì)胞系，如CHO細(xì)胞系、COS 細(xì)胞系。在另一個實施方案中，細(xì)胞可以來自克隆細(xì)胞株或克隆細(xì)胞系。
[0056] 在一個優(yōu)選實施方案中，提供能表達hmGCB的細(xì)胞群體，至少30%、40%、50%、 60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或全部細(xì)胞產(chǎn)生含有至少一條糖鏈、優(yōu) 選地2、3或4條糖鏈的hmGCB分子，它們含有特定數(shù)量的甘露糖殘基。
[0057] 在一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞在含有至少一種1類加工甘露糖苷酶抑制劑和至少 一種2類加工甘露糖苷酶抑制劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在一個優(yōu)選實施方案中，該方法還包括 從培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中獲得hmGCB。
[0058] 另一方面，本發(fā)明表征了一種生產(chǎn)hmGCB制劑的方法。該方法包括：
[0059] 提供一種細(xì)胞，該細(xì)胞中導(dǎo)入了一種含有外源調(diào)節(jié)序列的核酸序列，使得該調(diào)節(jié) 序列可調(diào)節(jié)內(nèi)源GCB編碼區(qū)的表達；和
[0060] 在防止去除遠離GCB前體寡糖五糖核心的至少一個甘露糖殘基的條件下生產(chǎn)含 有前體寡糖的GCB，從而生產(chǎn)hmGCB制劑。
[0061] 在一個優(yōu)選實施方案中，GCB是人GCB。
[0062] 在一個優(yōu)選實施方案中，防止去除遠離五糖核心的一個或多個α 1，2甘露糖殘 基；防止去除遠離五糖核心的α 1，3甘露糖殘基；和/或防止去除遠離五糖核心的α 1，6甘 露糖殘基。優(yōu)選地，防止去除遠離五糖核心的一個或多個α?，2甘露糖殘基。
[0063] 在一個優(yōu)選實施方案中，該方法包括使細(xì)胞接觸一種物質(zhì)，該物質(zhì)可防止去除遠 離GCB前體寡糖五糖核心的至少一個甘露糖殘基，例如防止去除遠離五糖核心的一個或多 個α 1，2甘露糖殘基，遠離五糖核心的α 1，3甘露糖殘基和/或遠離五糖核心的α 1，6甘 露糖殘基。優(yōu)選地，防止去除遠離五糖核心的一個或多個α 1，2甘露糖殘基。
[0064] 在一個優(yōu)選實施方案中，該方法包括使細(xì)胞接觸一種物質(zhì)，該物質(zhì)可防止去除遠 離GCB前體寡糖五糖核心的至少一個甘露糖殘基，而且該物質(zhì)是一種甘露糖苷酶抑制劑。 該甘露糖苷酶抑制劑可以是1類加工甘露糖苷酶抑制劑、2類加工甘露糖苷酶抑制劑或此 兩者。1類加工甘露糖苷酶抑制劑可以是kifunensine、deoxymannojirimycin或類似抑制 劑中的一種或多種。優(yōu)選地，1類加工甘露糖苷酶抑制劑是kifunensine。有用的2類加工 甘露糖苷酶抑制劑可包括苦馬豆素、mannostatin、6-脫氧-DIM、6-脫氧-6-氟-DIM中的 一種或多種。優(yōu)選地，2類加工甘露糖苷酶抑制劑是苦馬豆素。
[0065] 在一個優(yōu)選實施方案中，甘露糖苷酶抑制劑以約0· 025-20. 0 μ g/ml、0. 05-10 μ g/ ml、0. 05-5 μ g/ml、優(yōu)選地約 0· 1_2· 0 μ g/ml 的濃度存在。
[0066] 在一個優(yōu)選實施方案中，該方法還包括使細(xì)胞接觸一種1類加工甘露糖苷酶抑制 劑和一種2類加工甘露糖苷酶抑制劑。在一個優(yōu)選實施方案中，1類加工甘露糖苷酶抑制劑 以約 0· 025-20. 0μ g/ml、0. 05-10μ g/ml、0. 05-5μ g/ml、優(yōu)選地約 0· 1-2. 0μ g/ml 的濃度 存在；2類加工甘露糖苷酶抑制劑以約0. 025-20. 0 μ g/ml、0. 05-10 μ g/ml、0. 05-5 μ g/ml、 優(yōu)選地約0. 1-2. 0 μ g/ml的濃度存在；I類加工和2類加工甘露糖苷酶抑制劑的每一種以 約 0· 025-20. 0 μ g/ml、0· 05-10 μ g/ml、0· 05-5 μ g/ml、優(yōu)選地約 0· 1-2. 0 μ g/ml 的濃度存 在；1類加工和2類加工甘露糖苷酶抑制劑的總濃度約為0. 025-40. 0 μ g/ml、0. 05-20 μ g/ ml、0· 05-10 μ g/ml、優(yōu)選地約 0· 1_4· 0 μ g/ml。
[0067] 在一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞具有至少一種甘露糖苷酶的突變，如敲除。該突變可 以是降低基因表達、降低蛋白質(zhì)或活性水平或改變甘露糖苷酶分布或其它翻譯后修飾如糖 鏈加工的突變。該突變可以降低高爾基加工甘露糖苷酶活性水平，例如降低基因表達，如無 效突變，如缺失、移碼或插入。在一個優(yōu)選實施方案中，該突變是敲除，例如甘露糖苷酶基因 中的敲除。該突變能影響結(jié)構(gòu)（和蛋白質(zhì)活性），例如可以是一種溫度敏感突變或截短。在 一個優(yōu)選實施方案中，該細(xì)胞具有1類加工甘露糖苷酶、2類加工甘露糖苷酶的突變，例如 敲除，1類加工甘露糖苷酶和2類加工甘露糖苷酶的突變，例如敲除。在一個優(yōu)選實施方案 中，1類加工甘露糖苷酶是高爾基體甘露糖苷酶IA ;高爾基體甘露糖苷酶IB ;高爾基體甘露 糖苷酶IC ;或其組合。在一個優(yōu)選實施方案中，2類加工甘露糖苷酶是高爾基體甘露糖苷酶 II。
[0068] 在一個優(yōu)選實施方案中，該細(xì)胞包含一種核酸序列，如反義分子或核酶，它們能結(jié) 合或滅活一種細(xì)胞甘露糖苷酶核酸序列，如mRNA，并抑制該蛋白質(zhì)的表達。在一個優(yōu)選實施 方案中，該核酸序列是：1類加工甘露糖苷酶反義分子；2類加工甘露糖苷酶反義分子；1類 加工甘露糖苷酶反義分子和2類加工甘露糖苷酶反義分子兩者。在一個優(yōu)選實施方案中，1 類加工甘露糖苷酶是：高爾基體甘露糖苷酶IA ;高爾基體甘露糖苷酶IB ;高爾基體甘露糖 苷酶IC ;其組合。在一個優(yōu)選實施方案中，2類加工甘露糖苷酶是高爾基體甘露糖苷酶II。 [0069] 在一個優(yōu)選實施方案中，該細(xì)胞包含一種可結(jié)合并抑制甘露糖苷酶的分子，如一 種外源分子。該分子可以是，例如一種單鏈抗體、胞內(nèi)蛋白或競爭性或非競爭性抑制劑。
[0070] 在一個優(yōu)選實施方案中，hmGCB分子包含一條至少含4個甘露糖殘基的糖鏈。例 如，hmGCB分子具有至少一條含5個甘露糖殘基的糖鏈，hmGCB分子具有至少一條含6個甘 露糖殘基的糖鏈，hmGCB分子具有至少一條含7個甘露糖殘基的糖鏈，hmGCB分子具有至少 一條含8個甘露糖殘基的糖鏈，hmGCB分子具有至少一條含9個甘露糖殘基的糖鏈。優(yōu)選 地，hmGCB分子具有至少一條含5個、8個或9個甘露糖殘基的糖鏈。
[0071] 在一個優(yōu)選實施方案中，產(chǎn)生的hmGCB ( -種或多種hmGCB分子或整個制劑）中甘 露糖殘基與GIcNAc殘基之比大于3個甘露糖殘基比2個GIcNAc殘基，優(yōu)選地，甘露糖與 61。嫩。之比為4:2、5:2、6:2、7:2、8:2、9:2，更優(yōu)選地，甘露糖與61〇嫩。之比為5:2、8:2或 9:2 〇
[0072] 在一個優(yōu)選實施方案中，在hmGCB分子的1、2、3或4條糖鏈上防止去除遠離五糖 核心的一個或多個甘露糖殘基。
[0073] 在一個優(yōu)選實施方案中，制劑中至少30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、98%、99%或全部的hmGCB分子含有至少1條、優(yōu)選地2條、3條或4條糖 鏈，其中防止去除遠離五糖核心的一個或多個甘露糖殘基。
[0074] 在一個優(yōu)選實施方案中，hmGCB制劑是一種相對異源的制劑。優(yōu)選地，除了五糖 核心外，hmGCB 中不到 80%、70%、60%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、 10 %、5 %或1 %的糖鏈含有相同數(shù)量的甘露糖殘基。例如，除五糖核心之外含有相同數(shù)量 甘露糖殘基的糖鏈與含有不同數(shù)量甘露糖殘基的糖鏈之比約為：60% :40% ;50% :50% ; 40% :60% ;30% :70% ;25% :75% ;20% :80% ;15% :85% ;10% :90% ;5%或更低：95% 或更1?。
[0075] 在一個優(yōu)選實施方案中，高爾基體甘露糖苷酶IA和/或IB和/或IC的活性被抑 制，hmGCB 制劑中至少約 60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%的糖 鏈含有5個或5個以上甘露糖殘基，例如5、6、7、8和/或9個甘露糖殘基。在一個優(yōu)選實 施方案中，高爾基體甘露糖苷酶I的活性被抑制，含有5個或更多甘露糖殘基的糖鏈與含有 4個或更少甘露糖殘基的糖鏈之比約為：60% :40% ;70% :30% ;75% :25% ;80% :20% ; 85% :15% ;90% :10% ;95% :5% ;99% :1% ;或 100% :0%。
[0076] 在一個優(yōu)選實施方案中，高爾基體甘露糖苷酶II的活性被抑制，hmGCB制劑中至 少約60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%的糖鏈含有5個或5個 以上甘露糖殘基。在一個優(yōu)選實施方案中，高爾基體甘露糖苷酶II的活性被抑制，含有5 個或更多甘露糖殘基的糖鏈與含有4個或更少甘露糖殘基的糖鏈之比約為：60% :40% ; 70% :30% ;75% :25% ;80% :20% ;85% :15% ;90% :10% ;95% :5% ;99% :1% ;或 100% :0%。
[0077] 在一個優(yōu)選實施方案中，該調(diào)節(jié)序列包括下列之一種或多種：啟動子、增強子、上 游激活序列（UAS)、支架結(jié)構(gòu)附著區(qū)或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。在一個優(yōu)選實施方案中，該調(diào) 節(jié)序列包括：來自金屬硫蛋白-I基因（例如小鼠金屬硫蛋白-I基因）的調(diào)節(jié)序列、來自 SV-40基因的調(diào)節(jié)序列、來自巨細(xì)胞病毒基因的調(diào)節(jié)序列、來自膠原蛋白基因的調(diào)節(jié)序列、 來自肌動蛋白基因的調(diào)節(jié)序列、來自免疫球蛋白基因的調(diào)節(jié)序列、來自HMG-CoA還原酶基 因的調(diào)節(jié)序列，或來自EF-Ια基因的調(diào)節(jié)序列。
[0078] 在一個優(yōu)選實施方案中，該細(xì)胞是一種真核細(xì)胞。在一個優(yōu)選實施方案中，該細(xì) 胞是真菌、植物或動物來源的，例如脊椎動物來源的。在一個優(yōu)選實施方案中，該細(xì)胞是 一種哺乳動物細(xì)胞，例如初級或次級哺乳動物細(xì)胞，例如成纖維細(xì)胞、造血干細(xì)胞、成肌細(xì) 胞、角化細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、含有血液有形成分的細(xì)胞、 肌細(xì)胞和這些體細(xì)胞的前體；轉(zhuǎn)化的或無限增殖化細(xì)胞系。優(yōu)選地，該細(xì)胞是人細(xì)胞。在 本方法中有用的無限增殖化人細(xì)胞系的例子包括但不限于：Bowes黑素瘤細(xì)胞（ATCC保藏 號CRL9607)、Daudi細(xì)胞（ATCC保藏號CCL213)、HeLa細(xì)胞和HeLa細(xì)胞衍生物（ATCC保 藏號 CCL2CCL2. 1 和 CCL2. 2)、HL-60 細(xì)胞（ATCC 保藏號 CCL240)、HT-1080 細(xì)胞（ATCC 保 藏號 CCL121)、Jurkat 細(xì)胞（ATCC 保藏號 TIB152)、KB 癌細(xì)胞（ATCC 保藏號 CCL17)、K-562 白血病細(xì)胞（ATCC保藏號CCL243)、MCF-7乳腺癌細(xì)胞（ATCC保藏號BTH22)、M0LT-4細(xì)胞 (ATCC保藏號 1582)、Namalwa 細(xì)胞（ATCC保藏號 CRL1432)、Raji 細(xì)胞（ATCC保藏號 CCL86)、 RPMI8226 細(xì)胞（ATCC 保藏號 CCL155)、U-937 細(xì)胞（ATCC 保藏號 1593)、WI-28VA13 亞系 2R4 細(xì)胞（ATCC保藏號CCL155)、CCRF-CEM細(xì)胞（ATCC保藏號CCL119)和2780AD卵巢癌細(xì)胞 (Van Der Blick等人，Cancer Res. 48:5927-5932, 1988)，以及人細(xì)胞與其它種的細(xì)胞融合 產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞。在另一個實施方案中，無限增殖化細(xì)胞系可以是人細(xì)胞系之外的細(xì)胞 系，如CHO細(xì)胞系、COS細(xì)胞系。在另一個實施方案中，細(xì)胞可以來自克隆細(xì)胞株或克隆細(xì) 胞系。
[0079] 在一個優(yōu)選實施方案中，提供能表達hmGCB的細(xì)胞群體，至少30%、40%、50%、 60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或全部細(xì)胞產(chǎn)生含有至少1條糖鏈、優(yōu) 選地2、3或4條糖鏈的hmGCB分子，它們含有特定數(shù)量的甘露糖殘基。
[0080] 在一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞在含有至少一種甘露糖苷酶抑制劑的培養(yǎng)基中培 養(yǎng)。在一個優(yōu)選實施方案中，該方法還包括從培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中獲得hmGCB。
[0081] 另一方面，本發(fā)明表征了通過此處所述任一種方法生產(chǎn)的一種hmGCB分子，例如 此處所述的hmGCB分子，如人hmGCB。優(yōu)選地，hmGCB分子包含至少1條糖鏈，優(yōu)選地2、3或 4條糖鏈，它們含有前體寡糖鏈的至少4個甘露糖殘基。
[0082] 另一方面，本發(fā)明表征了一種包含hmGCB分子的一部分的hmGCB制劑，該分子包含 至少1條糖鏈，優(yōu)選地2、3或4條糖鏈，它們含有前體寡糖鏈的至少4個甘露糖殘基。優(yōu)選 地，hmGCB制劑通過此處所述的任一種方法生產(chǎn)。
[0083] 在一個優(yōu)選實施方案中，hmGCB是人hmGCB。
[0084] 在一個優(yōu)選實施方案中，hmGCB分子可含有：至少一條含5個甘露糖殘基的糖鏈； 至少一條含6個甘露糖殘基的糖鏈；至少一條含7個甘露糖殘基的糖鏈；至少一條含8個甘 露糖殘基的糖鏈；至少一條含9個甘露糖殘基的糖鏈。
[0085] 在一個優(yōu)選實施方案中，產(chǎn)生的hmGCB (-種或多種hmGCB分子或整個制劑）含 有至少一種糖鏈，其中甘露糖殘基與GIcNAc殘基之比大于3個甘露糖殘基比2個GIcNAc 殘基，優(yōu)選地，甘露糖與GlcNAc之比為4:2、5:2、6:2、7:2、8 :2、9:2,更優(yōu)選地，甘露糖與 GlcNAc 之比為 5:2、8:2 或 9:2。
[0086] 在一個優(yōu)選實施方案中，制劑中至少30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、98%、99%或全部的hmGCB分子含有至少1條、優(yōu)選地2條、3條或4條糖 鏈，其中防止去除遠離五糖核心的一個或多個甘露糖殘基。
[0087] 另一方面，本發(fā)明表征了一種細(xì)胞，其至少一種甘露糖苷酶活性被抑制，并且包含 一種含外源調(diào)節(jié)序列的核酸序列，該調(diào)節(jié)序列調(diào)節(jié)被導(dǎo)入后使得能調(diào)節(jié)內(nèi)源GCB編碼區(qū)的 表達，其中該細(xì)胞產(chǎn)生防止去除遠離GCB前體寡糖五糖核心的至少一個甘露糖殘基的GCB。
[0088] 在一個優(yōu)選實施方案中，該細(xì)胞產(chǎn)生一種hmGCB制劑，例如，人hmGCB制劑，其中防 止去除遠離五糖核心的一個或多個α 1，2甘露糖殘基；防止去除遠離五糖核心的α 1，3甘 露糖殘基；和/或防止去除遠離五糖核心的α 1，6甘露糖殘基。優(yōu)選地，防止去除遠離五糖 核心的一個或多個α 1，2甘露糖殘基。
[0089] 在一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞接觸一種抑制甘露糖苷酶的物質(zhì)可抑制細(xì)胞中至 少一種甘露糖苷酶活性。在一個優(yōu)選實施方案中，該物質(zhì)是一種甘露糖苷酶抑制劑。該 甘露糖苷酶抑制劑可以是1類加工甘露糖苷酶抑制劑、2類加工甘露糖苷酶抑制劑或 此兩者。在一個優(yōu)選實施方案中，1類加工甘露糖苷酶抑制劑可以是kifunensine和 deoxymannojirimycin之一或兩者。優(yōu)選地，1類加工甘露糖苷酶抑制劑是kifunensine。 在一個優(yōu)選實施方案中，2類加工甘露糖苷酶抑制劑可以是苦馬豆素、mannostatin、6-脫 氧-DM和6-脫氧-6-氟-DM中的一種或多種。優(yōu)選地，2類加工甘露糖苷酶抑制劑是苦 馬豆素。
[0090] 在一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞具有至少一種高爾基加工甘露糖苷酶的突變，如敲 除。該突變可以是降低基因表達、降低蛋白質(zhì)或活性水平或改變甘露糖苷酶分布或其它翻 譯后修飾如糖鏈加工的突變。該突變可以降低高爾基加工甘露糖苷酶活性水平，例如降低 基因表達，如無效突變，如缺失、移碼或插入。在一個優(yōu)選實施方案中，該突變是甘露糖苷酶 基因中的敲除。該突變能影響結(jié)構(gòu)（和蛋白質(zhì)活性），例如可以是一種溫度敏感突變。在一 個優(yōu)選實施方案中，該細(xì)胞是1類加工甘露糖苷酶、2類加工甘露糖苷酶、1類加工甘露糖苷 酶和2類加工甘露糖苷酶的突變體，例如敲除突變體。在一個優(yōu)選實施方案中，1類加工甘 露糖苷酶是高爾基體甘露糖苷酶IA ;高爾基體甘露糖苷酶IB ;高爾基體甘露糖苷酶IC ;其 組合。在一個優(yōu)選實施方案中，2類加工甘露糖苷酶是高爾基體甘露糖苷酶II。
[0091] 在一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞還包含一種核酸序列，如反義分子或核酶，它們能結(jié) 合或滅活一種細(xì)胞甘露糖苷酶核酸序列，如mRNA，并抑制該蛋白質(zhì)的表達。在一個優(yōu)選實施 方案中，該核酸序列是：1類加工甘露糖苷酶反義分子；2類加工甘露糖苷酶反義分子；1類 加工甘露糖苷酶反義分子和2類加工甘露糖苷酶反義分子兩者。在一個優(yōu)選實施方案中，1 類加工甘露糖苷酶是：高爾基體甘露糖苷酶IA ;高爾基體甘露糖苷酶IB ;高爾基體甘露糖 苷酶IC ;其組合。在一個優(yōu)選實施方案中，2類加工甘露糖苷酶是高爾基體甘露糖苷酶II。
[0092] 在一個優(yōu)選實施方案中，該細(xì)胞包含一種可結(jié)合并抑制甘露糖苷酶的分子，如一 種外源分子。該分子可以是，例如一種單鏈抗體、胞內(nèi)蛋白或競爭性或非競爭性抑制劑。
[0093] 在一個優(yōu)選實施方案中，該細(xì)胞產(chǎn)生的hmGCB分子中甘露糖殘基與GIcNAc殘基之 比大于3個甘露糖殘基比2個GlcNAc殘基，優(yōu)選地，甘露糖與GlcNAc之比為4:2、5:2、6:2、 7 :2、8:2、9:2，更優(yōu)選地，甘露糖與61〇嫩。之比為5:2、8 :2或9:2。
[0094] 在一個優(yōu)選實施方案中，該細(xì)胞不能在hmGCB的1、2、3或4條糖鏈上去除遠離五 糖核心的一個或多個甘露糖殘基。
[0095] 在一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞產(chǎn)生的至少30%、40%、50%、60%、70%、75%、 80%、85%、90%、95%、98%、99%或全部的hmGCB分子含有至少1條、優(yōu)選地2條、3條或4 條糖鏈，其中防止去除遠離五糖核心的一個或多個甘露糖殘基。
[0096] 在一個優(yōu)選實施方案中，調(diào)節(jié)序列包括下列之一種或多種：啟動子、增強子、上游 激活序列（UAS)、支架結(jié)構(gòu)附著區(qū)或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。在一個優(yōu)選實施方案中，調(diào)節(jié)序列 包括：來自金屬硫蛋白-I基因（例如小鼠金屬硫蛋白-I基因）的調(diào)節(jié)序列、來自SV-40基 因的調(diào)節(jié)序列、來自巨細(xì)胞病毒基因的調(diào)節(jié)序列、來自膠原蛋白基因的調(diào)節(jié)序列、來自肌動 蛋白基因的調(diào)節(jié)序列、來自免疫球蛋白基因的調(diào)節(jié)序列、來自HMG-CoA還原酶基因的調(diào)節(jié) 序列，或來自EF-Ια基因的調(diào)節(jié)序列。
[0097] 在一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞是一種真核細(xì)胞。在一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞是 真菌、植物或動物來源的，例如脊椎動物來源的。在一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞是一種哺乳 動物細(xì)胞，例如初級或次級哺乳動物細(xì)胞，例如成纖維細(xì)胞、造血干細(xì)胞、成肌細(xì)胞、角化細(xì) 胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、含有血液有形成分的細(xì)胞、肌細(xì)胞和這 些體細(xì)胞的前體；轉(zhuǎn)化的或無限增殖化細(xì)胞系。優(yōu)選地，該細(xì)胞是人細(xì)胞。在本方法中有用 的無限增殖化人細(xì)胞系的例子包括但不限于：Bowes黑素瘤細(xì)胞（ATCC保藏號CRL9607)、 Daudi細(xì)胞（ATCC保藏號CCL213)、HeLa細(xì)胞和HeLa細(xì)胞衍生物（ATCC保藏號CCL2CCL2. 1 和 CCL2. 2)、HL-60 細(xì)胞（ATCC 保藏號 CCL240)、HT-1080 細(xì)胞（ATCC 保藏號 CCL121)、Jurkat 細(xì)胞（ATCC保藏號TIB152)、KB癌細(xì)胞（ATCC保藏號CCL17)、K-562白血病細(xì)胞（ATCC保 藏號CCL243)、MCF-7乳腺癌細(xì)胞（ATCC保藏號BTH22)、M0LT-4細(xì)胞（ATCC保藏號1582)、 Namalwa 細(xì)胞（ATCC 保藏號 CRL1432)、Raji 細(xì)胞（ATCC 保藏號 CCL86)、RPMI8226 細(xì)胞（ATCC 保藏號CCL155)、U-937細(xì)胞（ATCC保藏號1593)、WI-28VA13亞系2R4細(xì)胞（ATCC保藏號 CCL155) XCRF-CEM細(xì)胞（ATCC保藏號 CCL119)和 2780AD 卵巢癌細(xì)胞（Van Der Blick等人， Cancer Res. 48:5927-5932, 1988)，以及人細(xì)胞與其它種的細(xì)胞融合產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞。在 另一個實施方案中，無限增殖化細(xì)胞系可以是人細(xì)胞系之外的細(xì)胞系，如CHO細(xì)胞系、COS 細(xì)胞系。在另一個實施方案中，細(xì)胞可以來自克隆細(xì)胞株或克隆細(xì)胞系。
[0098] 另一方面，本發(fā)明表征了一種包含hmGCB分子（如人hmGCB)的藥用組合物，它包 含至少一條糖鏈，優(yōu)選地2、3或4條糖鏈，這些糖鏈含有前體寡糖鏈的至少4個甘露糖殘 基，其量適于治療戈謝病。
[0099] 在一個優(yōu)選實施方案中，該藥用組合物還包含一種藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑。
[0100] 本發(fā)明的另一方面表征了一種治療戈謝病患者的方法。該方法包括對戈謝病患者 施用一種hmGCB制劑，如人hmGCB制劑，它包含至少一條糖鏈，優(yōu)選地2、3或4條糖鏈，這些 糖鏈含有前體寡糖鏈的至少4個甘露糖殘基，其量適于治療戈謝病。
[0101] 另一方面，本發(fā)明表征了一種從樣品中純化hmGCB的方法。該方法包括：提供一種 收獲的hmGCB產(chǎn)物；對該hmGCB產(chǎn)物進行疏水電荷誘導(dǎo)層析（HCIC)和/或疏水作用層析 (HIC)，從而獲得純化的hmGCB。
[0102] 在一個優(yōu)選實施方案中，用妮？115^61^€丨@進行!〇(：。在另一個優(yōu)選實施方案 中，用 MacroPr印 Methyl?進行 HIC。
[0103] 在另一個優(yōu)選實施方案中，該方法還包括對hmGCB產(chǎn)物進行離子交換層析?？稍?離子交換層析之前對hmGCB產(chǎn)物進行HCIC和/或HIC，或者在HCIC和/或HIC之前對hmGCB 產(chǎn)物進行離子交換層析。優(yōu)選地，對hmGCB產(chǎn)物進行一次以上的離子交換層析步驟。離子 交換層析可以是陰離子交換層析、陽離子交換層析或此兩者。
[0104] 在一個優(yōu)選實施方案中，使用下列之一種或多種進行陰離子交換層析： Q Sepharose Fast Flow?、MacroPrep High Q Support?、DEAE Sepharose Fast Fl〇W?和Macro-Prep DEAE?。在一個優(yōu)選實施方案中，用下列之一或多種 進行陽離子交換層析：SP Sepharose Fast Fl〇W?、Source 30S?、CM Sepharose Fast Flow?、Macro-Prep CM Support?和 Macro-Prep High S Support?。
[0105] 在一個優(yōu)選實施方案中，該方法還包括對hmGCB產(chǎn)物進行大小排阻層析。優(yōu)選 地，用下列之一或多種進行大小排阻層析：Superdex 200?、Sephacryl S-200 HR?和 Bio-Gel A 1.5m?〇
[0106] 另一方面，本發(fā)明表征了一種純化hmGCB的方法。該方法包括：提供收獲的hmGCB 產(chǎn)物；對hmGCB產(chǎn)物進行疏水電荷誘導(dǎo)層析（HCIC)和/或疏水作用層析（HIC) J^hmGCB 產(chǎn)物進行陰離子交換層析、陽離子交換層析和大小排阻層析中的一種或多種，從而獲得純 化的hmGCB。
[0107] 在一個優(yōu)選實施方案中，用MEP Hypercel?進行HCIC。在另一個優(yōu)選實施方案 中，用 MacroPr印 Methyl?進行 HIC。
[0108] 在一個優(yōu)選實施方案中，該方法包括使用陰離子交換層析。優(yōu)選地，用下列 之一種或多種進行陰離子交換層析：Q Sepharose Fast _F l〇W?、MacroPrep High Q Support?、DEAE Sepharose Fast Fl〇W? 和 Macro-Prep DEAE?〇
[0109] 在一個優(yōu)選實施方案中，該方法包括使用陽離子交換層析。優(yōu)選地，用下列之一種 或多種進行陽離子交換層析：SP Sepharose Fast Flow?、Source 30S?、CM Sepharose Fast Fl〇W?、Macro-Prep CM Support?和 Macro-Prep High S Support--
[oho] 在一個優(yōu)選實施方案中，該方法包括使用大小排阻層析。優(yōu)選地，用下列之一 種或多種進行大小排阻層析：Superdex 200?、Sephacryl S-200 HR?和Bio-Gel A 1.5m? 〇
[0111] 在一個優(yōu)選實施方案中，對hmGCB進行（以任何順序）：陰離子交換層析和陽離子 交換層析；陰離子交換層析和大小排阻層析；陽離子交換層析和大小排阻層析；陰離子交 換層析、陽離子交換層析和大小排阻層析。優(yōu)選地，以下列順序?qū)mGCB進行所有這三種層 析步驟：陰離子交換層析、陽離子交換層析和大小排阻層析。
[0112] 另一方面，本發(fā)明表征了一種純化hmGCB的方法。該方法包括：提供收獲的hmGCB 產(chǎn)物；對hmGCB產(chǎn)物進行疏水電荷誘導(dǎo)層析（HCIC)和/或疏水作用層析（HIC);對HCIC和 /或HIC純化的hmGCB產(chǎn)物進行陰離子交換層析；對陰離子交換純化的hmGCB進行陽離子 交換層析；以及，對陽離子交換純化的hmGCB進行大小排阻層析，從而獲得純化的hmGCB。
[0113] 在一個優(yōu)選實施方案中，用MEP Hypercel?ai行hcic。在另一個優(yōu)選實施方案 中，用 MacroPr印 Methyl?進行 HIC。
[0114] 在一個優(yōu)選實施方案中，用下列之一種或多種進行陰離子交換層析：Q Sepharose Fast Flow?、MacroPrep High Q Support?、DEAESepharose Fast FI〇W? 和 Macro-Prep DEAE?〇
[0115] 在一個優(yōu)選實施方案中，用下列之一種或多種進行陽離子交換層析：SP Sepharose Fast Fl〇W?、Source 30S?、CM Sepharose Fast Flow?、Macro-Prep CM Support?和 Macro-Pr印 High S Support?。
[0116] 在一個優(yōu)選實施方案中，用下列之一種或多種進行大小排阻層析： Superdex 200?、Sephacryl S-200 HR?:和 Bio-Gel A 1.5m?〇
[0117] 術(shù)語"高甘露糖葡糖腦苷脂酶（hmGCB) "在此使用時是指含有至少一條糖鏈的葡糖 腦苷脂酶，該糖鏈含有4個或4個以上的來自前體寡糖的甘露糖殘基。優(yōu)選地，hmGCB含有 5、6、7、8或9個來自前體寡糖鏈的甘露糖殘基。最優(yōu)選地，hmGCB含有5、8或9個來自前體 寡糖鏈的甘露糖殘基。
[0118] 術(shù)語"hmGCB制劑"是指兩種或多種hmGCB分子。
[0119] 術(shù)語"初級細(xì)胞"包括存在于自脊椎動物組織來源分離的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞（在 平板接種之前，即附著于組織培養(yǎng)底物如平皿或瓶上的）、在來自組織的外植體中存在的細(xì) 胞、第一次平板接種的前述兩種細(xì)胞型、由這些平板接種的細(xì)胞衍生的細(xì)胞懸液。術(shù)語次級 細(xì)胞或細(xì)胞株是指培養(yǎng)中所有后來步驟的細(xì)胞。即，首先從培養(yǎng)底物中取出平板接種的初 級細(xì)胞，再次平板接種（傳代），在此稱為次級細(xì)胞，如隨后傳代的所有細(xì)胞。次級細(xì)胞是由 傳代一次或多次的次級細(xì)胞組成的細(xì)胞株。細(xì)胞株由下列次級細(xì)胞組成，它們：1)被傳代 一次或多次；2)在培養(yǎng)中顯示有限數(shù)量的平均群體倍增；3)顯示接觸抑制、錨定依賴生長 的特性（錨定依賴性不適用于懸浮培養(yǎng)繁殖的細(xì)胞）；4)不是無限增殖的。"克隆細(xì)胞株" 被定義為由單個創(chuàng)始細(xì)胞（founder cell)衍生的細(xì)胞株。"異源細(xì)胞株"被定義為由兩種 或多種生成細(xì)胞衍生的細(xì)胞株。
[0120] 在此使用時，"無限增殖化細(xì)胞"是主要特征在于在培養(yǎng)中顯示明顯不受限制的壽 命的細(xì)胞系（不同于命名為初級和次級細(xì)胞具有的"株"的細(xì)胞株）。
[0121] 術(shù)語"轉(zhuǎn)染的細(xì)胞"是指導(dǎo)入外源合成核酸序列（如編碼一種蛋白質(zhì)的序列）的 細(xì)胞。一旦進入細(xì)胞，合成核酸序列即能整合到受體細(xì)胞染色體DNA中或能以附加型存在。 能用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染方法向細(xì)胞中導(dǎo)入合成核酸序列，例如脂質(zhì)體、聚凝胺（polybrene)、DEAE介 導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、磷酸鈣沉淀或顯微注射。術(shù)語"轉(zhuǎn)染"不包括通過病 毒向細(xì)胞中運送DNA或RNA。
[0122] 術(shù)語"感染的細(xì)胞"或"轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞"是指通過病毒導(dǎo)入外源合成核酸序列（如編 碼一種蛋白質(zhì)的序列）的細(xì)胞。公知可用于基因轉(zhuǎn)移的病毒包括腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹 病毒、流行性腮腺炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、反轉(zhuǎn)錄酶病毒、辛德畢斯病毒、慢病毒和痘苗病 毒如金絲雀痘病毒。
[0123] 通過下列詳述和權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將是顯然的。
[0124] 附圖簡述
[0125] 圖1是一張示意圖，顯示N連接的聚糖當(dāng)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、中室和高爾基體中存在時的修 剪。這些酶如下編號：（1) α-葡糖苷酶I ; (2) α-葡糖苷酶π ; (3) ER甘露糖苷酶I ; (4) ER 甘露糖苷酶II ; (5)ER葡糖基轉(zhuǎn)移酶；(6)內(nèi)甘露糖苷酶；（7)高爾基體甘露糖苷酶IA、IB 和IC;(8)GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I ;(9)高爾基體甘露糖苷酶II。▲，葡萄糖；^,GlcNAc ;·，甘露 糖。酶（3)和（7)被kifunensine抑制；酶（9)被苦馬豆素抑制。
[0126] 發(fā)明詳述
[0127] 本發(fā)明部分地基于以下發(fā)現(xiàn)：抑制去除遠離葡糖腦苷脂酶（GCB)前體寡糖鏈五 糖核心的一個或多個甘露糖殘基產(chǎn)生可有效導(dǎo)向甘露糖受體的高甘露糖葡糖腦苷脂酶 (hmGCB)。抑制或降低一種或多種甘露糖苷酶（如一種或多種1類加工甘露糖苷酶和/或 2類加工甘露糖苷酶）的活性能防止從前體寡糖鏈的五糖核心中去除甘露糖殘基。通過防 止或抑制一個或多個甘露糖殘基的去除，能獲得含有至少一條含4個或4個以上來自前體 寡糖鏈的甘露糖殘基的糖鏈的hmGCB。
[0128] 戈謝病是由于GCB缺陷引起的。GCB是鞘糖脂葡糖腦苷脂降解所必需的。在GCB 缺乏時，葡糖腦苷脂主要在吞噬細(xì)胞（例如巨噬細(xì)胞）中積累，最終在肝臟、脾臟和骨髓中 積累。
[0129] 巨噬細(xì)胞具有甘露糖受體。這些受體在這些細(xì)胞的受體介導(dǎo)的胞吞作用中起作 用。hmGCB可有效地定向巨噬細(xì)胞上的甘露糖受體，提高這些細(xì)胞對GCB的攝取（以hmGCB 形式）。通過將GCB (以hmGCB形式）引導(dǎo)到葡糖腦苷脂積累的細(xì)胞中，hmGCB能用來水解 巨噬細(xì)胞中的葡糖腦苷脂，從而降低該糖脂在戈謝病患者的肝臟、脾臟和骨髓中的積累。
[0130] 葡糖腦苷脂酶
[0131] 來自不同種的編碼葡糖腦苷脂酶的基因的核苷酸序列信息可以獲 得。（參見 Horowitz 等人（1989)Genomics4(l) :87-96 ;Beutler 等人（1992) Genomicsl2(4):795-800)。
[0132] 成熟的人 GCB 在 Asn-19、Asn-59、Asn-146、Asn-270 和 Asn-462 處有 5 個潛 在的N-連接糖基化位點。在人組織衍生的GCB中，在5個位點中的4個處發(fā)生糖基化 (Erickson等人（1985) J. Biol. Chem. 260:14319-14324)。利用定點誘變的研究證明，位點 Asn-462 不再被占據(jù)（Berg-Fussman 等人（1993)J. Biol. Chem. 268:14861-14866)。從人 胎盤GCB中釋放的接近20%的聚糖鏈顯示為含有可達7個甘露糖殘基的高甘露糖類型，而 大多數(shù)聚糖鏈?zhǔn)蔷哂型僖核岫炀€和三天線結(jié)構(gòu)的復(fù)合型（Takasaki等人（1984) J. Biol. Chem. 259:10112-10117)。
[0133] GCB N-糖基化的第一個事件是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER)腔中Glc3Man9GlcNAc2從寡糖-PP-多 萜醇向新生肽的協(xié)同翻譯轉(zhuǎn)移。供體寡糖上存在3個葡萄糖殘基允許由寡糖基轉(zhuǎn)移酶向受 體天冬酰胺有效轉(zhuǎn)移。N-糖基化后，在折疊過程中ER葡糖苷酶I和II從GCB中快速除去 葡萄糖殘基。兩種不同的ER甘露糖苷酶均能從Man 9GlcNAc2上水解下一個甘露糖殘基，形 成Man8GlcNAc 2的兩種不同的異構(gòu)體（見圖1)?？山咏木厶侨缓笤诟郀柣w中進一步加 工為Man5GlcNAc 2，是通過高爾基體甘露糖苷酶I除去可達4個α 1，2-連接的甘露糖殘基。 至少有3種不同的編碼相關(guān)高爾基體甘露糖苷酶I同工型（IA、IB和IC)的人類基因，它 們有略微不同的底物特異性和組織表達，但全都能從Man 9GlcNAc2聚糖上剪下4個甘露糖 殘基，形成 Man5GlcNAc2 (Tremblay 等人（2000 年 7 月 27 日）J. Biol. Chem.[待印刷])。它 們位于染色體6q22、1ρ13和1ρ35-36上，其cDNA序列可從GenBank獲得，分別為X74837、 AF027156 和 AF261655。
[0134] 加工的最后一個階段是使聚糖進入復(fù)雜聚糖的生物合成途徑，需要開始時通過 GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I的作用使Man5GlcNAc2轉(zhuǎn)化為GlcNAcMan5GlcNAc 2，之后高爾基體甘露糖苷 酶II能催化去除另外兩個甘露糖殘基，產(chǎn)生GlcNAcMan 3GlcNAc2。它是位于跨高爾基體和 跨高爾基體網(wǎng)絡(luò)中的糖基轉(zhuǎn)移酶引起聚糖延伸形成復(fù)合型鏈的底物。
[0135] 如果在最初的N-糖基化步驟中轉(zhuǎn)移給GCB的高甘露糖鏈在高爾基體中能免于被 加工為復(fù)合鏈，則含有高甘露糖鏈的GCB(hmGCB)可有效地定向網(wǎng)狀內(nèi)皮組織細(xì)胞上的甘 露糖受體。
[0136] MM
[0137] 將要轉(zhuǎn)染或感染的初級和次級細(xì)胞能從多種組織中獲得，包括能培養(yǎng)保存和繁殖 的細(xì)胞型。例如，能被轉(zhuǎn)染或感染的初級和次級細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、角化細(xì)胞、上皮細(xì)胞 (例如哺乳動物上皮細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞）、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血液的有形 成分（例如淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞）、肌細(xì)胞和這些體細(xì)胞型的前體。初級細(xì)胞優(yōu)選地從施用 了轉(zhuǎn)染或感染的初級或次級細(xì)胞的個體中獲得（即自體細(xì)胞）。然而，初級細(xì)胞可從相同種 (即，同種異體細(xì)胞）或其它種（即，異種細(xì)胞）（例如，小鼠、大鼠、兔、貓、狗、豬、母牛、鳥、 綿羊、山羊、馬、猴、狒狒）的供體（不是受體）中獲得。
[0138] 脊椎動物（特別是哺乳動物）來源的初級或次級細(xì)胞能用外源DNA序列（例如編 碼治療蛋白的外源DNA序列）轉(zhuǎn)染或感染，在并長期在體外和體內(nèi)穩(wěn)定且可再生的產(chǎn)生編 碼的治療蛋白。另外，轉(zhuǎn)染或感染的初級和次級細(xì)胞能以生理相關(guān)水平在體內(nèi)表達編碼產(chǎn) 物，細(xì)胞能在植入后恢復(fù)，并在重新培養(yǎng)后生長并顯示其植入前的特性。能修飾細(xì)胞，以減 少細(xì)胞表面組織相容性復(fù)合物或外源糖部分，以降低免疫原性，例如普通供體細(xì)胞。
[0139] 此外，脊椎動物（特別是哺乳動物）的初級或次級細(xì)胞能用含有調(diào)節(jié)序列的外源 DNA序列轉(zhuǎn)染或感染。這些調(diào)節(jié)序列的例子包括啟動子、增強子、UAS、支架附著區(qū)或轉(zhuǎn)錄結(jié) 合位點之一種或多種。導(dǎo)向事件能導(dǎo)致DNA序列中插入調(diào)節(jié)序列，將導(dǎo)向的內(nèi)源基因置于 其控制下（例如，通過將啟動子或增強子或此兩者插入內(nèi)源基因或調(diào)節(jié)區(qū)上游）。任選地， 導(dǎo)向事件能同時導(dǎo)致基因的內(nèi)源調(diào)節(jié)序列的缺失，如組織特異性負(fù)調(diào)節(jié)序列的缺失。導(dǎo)向 事件能替換存在的調(diào)節(jié)序列；例如，組織特異性增強子能被替換為比內(nèi)源元件有更寬或不 同細(xì)胞型特異性，或顯示與相應(yīng)未轉(zhuǎn)染或未感染細(xì)胞不同的調(diào)節(jié)或誘導(dǎo)模式的增強子。就 此而言，刪除內(nèi)源序列并加入新序列。此外，內(nèi)源調(diào)節(jié)序列也可不被去除或替換，但被導(dǎo)向 事件破壞或失能，例如通過將外源序列導(dǎo)向內(nèi)源調(diào)節(jié)元件內(nèi)。通過同源重組導(dǎo)入調(diào)節(jié)序列 能產(chǎn)生表達通常不被表達的治療蛋白的初級或次級細(xì)胞。另外，導(dǎo)入調(diào)節(jié)序列能用于以低 于正常的量（以低于生理正常較低水平的量）或以缺陷形式產(chǎn)生或含有治療蛋白的細(xì)胞， 和以生理正常水平產(chǎn)生治療蛋白的細(xì)胞，但其含量或產(chǎn)量將增加。美國專利號5, 641，670、 美國專利號5, 733, 761和美國專利號5, 968, 502描述了激活內(nèi)源編碼序列的方法，其內(nèi)容 在此引用作為參考。
[0140] 轉(zhuǎn)染的或感染的初級或次級細(xì)胞也可含有編碼賦予選擇性表型的選擇性標(biāo)記的 DNA序列，便于其鑒定和分離。生產(chǎn)穩(wěn)定表達該DNA序列的轉(zhuǎn)染初級或次級細(xì)胞的方法，這 些轉(zhuǎn)染細(xì)胞的克隆細(xì)胞株和異源細(xì)胞株，生產(chǎn)克隆和異源細(xì)胞株的方法眾所周知，例如在 美國專利號5, 641，670、美國專利號5, 733, 761和美國專利號5, 968, 502中描述，其內(nèi)容在 此引用作為參考。
[0141] 轉(zhuǎn)染的初級或次級細(xì)胞能通過電穿孔制備。電穿孔以適當(dāng)電壓和電容（和相應(yīng) 的時間常數(shù)）進行，導(dǎo)致DNA構(gòu)件進入初級或次級細(xì)胞。電穿孔能在寬范圍的電壓（例如 50-2000伏）和相應(yīng)電容下進行。一般使用約0. 1-500 μ g的總DNA。
[0142] 此外，能利用公知的方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，如磷酸鈣沉淀、顯微注射、改良磷酸鈣沉淀和 聚凝胺沉淀、脂質(zhì)體融合和受體介導(dǎo)的基因送遞。
[0143] 葡糖腦苷脂酶的加工
[0144] 為防止去除甘露糖殘基而未被處理的細(xì)胞中的寡糖裝配通常如下所述進行：
[0145] GCB的寡糖鏈通過N-糖苷鍵與多肽骨架連接。N-連接的聚糖含有一個酰胺鍵， 它連接寡糖的還原端N-乙酰氨基葡糖（GlcNAc)殘基的異頭碳（C-I)與多肽的天冬酰胺 (Asn)殘基的一個氮。
[0146] N-連接的寡糖裝配的起始不在GCB蛋白的Asn殘基上直接發(fā)生,而是包括脂連接 的14糖前體寡糖的預(yù)裝配，然后在由mRNA翻譯期間或之后不久轉(zhuǎn)移給ER中的蛋白質(zhì)。"前 體寡糖"在此使用時是指參與糖鏈生物合成的初始步驟的寡糖鏈。"前體寡糖"可以是至少 包含下列糖的寡糖結(jié)構(gòu)：Man 9GlcNAc2,例如，前體寡糖可具有下列結(jié)構(gòu)=Glc3Man9GlcNAc 2，如 圖1所示。當(dāng)通過焦磷酸橋與聚類異戊二烯載體脂（一種多萜醇）連接時，前體寡糖合成。 這種裝配涉及至少6種不同的膜結(jié)合糖基轉(zhuǎn)移酶。這些酶中的一些從核苷酸糖轉(zhuǎn)移單糖， 而其它的利用多萜醇-連接的單糖作為糖供體。在完成脂連接的前體的裝配后，另一種膜 結(jié)合酶將其轉(zhuǎn)移給空間上可接近的Asn殘基，它是序列-Asn-X-Ser/Thr-的部分。
[0147] 新合成的GCB的糖基化Asn殘基短時攜帶Glc3Man9GlcNAc 2，在此也被稱為"未加 工的糖鏈"。
[0148] N-連接的寡糖的加工通過大量膜結(jié)合酶的順序作用完成，在將前體寡糖 Glc3Man9GlcNAc2轉(zhuǎn)移給蛋白質(zhì)之后立即開始。術(shù)語"加工"、"修剪"和"修飾"在此可互換 使用。
[0149] N-連接的寡糖加工能分為三個階段：3個葡萄糖殘基的去除，可變數(shù)量的甘露糖 殘基的去除，和多個糖殘基向產(chǎn)生的修剪核心的加入。
[0150] 加工第一階段中葡萄糖殘基的去除包括所有三個葡萄糖殘基的去除，產(chǎn)生N-連 接的 Man9GlcNAc2。該結(jié)構(gòu)在此也被稱為：Mana l-2Mana l-2Mana 1-3 [Mana l-2Mana 1-3 ( Mana l-2Mana l-6)Mana l-6]ManP 1-4G1cNAcP l_4GlcNAc(參見圖 1，結(jié)構(gòu) 9'）。加工通 常持續(xù)到去除甘露糖殘基的第二階段。
[0151] Man9GlcNAc2部分的4個甘露糖殘基通過α -1，2連接結(jié)合。甘露糖苷酶IA、IB和 IC能除去可達4個這樣的α 1，2-連接的甘露糖殘基，產(chǎn)生N-連接的Man5_8GlcNAc2。
[0152] 蛋白質(zhì)-連接的Man5GlcNAc2然后能作為GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I的底物，該酶將 β 1，2-連接的GlcNAc殘基從UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)移給核心α 1，3-連接的甘露糖殘基，形 成GlcNAcMan5Gl cNAc2。甘露糖苷酶II然后能完成該加工途徑的修剪階段，是通過除 去2個甘露糖殘基產(chǎn)生蛋白質(zhì)連接的寡糖，其中含有Man 3GlcNAc2，"五糖核心"。結(jié)構(gòu) GlcNAcMan3GlcNAc2是GlcNAc轉(zhuǎn)移酶II的底物，該酶能將β 1，2-連接的GlcNAc殘基轉(zhuǎn)移 給α 1，6-連接的甘露糖殘基。
[0153] 在修剪階段后，由一系列膜結(jié)合的高爾基體糖基轉(zhuǎn)移酶向延長的寡糖鏈上連續(xù)加 入單糖，這些酶對于受體寡糖、供體糖和糖間形成的鍵型而言都是高度特異的。它們包括不 同的GlcNAc轉(zhuǎn)移酶（產(chǎn)生β 1，2、β 1，4或β 1，6鍵）；半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（產(chǎn)生β 1，4、β 1，3 和α 1，3鍵）；唾液酸轉(zhuǎn)移酶（產(chǎn)生α 2, 3鍵的一種酶，和產(chǎn)生α 2, 6鍵的另一種酶）；巖藻 糖基轉(zhuǎn)移酶（產(chǎn)生α 1，2、α 1，3、α 1，4或α 1，6鍵）；和產(chǎn)生多種異常鍵的不斷增加的其 它酶。這些糖基轉(zhuǎn)移酶的協(xié)同作用產(chǎn)生通稱為"復(fù)合"寡糖的不同結(jié)構(gòu)家族。它們可含有 與不變的核心五糖Man 3GlcNAc2連接的2、3或4個外分支（"天線"）。這些結(jié)構(gòu)根據(jù)其外 分支的數(shù)量是指：二天線（兩個分支）、三天線（三個分支）或四天線（四個分支）。這些 復(fù)合聚糖的大小可能變化。
[0154] 高甘露糖葡糖腦苷脂酶的加工
[0155] 通過減少或防止GCB的細(xì)胞糖修飾（即加工）能產(chǎn)生hmGCB。在防止去除遠離GCB 前體寡糖鏈五糖核心的至少一個甘露糖殘基的條件下產(chǎn)生GCB，能防止糖修飾。例如，能防 止從前體寡糖中除去甘露糖殘基期間的一個或多個"修剪"階段。
[0156] 細(xì)胞甘露糖苷酶歸為兩大類：1類加工酶，包括ER甘露糖苷酶I、高爾基體甘露糖 苷酶IA、IB和1C，能水解α 1，2-連接的甘露糖殘基，其活性需要Ca2+ ;2類加工酶，包括ER 甘露糖苷酶Π 、高爾基體甘露糖苷酶II、胞質(zhì)α甘露糖苷酶和溶酶體α甘露糖苷酶，它們 具有較寬的底物特異性，其活性不需要Ca2+。
[0157] 從前體寡糖上修剪甘露糖殘基至少涉及下列甘露糖苷酶：高爾基體甘露糖苷酶 IA、IB和1C，和高爾基體甘露糖苷酶II。通過在細(xì)胞的N-連接的寡糖裝配過程中抑制一 種或多種這類酶，能產(chǎn)生至少含有一條糖鏈的GCB，該糖鏈除了五糖核心外含有一個或多個 甘露糖殘基。例如，ER甘露糖苷酶I和高爾基體ER甘露糖苷酶I的抑制能產(chǎn)生至少含有 一條糖鏈（優(yōu)選地所有鏈）的hmGCB，該糖鏈含有來自前體寡糖的至少8個甘露糖殘基；高 爾基體甘露糖苷酶II的抑制能產(chǎn)生至少含有一條糖鏈（優(yōu)選地所有鏈）的hmGCB，該糖鏈 含有來自前體寡糖的至少5個甘露糖殘基。
[0158] 例如，使細(xì)胞接觸一種防止從GCB前體寡糖上除去一個或多個甘露糖殘基的物 質(zhì)，或在不能產(chǎn)生或以缺陷水平產(chǎn)生至少一種甘露糖苷酶的細(xì)胞中或在產(chǎn)生突變和/或失 活甘露糖苷酶的細(xì)胞中產(chǎn)生GCB，能抑制甘露糖苷酶引起的修剪。例如，細(xì)胞可以是至少一 種甘露糖苷酶的敲除體，能表達至少一種反義甘露糖苷酶分子，或者對于至少一種甘露糖 苷酶可能是顯性陰性的。
[0159] 防Ih去除甘露糖殘某的物質(zhì)
[0160] 防止從GCB的前體寡糖上除去一個或多個甘露糖殘基的物質(zhì)能用來生產(chǎn)hmGCB制 齊[J。例如，表達GCB的細(xì)胞能接觸一種物質(zhì)，該物質(zhì)可防止去除GCB的前體寡糖的一個或多 個α 1，2甘露糖殘基，和/或去除GCB的前體寡糖的α 1，3甘露糖殘基，和/或去除GCB的 前體寡糖的α 1，6甘露糖殘基。優(yōu)選地，該物質(zhì)是一種甘露糖苷酶抑制劑，例如，1類加工甘 露糖苷酶抑制劑或2類加工甘露糖苷酶抑制劑。
[0161] 細(xì)胞甘露糖苷酶根據(jù)蛋白質(zhì)序列同源性歸于兩大類（Moremen等人（1994) GlyC〇bi〇l〇gy4:113-125)。這兩類在機理上不同。1類酶包括ER甘露糖苷酶I和高爾基 體甘露糖苷酶I同工型，分子量約為63_73kDa，可水解α 1，2_連接的甘露糖殘基，其活 性需要Ca2+。例如，用底物模擬物如甘露糖的吡喃糖類似物處理能阻斷1類加工甘露糖 苷酶。例如，用下列一種或多種酶抑制劑處理能阻斷1類加工甘露糖苷酶：kifunensine、 deoxymannojirimycin或其組合。2類酶包括ER甘露糖苷酶I、高爾基體甘露糖苷酶II、 胞質(zhì)α -甘露糖苷酶和溶酶體α -甘露糖苷酶，具有約為107_136kDa的較大分子量，其 活性不需要Ca2+，具有較寬的底物特異性。例如，用甘露糖基陽離子的呋喃糖過濾態(tài)類似 物處理能阻斷2類加工甘露糖苷酶（Daniels等人（1994)GlycoBiol. 4:551-566)。例如， 用下列一種或多種抑制劑處理能阻斷2類加工甘露糖苷酶：苦馬豆素、6-脫氧-DIM、6-脫 氧 _6_ 氟-DIM、mannostatin A 或其組合。
[0162] Kifunensine能用作內(nèi)質(zhì)網(wǎng)甘露糖苷酶I和/或高爾基體甘露糖苷酶IA和/或 IB和/或IC的抑制劑；deoxymannojirimycin能用作ER甘露糖苷酶I、ER甘露糖苷酶II 和/或高爾基體甘露糖苷酶IA和/或IB和/或IC的抑制劑；苦馬豆素能用作高爾基體甘 露糖苷酶π的抑制劑；mannostatin A能用作高爾基體甘露糖苷酶II的抑制劑。
[0163] 使用甘露糖苷酶抑制劑能抑制寡糖裝配期間甘露糖殘基修剪特定階段后GCB糖 鏈的加工。例如，細(xì)胞與Kifunensine接觸能抑制前體寡糖的任何或1、2、3或4個甘露糖 殘基的修剪。
[0164] 用下列一種或多種酶抑制劑處理細(xì)胞能阻斷加工α -甘露糖苷酶：
[0165] · Kifunensine,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)I和高爾基體甘露糖苷酶I的一種抑制劑（Weng 和 Spiro(1993)J. Biol. Chem. 268:25656-25663 ;Elbein 等人（1990)了^〇1· Chem. 265:15599-15605) 〇
[0166] ?苦馬豆素，高爾基體甘露糖苷酶II的一種抑制劑（Tulsiani等人（1982) J. Biol. Chem. 257:7936-7939) 〇
[0167] · deoxymannojirimycin，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)甘露糖苷酶I和II和高爾基體甘露糖苷酶 I 的一種抑制劑（Weng 和 Spiro (1993)J. Biol. Chem. 268:25656-25663 Jremblay 和 Herscovics (2000) J. Biol. Chem. Jul27 ;[待印刷])。
[0168] · DM(1，4-雙脫氧-1，4-亞氨基-D-甘露糖醇），高爾基體甘露糖苷酶II的一種 抑制劑（Palamarzyk 等人（1985) Arch. Biochem. Biophys. 243:35-45)。
[0169] · 6-脫氧-D頂和6-脫氧-6-氟-DM，高爾基體甘露糖苷酶II的抑制劑 (Winchester 等人（1993) Biochem J. 290:743-749)。
[0170] · mannostatin A，高爾基體甘露糖苷酶II的一種抑制劑（Tropea等人（1990) Biochemistry29:10062-10069)〇
[0171] 可根據(jù)滲入特定細(xì)胞型的能力以及甘露糖苷酶抑制劑的抑制能力選擇不同的甘 露糖苷酶抑制劑。例如，培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞能以時間和濃度依賴的方式快速內(nèi)化苦馬豆素。 苦馬豆素也是2類甘露糖苷酶（如高爾基體甘露糖苷酶II)的一種強抑制劑。因此，苦馬 豆素能用來在培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中產(chǎn)生hmGCB，例如含有至少一條含前體寡糖的至少4個 或5個甘露糖殘基的糖鏈的hmGCB。另外，kifunensine可容易地被培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞攝 取，是1類甘露糖苷酶（如ER甘露糖苷酶I和高爾基體甘露糖苷酶I)的強抑制劑。因此， kifunensine能用來在培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中產(chǎn)生hmGCB，例如含有至少一條含前體寡糖的 至少4、5、6、7、8或9個甘露糖殘基的糖鏈的hmGCB。
[0172] 優(yōu)選地，甘露糖苷酶抑制劑以(λ 025-20. Ομ g/ml、0. 05-10μ g/ml、0. 05-5μ g/ ml、優(yōu)選地約0. 1-2.0 μ g/ml的濃度存在。例如，1類加工甘露糖苷酶抑制劑能以約 0· 025-20. 0 μ g/ml、0. 05-10 μ g/ml、0. 05-5 μ g/ml、優(yōu)選地約 0· 1-2. 0 μ g/ml 的濃度存在； 2類加工甘露糖苷酶抑制劑能以約0. 025-20. Ομ g/ml、0. 05-10μ g/ml、0. 05-5μ g/ml、優(yōu) 選地約0. 1-2. 0 μ g/ml的濃度存在；I類和2類加工甘露糖苷酶抑制劑的每一種均能以約 0· 025-20. 0 μ g/ml、0. 05-10 μ g/ml、0. 05-5 μ g/ml、優(yōu)選地約 0· 1-2. 0 μ g/ml 的濃度存在； 或者1類和2類加工甘露糖苷酶抑制劑的總濃度可以是約0. 025-40. 0 μ g/ml、0. 05-20 μ g/ ml、0. 05-10 μ g/ml、優(yōu)選地約 0· 1_5· 0 μ g/ml。
[0173] 細(xì)胞能接觸一種甘露糖苷酶抑制劑，例如在含有至少一種甘露糖苷酶抑制劑的培 養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。
[0174] 甘露糖苷酶突奪細(xì)朐
[0175] 甘露糖苷酶敲除細(xì)朐
[0176] 甘露糖苷酶基因表達的永久或調(diào)節(jié)滅活能通過用轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA構(gòu)件或合成寡 核苷酸導(dǎo)向甘露糖苷酶基因座位實現(xiàn)。質(zhì)粒構(gòu)件或寡核苷酸可設(shè)計為幾種形式。包括下 列：1)在甘露糖苷酶基因外顯子內(nèi)插入選擇性標(biāo)記基因或其它序列；2)在非編碼序列的調(diào) 節(jié)區(qū)內(nèi)插入外源序列；3)調(diào)節(jié)和/或編碼序列的缺失或置換；和，4)通過位點特異性誘變 改變蛋白質(zhì)編碼序列。
[0177] 在向編碼序列中插入選擇性標(biāo)記基因的情況中，實現(xiàn)內(nèi)源甘露糖苷酶外顯子與改 構(gòu)后含有如一種選擇性標(biāo)記基因的甘露糖苷酶外顯子的框內(nèi)融合是可能的。這樣在成功導(dǎo) 向后，內(nèi)源甘露糖苷酶基因表達一種融合mRNA (甘露糖苷酶序列加選擇性標(biāo)記序列）。而 且，融合mRNA將不能產(chǎn)生功能性甘露糖苷酶翻譯產(chǎn)物。
[0178] 在向調(diào)節(jié)區(qū)中插入DNA序列的情況中，通過破壞內(nèi)源啟動區(qū)或轉(zhuǎn)錄所需的5'非翻 譯區(qū)（5'UTR)中的其它任何區(qū)域能使甘露糖苷酶基因的轉(zhuǎn)錄沉默。這些區(qū)域包括，例如翻 譯控制區(qū)和內(nèi)含子的剪接供體。其次，一種新調(diào)節(jié)序列能插入甘露糖苷酶基因上游，這將使 甘露糖苷酶基因受胞外因子的控制。因此為了最佳hmGCB產(chǎn)生如希望地下調(diào)或抑制甘露糖 苷酶基因表達是可能的。而且，能用一種包含選擇性標(biāo)記和啟動子的序列破壞內(nèi)源序列的 表達。最后，通過適當(dāng)設(shè)計導(dǎo)向底物能刪除所有或部分內(nèi)源甘露糖苷酶基因。
[0179] 為了產(chǎn)生含有至少一個染色體拷貝的人高爾基體甘露糖苷酶IA、IB或IC基因的 敲除的細(xì)胞，分離至少含有基因5'部分（包括調(diào)節(jié)序列、5'UTR、編碼序列）的基因組DNA。 例如，利用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)，能用保藏號為NM005907 (人）的GenBank序列產(chǎn)生針對高 爾基體甘露糖苷酶IA的探針，或者用保藏號AAF97058產(chǎn)生針對高爾基體甘露糖苷酶IB或 IC的探針。用于PCR的寡核苷酸能根據(jù)GenBank序列設(shè)計。得到的探針能與單拷貝的高爾 基體甘露糖苷酶IA、IB或IC基因雜交。然后能用該探針篩查可商品獲得的重組噬菌體文 庫（例如由人基因組DNA制成的文庫），以分離含有全部或部分甘露糖苷酶I結(jié)構(gòu)基因的克 隆。一旦分離含有甘露糖苷酶調(diào)節(jié)和/或編碼序列的重組克隆，即可構(gòu)建用來滅活甘露糖 苷酶基因表達的特異導(dǎo)向質(zhì)粒。甘露糖苷酶活性的滅活是由于向調(diào)節(jié)或編碼序列中插入外 源DNA，而破壞了翻譯閱讀框。該酶的滅活也可能是mRNA轉(zhuǎn)錄或mRNA加工破壞的結(jié)果，或 者是由于內(nèi)源甘露糖苷酶調(diào)節(jié)或編碼序列的缺失。
[0180] 其它1類和2類加工甘露糖苷酶的核酸序列也可獲得，例如從GenBank獲得。利 用以上對于高爾基體甘露糖苷酶IA、IB或IC所述的方法，能產(chǎn)生其它1類和/或2類加工 甘露糖苷酶的敲除細(xì)胞。
[0181] 甘露糖苷酶敲除細(xì)胞例如能用于基因治療。能對患者（如戈謝病患者）施用敲除 細(xì)胞，使細(xì)胞在體內(nèi)產(chǎn)生hmGCB。
[0182] 反義甘露糖苷酶核酸序列
[0183] 相對于編碼甘露糖苷酶（如1類加工或2類加工甘露糖苷酶）的核苷酸反義的核 酸分子能作為抑制甘露糖苷酶表達的滅活劑。例如，高爾基體甘露糖苷酶IA、高爾基體甘露 糖苷酶IB、高爾基體甘露糖苷酶IC和/或高爾基體甘露糖苷酶II表達能被反義核酸分子 抑制。"反義"核酸包括與編碼甘露糖苷酶的"有義"核酸互補，例如與雙鏈cDNA分子的編 碼鏈互補或與mRNA序列互補的核苷酸序列。因此，反義核酸能與有義核酸形成氫鍵。反義 核酸能與完整甘露糖苷酶編碼鏈或只是與其一部分互補。例如，能使用相對于編碼甘露糖 苷酶的核苷酸序列的編碼鏈"編碼區(qū)"反義的反義核酸分子。
[0184] 由于在例如 Bause (1993) Eur. J. Biochem. 217(2) :535-540 ;Gonzalez 等人 (1990) J. Biol. Chem. 274 (30) : 21375-21386 ;Misago 等人（1995)卩1'〇。.恥七1.八。&(1.5(^· USA92 (25) :11766-11770 ;Tremblay 等人（1998) Glycobiology8 (6) :585-595 Jremblay 等 人（2000) J. Biol. Chem. Jul27:[電子出版物，待印刷]中公開了編碼多種甘露糖苷酶的編 碼鏈序列，可根據(jù)Watson和Crick堿基配對原則設(shè)計反義核酸。反義核酸分子能包含與甘 露糖苷酶mRNA的完整編碼區(qū)互補的序列，但更優(yōu)選地是只與甘露糖苷酶mRNA的編碼區(qū)或 非編碼區(qū)的一部分互補的寡核苷酸。例如，反義寡核苷酸能包含與甘露糖苷酶mRNA翻譯起 始位點周圍的區(qū)域互補的序列。反義寡核苷酸的長度可以是，例如約5、10、15、20、25、30、 35、40、45、50或更多個核苷酸。反義核酸能用本領(lǐng)域周知的方法用化學(xué)合成法和酶連接反 應(yīng)構(gòu)建。例如，能用自然存在的核苷酸或為了提高分子生物學(xué)穩(wěn)定性或提高反義和有義核 酸之間形成的雙螺旋的物理穩(wěn)定性而不同修飾的核苷酸化學(xué)合成反義核酸（例如反義寡 核苷酸），例如，能使用硫代磷酸衍生物和吖啶取代的核苷酸。能用來產(chǎn)生反義核酸的修飾 核苷酸的例子包括：5_氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌 呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥甲基）尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨甲基 尿啼陡、二氫尿啼陡、β-D-galactosylqueosine、肌苷、N6-異戊烯基腺噪呤、1-甲基鳥噪 呤、1-甲基肌苷、2, 2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲 基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧 陡、β -D-mannosylqueosine、5'_甲氧基羧甲基尿啼陡、5-甲氧基尿啼陡、2-甲硫基-N6-異 戊烯基腺噪呤、尿啼陡 _5_氧乙酸（V)、ybutoxosine、假尿啼陡、queosine、2_硫胞啼陡、 5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿 嘧啶-5-氧乙酸（v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基）尿嘧啶、（acp3)w 和2, 6-二氨基嘌呤。此外，也能用以反義方向（即，由插入核酸轉(zhuǎn)錄的RNA相對于目的靶 核酸是反義方向的）亞克隆了一種核酸的表達載體生物學(xué)產(chǎn)生反義核酸。
[0185] hmGCB 的鈍化
[0186] 術(shù)語"純化的"hmGCB在此使用時是指當(dāng)由表達GCB的細(xì)胞產(chǎn)生時基本上不含細(xì)胞 物質(zhì)的hmGCB。詞語"基本上不含細(xì)胞物質(zhì)"包括蛋白質(zhì)與產(chǎn)生細(xì)胞的成分分開的hmGCB制 齊U。在一個實施方案中，詞語"基本上不含細(xì)胞物質(zhì)"包括含有不到約30% (干重）非GCB 蛋白（也稱為"蛋白質(zhì)雜質(zhì)"或"污染蛋白"）、更優(yōu)選地不到約20%的非GCB蛋白、更優(yōu)選 地不到約10%的非GCB蛋白、最優(yōu)選地不到約5%的非GCB蛋白的hmGCB制劑。當(dāng)從培養(yǎng) 基中獲得（即收獲）hmGCB時，也優(yōu)選地基本上不含培養(yǎng)基成分，S卩，培養(yǎng)基成分不到蛋白質(zhì) 制品干重的約20%、更優(yōu)選地不到約10%、最優(yōu)選地不到約5%。
[0187] 能用多種方法從培養(yǎng)基中收獲hmGCB。術(shù)語"收獲的hmGCB"在此使用時是指從培 養(yǎng)基或從細(xì)胞中獲得的hmGCB。例如，能用下列備選方法之一在純化步驟之前制備收獲的 hmGCB。可包括：1)過濾新鮮收獲物；2)過濾新鮮收獲物，并在約-20°C到_80°C下冷凍過濾 的產(chǎn)物直到準(zhǔn)備加工（此時可融解，任選地過濾）；3)過濾新鮮收獲物，濃縮過濾產(chǎn)物（例 如,約8-10倍），然后任選地再次過濾；4)過濾新鮮收獲物，濃縮過濾產(chǎn)物（例如，約8-10 倍），任選地再次過濾，然后在約_20°C到_80°C下冷凍過濾的產(chǎn)物直到準(zhǔn)備加工（此時可 融解，任選地過濾）。也可進行這些備選方法的變更方法。例如，當(dāng)冷凍收獲產(chǎn)物或濃縮的 收獲產(chǎn)物時，不同收獲物能在融解和過濾后合并。另外，對于收獲的或濃縮的收獲產(chǎn)物，能 將產(chǎn)物在純化之前保持在冷卻溫度下例如約2°C到8°C下較短時間，例如約1-3天，優(yōu)選地 1天。在純化之前能合并保持在冷卻溫度下的收獲產(chǎn)物。
[0188] 當(dāng)進行收獲物的濃縮時，能使用分子量截止值為5000-50000、優(yōu)選地 10000-30000的超濾膜。過濾澄清一般使用1. 2 μ m/0. 5 μ m預(yù)過濾器，隨后用0. 2 μ m終過 濾器。
[0189] HmGCB能用下列純化技術(shù)純化。例如，能用疏水電荷誘導(dǎo)層析（HCIC)純化hmGCB 制劑。此外，也能用疏水作用層析（HIC)純化hmGCB制劑。HCIC和HIC均在下面描述。
[0190] HCIC和HIC能單獨使用或與一個或多個離子交換步驟結(jié)合使用。能與HCIC或 HIC步驟結(jié)合使用的離子交換步驟（在HCIC或HIC之前或之后）包括使用陰離子交換 和/或陽離子交換層析。在蛋白質(zhì)純化中使用的公知可購得的陰離子交換載體具有季銨 功能基團。本方法中使用的優(yōu)選基質(zhì)是基于瓊脂糖或纖維素的基質(zhì)，如微晶纖維素或交 聯(lián)瓊脂糖。含有-乙基氣乙基、二乙基氣甲基或二甲基氣甲基功能基團的基質(zhì)也是特別 優(yōu)選的。一種特別優(yōu)選的陰離子交換基質(zhì)是可以購得的三甲基氨甲基交聯(lián)瓊脂糖，如， Q-Sepharose Fast Flow? (Pharmacia)?？稍诘鞍踪|(zhì)純化中使用的公知可購得的陽離 子交換載體具有酸性功能基，包括羧基和磺酸。含有陽離子功能基的基質(zhì)包括多種形式 的基于纖維素和聚苯乙烯的基質(zhì)。例如，本領(lǐng)域公知的弱陽離子交換劑包括但不限于：羧 甲基-Sepharose?和羧甲基-纖維素?。本領(lǐng)域公知的強陽離子交換劑包括但不限 于：磺化聚苯乙烯（AG 50W?, Bio-Rex 70? )、磺化纖維素（SP- Sephadex? )和磺 化 Sepharoses(S- Sepharoses? )。一種特別優(yōu)選的陽離子交換基質(zhì)是S-S印haroses Fast Flow? (Pharmacia)。
[0191] 涉及這些基質(zhì)的層析步驟最優(yōu)選地作為柱層析步驟或以另一種分批吸附技術(shù)進 行，任選地能在25°C至40°C的溫度下進行。優(yōu)選地，向洗滌或洗脫緩沖液中加入一種鹽以 提高緩沖液的離子強度。如果能被本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地測定，常規(guī)使用的任何鹽均可用 于這一目的，NaCl是最常用的鹽之一。
[0192] 一種常規(guī)凝膠過濾步驟也能與HCIC或HIC層析步驟組合使用。這些基質(zhì)的代 表性實例是與丙烯酰胺交聯(lián)的葡聚糖，如烯丙基葡聚糖與Ν，Ν' -亞甲基雙丙烯酰胺和 交聯(lián)纖維素或瓊脂糖凝膠共價交聯(lián)制備的復(fù)合親水凝膠?？少彽玫慕宦?lián)葡聚糖-丙烯 酰胺的商品名為Sep h aery 1?，可從Pharmac i a獲得?？少彽玫慕宦?lián)葡聚糖-瓊脂糖 樹脂的商品名為Superdex?，可從 Pharmacia 獲得。 一種優(yōu)選的Superdex?凝膠 是Superdex 200?o交聯(lián)纖維素凝膠的例子是可購得的交聯(lián)多孔纖維素凝膠，例如可從 Amicon Inc.獲得的GLC 300?或GLC .1.000@〇能使用基于娃石的樹脂如可從TosoHaas 獲得的 TSK-Gei SW??；诰酆衔锏臉渲?TSK-Gei P\￥?、TSK Alpha Series?、 Toyopearl 麗 packings? (乙二醇與丙烯酸甲酯聚合物的共聚作用）也可從TosoHaas 獲得。
[0193] 優(yōu)選地，HCIC或HIC能與這些離子交換步驟中的一種或多種組合。當(dāng)使用HCIC或 HIC與不同離子交換或凝膠過濾步驟的組合時，它們能以任何順序進行。例如，如下所述，能 進行一種四步方法，包括利用MEP Hypercel?層析的HCic或利用MacroPr印Methyl? 層析的 HIC，然后是 Q Sepharose Fast Fl〇W?、SP Sepharose Fast FlOW?和最后的 Superdex 200?。以下更詳細(xì)地敘述了幾種這樣的方法。
[0194] MEP Hypercel 層析
[0195] MEP(巰基乙基吡啶）Hypercel? (BioS印ra, Life Technologies)能用于HCIC。 它是一種由與再生的多孔纖維素珠（80-100微米）連接的NEP組成的樹脂。由疏水尾和可 電離首基組成的功能基團（MEP)在中性pH下不帶電荷，在生理離子強度下基于疏水相互作 用能結(jié)合特定的蛋白質(zhì)配基。通過將PH由4提高為5進行洗脫，此時MEP帶正電，由于靜 電排斥蛋白質(zhì)從柱上洗脫。例如，制備的收獲物或收獲濃縮物能直接加到用含ISOmM氯化 鈉和2mM DTT的25mM磷酸鈉，pH6. 8平衡的MEP柱上。任選地，用含25mM辛酸鈉的平衡緩 沖液洗滌該柱，直到280nm的吸光度（A280)穩(wěn)定。能用50mM乙酸鈉、2mM DTT，pH4. 7從柱 上洗脫hmGCB，收集在280nm下監(jiān)測到的峰。
[0196] MacroPrep Methyl 層析
[0197] MEP Hypercel?的一種備選物是MacroPr印Methyl? ,它是一種疏水作用 層析（HIC)樹脂。該樹脂由與多孔共聚乙二醇異丁烯酸和二甲基丙烯酸二甘醇酯的珠組 合物連接的甲基功能基團組成。例如，MacroPrep Methyl? (BioRad)層析能如下進行。 將收獲物或收獲濃縮物的pH調(diào)節(jié)為5. 6,加入硫酸銨至終濃度為0. 70M。制備的收獲物加 到用0. 70M硫酸銨、IOmM MES，pH5. 6平衡的MacroPr印Methyl?柱上。加樣后，用平衡 緩沖液洗滌該柱，直到A280回到基線。用IOmM MES，pH5. 6洗脫hmGCB。超濾和/或滲濾 洗脫的hmGCB，準(zhǔn)備進行離子交換步驟，如Q Sepharose層析、SP Sepharose層析和/或 Superdex200 層析。
[0198] Q Sepharose 層析
[0199] Q Sepharose Fast Fl〇W? (Amersham Pharmacia)是一種相對較強的陰離子交 換層析樹脂。功能取代基是一種季胺基，它在PH2-12的工作pH范圍內(nèi)帶正電。在工作pH 下帶凈負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在相對較低的離子強度下傾向于結(jié)合樹脂，在較高離子強度或較低 pH下能被洗脫。在接近pH6和低離子強度下，hmGCB不能結(jié)合Q Sepharose,但雜質(zhì)可以 結(jié)合，由此純化樣品。例如，能用下列方案經(jīng)Q Sepharose Fast Fl〇W?層析純化樣品中 的hmGCB。在適當(dāng)?shù)臈l件下，hmGCB流經(jīng)該柱，于是產(chǎn)物出現(xiàn)于流通/洗滌級分中。向如上 所述制備的MEP洗脫合并液中加入磷酸鈉（250mM，pH6)至終濃度為25mM，用NaOH(必要時 用HC1)將合并液的pH調(diào)節(jié)為pH6。通過用水稀釋或用接近pH6的25mM磷酸鈉、2mM DTT 超濾和/或滲濾，將傳導(dǎo)率調(diào)節(jié)為2. 5±0. lmS/cm。然后過濾該物質(zhì),加到用25mM磷酸鈉、 2mM DTT，pH6平衡的Q S印harose Fast Flow?柱上。加樣后，用平衡緩沖液洗滌該柱， 直到A280達到基線。之后不久，例如在24小時內(nèi)，流通/洗滌級分可通過另一個柱子（如 SP Sepharose Fast F丨OW?柱），或者在進一步處理之前在約-20°C到_80°C下凍存。
[0200] 能使用其它強陰離子交換樹脂，如Macro-Prep High Q Support? (BioRad), 代替Q Sepharose。也能使用較弱的陰離子交換樹脂如DEAE Sepharose Fast Flow? (Pharmacia)或 Macro-Prep DEAE? (BioRad)。該柱用緩沖液（如 25mM 磷酸鈉，pH6) 平衡。調(diào)節(jié)樣品的PH為pH6,通過稀釋或滲濾為相對較低的離子強度調(diào)節(jié)傳導(dǎo)率，這使雜質(zhì) 結(jié)合于柱上，而hmGCB流過。加樣，用平衡緩沖液洗柱。雜質(zhì)仍結(jié)合于柱上，能用鹽如氯化 鈉或氯化鉀，或用較低PH的緩沖液，或增多的鹽和較低pH的組合洗脫。
[0201] 也能使hmGCB在加樣期間與陰離子交換柱結(jié)合，方法包括降低加樣中的鹽濃度， 或在較高pH下使用該柱，或減少鹽和較高pH的組合。
[0202] SP Sepharose 層析
[0203] SP Sepharose Fast Fl〇W? (Amersham Pharmacia)是一種相對較強的陽離子交 換層析樹脂。功能取代基是帶電的磺酸基，它在PH2-12的工作pH范圍內(nèi)帶負(fù)電荷。在工 作pH下帶凈正電荷的蛋白質(zhì)在相對較低的離子強度下傾向于結(jié)合樹脂，在較高離子強度 或較高pH下能被洗脫。在接近pH6和中離子強度（例如6. 5mS/cm)下，hmGCB能結(jié)合SP Sepharose，在較高離子強度（例如10. 7mS/cm)下能被洗脫。在hmGCB洗脫條件下雜質(zhì)蛋 白仍結(jié)合于SP Sepharose,由此純化樣品中的hmGCB。例如，能用下列方案經(jīng)SP Sepharose Fast ?1(^@層析純化hmGCB。向Q Sepharose?流通/洗滌液中加入氯化鈉（2. OM貯 存液）直到傳導(dǎo)率為6. 3mS/cm。檢查pH，必要時重新調(diào)節(jié)為pH6.0。然后，繼續(xù)加入氯化鈉 貯存液直到傳導(dǎo)率為6. 5mS/cm。過濾該物質(zhì)，加到用25mM磷酸鈉、44mM氯化鈉，pH6. 0平 衡的SP S印harose Fast Fl〇W?柱上。加樣后，用平衡緩沖液洗柱，直到達到基線，并用 25mM磷酸鈉、84mM氯化鈉，pH6. 0洗脫。HmGCB存在于洗脫級分中。
[0204] 另一種陽離子交換樹脂，例如 Source 30S? (Pharmacia)、CM Sepharose Fast Flow? (Pharmacia)、Macro-Prep CM Support? (BioRad)或 Macro-Prep High S Support? (BioRad)能作為SP S印harose的備選物。在接近pH6和低到中度離子強 度下，如4-7mS/cm，hmGCB能與該柱結(jié)合。用一種緩沖液（如IOmM檸檬酸鈉，pH6. 0, IOmM MES，pH6. 0, 25mM磷酸鈉，pH6. 0)或在pH6. 0時有足夠緩沖能力的其它緩沖液平衡該柱。通 過稀釋或滲濾調(diào)節(jié)樣品的離子強度，直到適合與該柱結(jié)合的水平。樣品加于柱上，加樣后洗 柱以除去未結(jié)合的物質(zhì)。用一種鹽（如氯化鈉或氯化鉀）從柱上洗脫hmGCB。此外，也能用 較高pH或較高鹽濃度與較高pH結(jié)合的緩沖液從柱上洗脫hmGCB。
[0205] 也可使hmGCB在加樣過程中流經(jīng)陽離子交換柱，方法包括提高平衡緩沖液和加樣 樣品中的鹽濃度，在較高pH下使用該柱，或增多的鹽和較高pH的組合。
[0206] Superdex200 層析
[0207] Superdex200prep grade? (Amersham Pharmacia)用于 hmGCB 的大小排阻層 析，由此根據(jù)大小、分子量、撞擊（strokes)半徑或流體體積分離分子。Superdex200由 與瓊脂糖共價交聯(lián)的葡聚糖組成，對于球狀蛋白質(zhì)有10000-60000分子量的分級分離范 圍。例如，能用下列方案經(jīng)Superdex 200?層析純化hmGCB。SP洗脫合并液用IOOOOmw 截止值的膜超濾濃縮。過濾濃縮的合并液，然后加于用50mM檸檬酸鈉，pH6.0平衡的 Superdex200prep grade?柱上。收集最初級分中柱流出液的A280,例如，運行8-16% SDS 聚丙烯酰胺凝膠，確定級分的合并?？筛鶕?jù)銀染色凝膠的目視檢查判斷合并。
[0208] 也能用其它大小排阻層析樹脂如S印hacryl S-200 HR?、Bio_Gel Al.5m? 或TosoHaas TSK Gel樹脂純化hmGCB。用于hmGCB大小排阻層析的緩沖液是50mM檸檬酸 鈉，pH6. 0。也能使用其它緩沖液，如含有0. 15M氯化鈉的25mM磷酸鈉，pH6. 0。緩沖液的 pH可以為pH5-7,應(yīng)當(dāng)有足夠的離子強度使得與柱的離子相互作用最小。
[0209] 上述任何純化方案中pH、緩沖液和/或鹽濃度的改變能用常規(guī)方法進行，以獲得 希望的純化產(chǎn)物。
[0210] 測定巨噬細(xì)朐攝取和hmGCB的細(xì)朐導(dǎo)向的試駘
[0211] 例如通過測定巨噬細(xì)胞中的蛋白質(zhì)水平和/或酶活性可測定巨噬細(xì)胞對hmGCB的 攝取率。例如，如以下實施例和Diment等人（1987) J. Leukocyte Biol. 42:485-490所述， 能用利用巨噬細(xì)胞系的一種體外試驗測定hmGCB的完全攝取和甘露糖受體特異的攝取。
[0212] 另外，肝細(xì)胞對hmGCB和GCB的攝取的體內(nèi)對比能如Friedman等人（1999) Bl〇〇d93:2807-2816所述確定。簡言之，能對一種小鼠模型注射hmGCB或GCB，然后在不久后 殺死。用動物肝臟制備肝細(xì)胞（如實質(zhì)細(xì)胞、枯否細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞）懸液。然后分 離細(xì)胞，根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定，測定不同肝細(xì)胞型中hmGCB和GCB的蛋白質(zhì)水平和/或酶活性。 此外，也可用免疫組化檢測將hmGCB定位于所治療動物的組織中的特定細(xì)胞或細(xì)胞型。
[0213] 藥用纟目合物
[0214] 高甘露糖葡糖腦苷脂酶（hmGCB)能摻入適于對患者（如病人）施用的藥用組合 物中。該組合物可包含足夠劑量的hmGCB來治療戈謝病患者。在此使用時，詞語"藥學(xué)可 接受的載體"是指包括適于藥用的任何和所有溶劑、賦形劑、分散劑、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真 菌劑、等滲和吸收延遲劑等。這些基質(zhì)和藥劑用于藥學(xué)活性物質(zhì)的使用在本領(lǐng)域中眾所周 知。只要不是任一常規(guī)基質(zhì)或藥劑不適于活性化合物，這種基質(zhì)即能在本發(fā)明的組合物中 使用。補充的活性化合物也能摻入組合物中。
[0215] 配制本發(fā)明的藥用組合物使其適于預(yù)期的施用途徑。施用途徑的例子包括腸胃 夕卜，例如靜脈內(nèi)、皮內(nèi)和皮下施用。優(yōu)選地，施用途徑是靜脈內(nèi)。用于腸胃外施用的溶劑或 懸液可包含下列成分：無菌稀釋劑，如注射用水、鹽溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或 其它合成溶劑；抗細(xì)菌劑，如苯甲醇或甲基對羥基苯甲酸脂；抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫 酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸；緩沖液，如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽和用于調(diào)節(jié)張力 的試劑如氯化鈉或右旋葡萄糖。PH能用酸或堿（如鹽酸或氫氧化鈉）調(diào)節(jié)。腸胃外制劑能 包封于由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量瓶中。
[0216] 適于注射使用的藥用組合物包括無菌水溶液（水溶時）或分散和無菌粉末，例如 凍干的制劑，用于臨時制備無菌注射液或分散。對于靜脈內(nèi)施用，合適的載體包括生理鹽 水、制菌水、Cremophor EL?(BASF, Parsippany, NJ)或磷酸鹽緩沖液（PBS)。在所有情況下， 組合物必須是無菌的，并且應(yīng)當(dāng)是流體以便具有易注射性。它在生產(chǎn)和貯存條件下必須穩(wěn) 定，并且必須可在保存中防止微生物如細(xì)菌和真菌的污染作用。載體可以是溶劑或分散介 質(zhì)，包括如水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等），及其適當(dāng)?shù)幕旌衔铩?例如，使用包被如卵磷脂，在分散時保持需要的顆粒大小，使用表面活性劑，能保持適當(dāng)?shù)?流動性。預(yù)防微生物的作用能用多種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑實現(xiàn)，例如，對羥基苯甲酸酯類、 氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等。在許多情況下，組合物中優(yōu)選地包含等滲劑，例如糖、多 元醇，如甘露糖醇、山梨糖醇、氯化鈉。在組合物中含有延遲吸收的試劑，如一硬脂酸鋁、人 血清白蛋白和明膠，能使可注射組合物的穩(wěn)定性延長。
[0217] 無菌注射液能如下制備：在含有上述一種或組合的成分的適當(dāng)溶劑中摻入需要量 的hmGCB，必要時，隨后過濾除菌。一般通過向含有基本分散劑和需要的上述其它成分的無 菌載體中摻入活性化合物進行分散。對于用于制備無菌注射液的無菌粉末，優(yōu)選的制備方 法是真空干燥和冷凍干燥，例如凍干，這產(chǎn)生活性成分加預(yù)先無菌過濾溶液的希望的其它 任何成分的粉末。
[0218] 在一個優(yōu)選實施方案中，活性化合物用可保護化合物免于從體內(nèi)快速消除的載體 制備，例如控釋制劑，包括植入物和微膠囊輸送系統(tǒng)。能使用可生物降解的、生物相容的聚 合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。這些制劑的制備方法 為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。材料也能從Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals, Inc.購 得。脂質(zhì)體懸液（包括針對用病毒抗原的單克隆抗體感染的細(xì)胞的脂質(zhì)體）也能用作藥學(xué) 可接受的載體。它們能按照本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法制備，如美國專利號4, 522, 811所 述。
[0219] 戈謝病的治療
[0220] HmGCB，例如任何hmGCB分子或此處所述的制劑，能用來治療戈謝病患者。此外，也 能將此外所述的任何甘露糖苷酶敲除細(xì)胞導(dǎo)入戈謝病患者中，以對患者輸送hmGCB。能使用 不同施用途徑和不同部位。在植入個體中后，敲除細(xì)胞能產(chǎn)生hmGCB。
[0221] 優(yōu)選地，使用的敲除細(xì)胞一般是患者特異的遺傳工程細(xì)胞。但是，從同種不同個體 或從不同種獲得細(xì)胞也是可能的。使用這些細(xì)胞可能需要施用免疫抑制劑，改變組織相容 性抗原，或使用可預(yù)防植入細(xì)胞排斥的屏障裝置。
[0222] 戈謝病是一種常染色體隱性溶酶體貯積病，其特征在于溶酶體酶葡糖腦苷脂酶 (GCB)缺陷。GCB水解在白細(xì)胞和紅細(xì)胞膜中的鞘糖脂降解后形成的糖脂葡糖腦苷脂。如 果GCB水解不充分，則葡糖腦苷脂能在巨噬細(xì)胞（戈謝細(xì)胞）中積累，導(dǎo)致貧血、血小板減 少、器官肥大和嚴(yán)重的骨骼問題。
[0223] 戈謝病有幾種類型，包括1型、2型和3型戈謝病，可由于GCB基因的不同突變而引 起。能對戈謝病患者施以"治療有效量的"hmGCB，即足以治療戈謝病的hmGCB的劑量。術(shù)語 "治療"在此使用時是指減少或抑制戈謝病的一種或多種癥狀。I型戈謝病的癥狀包括：骨骼 并發(fā)癥，如骨痛、骨損傷、骨質(zhì)減少、骨壞死、無血管性壞死和病理性骨折；貧血；肝脾腫大； 脾節(jié)結(jié)和肝功能障礙；血小板減少；和/或生長和青春期發(fā)育延遲。II型戈謝病的癥狀包 括I型戈謝病的癥狀，以及頸強直、冷漠、緊張、斜視、深反射和喉痙攣增強。III型戈謝病的 癥狀除了發(fā)作較輕和較晚外類似于II型戈謝病。
[0224] 治療有效量的hmGCB可根據(jù)個體確定，至少部分地基于患者體重、使用的藥劑、使 用的施用系統(tǒng)的類型、相對于疾病嚴(yán)重程度的施用時間，以及是使用單劑量、多劑量還是控 釋劑量方案。優(yōu)選地，足以治療戈謝病的hmGCB的劑量低于人組織產(chǎn)生的或人胎盤產(chǎn)生的 GCB的量，或細(xì)胞體外產(chǎn)生、然后修飾暴露核心甘露糖殘基的GCB。
[0225] 其它溶酶體貯積病的治療
[0226] 此處所述的本發(fā)明一般能用來生產(chǎn)可導(dǎo)向在表面表達甘露糖受體的任何細(xì)胞的 蛋白質(zhì)。因此，此處所述的本發(fā)明能用來治療希望向甘露糖受體表達細(xì)胞導(dǎo)向一種治療蛋 白質(zhì)的任何疾病。例如,此處所述的本發(fā)明也能用于其它溶酶體貯積酶和其它溶酶體貯積 病，其中細(xì)胞（如網(wǎng)狀內(nèi)皮來源的細(xì)胞）積累未消化的底物。網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞包括肝臟中 的巨噬細(xì)胞、枯否細(xì)胞和脾中的組織細(xì)胞。這些溶酶體貯積病包括但不限于法韋爾病和 Neimann-Pick 病。
[0227] 法韋爾病是一種常染色體隱性溶酶體貯積病，其特征在于酸性神經(jīng)酰胺酶缺陷。 神經(jīng)酰胺酶是引起神經(jīng)酰胺降解的酶。如果神經(jīng)酰胺降解不充分，則神經(jīng)酰胺積累，導(dǎo)致 肉芽腫形成和組織細(xì)胞反應(yīng)（Moser，H.W.神經(jīng)酰胺酶缺陷：法韋爾脂肪肉芽腫癥；于：《遺 傳病的代謝與分子基礎(chǔ)》（C. R. Scriver，A. L. Beaudet，W. S. Sly和D. Valle編寫），第7版， 2589-2599 頁，McGraw-Hill Inc.，紐約（1995))。
[0228] 法韋爾病有幾種類型，包括I型、2型、3型、4型和5型法韋爾病，它們在嚴(yán)重程度 和主要組織參與部位上不同。也有6型和7型法韋爾病。能對法韋爾病患者施以高甘露糖 酸性神經(jīng)酰胺酶，以治療（即緩解或減少）該疾病的至少一種癥狀。1型法韋爾病的癥狀包 括：關(guān)節(jié)（特別是指骨間、掌、踝、腕、膝和肘關(guān)節(jié)）腫脹，與患處關(guān)節(jié)有關(guān)的和壓點上可觸及 的結(jié)節(jié)，可發(fā)展為失聲的撕叫，進食和呼吸困難，體重增加較差和間歇性發(fā)熱。這些癥狀一 般在2周和4個月大之間發(fā)生。2型和3型法韋爾病的癥狀包括：皮下結(jié)節(jié)、關(guān)節(jié)變形和累 及喉。這些患者比1型法韋爾病患者存活期長。5型法韋爾病的癥狀包括從1到2. 5歲時 開始的精神運動性退化。
[0229] A型和B型Neimann-Pick病是常染色體隱性溶酶體貯積病，其特征在于酸性鞘 磷脂酶缺陷。酸性鞘磷脂酶是一種引起鞘磷脂降解的酶。如果鞘磷脂酶缺陷，鞘磷脂和其 它脂類能在單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)中積累（Schuman，E. H.和Desnick，R. J. A型和B型 Neimann-Pick?。核嵝郧柿字溉毕?；于：《遺傳病的代謝與分子基礎(chǔ)》（C. R. Scriver, A. L. Beaudet, W. S. Sly 和 D. Valle 編寫），第 7 版，2589-2599 頁，McGraw-Hill Inc.，紐約 (1995))。
[0230] Neimann-Pick病有幾種類型，包括A型和B型。能對Neimann-Pick病患者施以高 甘露糖酸性鞘磷脂酶，以治療（即緩解或減少）該病的至少一種癥狀。A型Neimann-Pick 病的癥狀包括：脾和肝增大、淋巴結(jié)病、小細(xì)胞性貧血、血小板計數(shù)減少、張力減退、肌 無力、精神運動性阻抑。B型Neimann-Pick病的癥狀包括：肝和/或脾增大、肝脾腫大 (heptospIenomegaly);月市損傷。
[0231] 因此，高甘露糖溶酶體貯積酶如高甘露糖酸性神經(jīng)酰胺酶或高甘露糖酸性鞘磷脂 酶能用此處所述的方法產(chǎn)生，以便將這些蛋白質(zhì)導(dǎo)向甘露糖受體表達細(xì)胞。 實施例
[0232] 在使用表達Gene-Activated? GCB(GA-GCB)的HT-1080細(xì)胞的實驗中，細(xì)胞用濃 度為0· 1-2 μ g/mL的kifunensine或苦馬豆素處理。
[0233] kifunensine 或苦馬豆素對 GA-GCB 糖型（glycoform)的作用
[0234] 將產(chǎn)生GA-GCB的HT-1080細(xì)胞一式兩份接種于6孔板上，并將生產(chǎn)培養(yǎng)基調(diào)節(jié)為 以下的kifunensine或苦馬豆素濃度：0(無藥物）、0. 1、0.25、0.5、1和2μ g/mL。收獲培養(yǎng) 基，每24小時重新補充細(xì)胞共三天。對第三天的樣品進行等電聚焦（IEF)分析。通過IEF 分析顯示kifunensine和苦馬豆素對GA-GCB的分子電荷的影響。對于這兩種藥物，都觀察 到表觀等電點（Pl)的濃度依賴的提高，在最高測試濃度（2 μ g/ml)時，kifunensine比苦 馬豆素引起更大的Pl遷移。
[0235] kifunensine或苦馬豆素對GA-GCB產(chǎn)牛.的影口向
[0236] 10個搖瓶（每個表面積1700cm2)的生長培養(yǎng)基（含10%小牛血清的DMEM)中接 種產(chǎn)生GA-GCB的HT-1080細(xì)胞。在生長兩周后，吸出培養(yǎng)基，向三組搖瓶中加入新鮮生產(chǎn) 培養(yǎng)基（DMEM/F12,0%小牛血清）。兩組4只搖瓶用lyg/mL kifunensine或苦馬豆素處 理。第三組兩只搖瓶不接受藥物處理。大約24小時后，從每個搖瓶中收獲培養(yǎng)基，合并，對 樣品進行GA-GCB酶活性分析。這一步驟重復(fù)7天。對于所有搖瓶，在7種日收獲物中都觀 察到GA-GCB的穩(wěn)定產(chǎn)生（表1)。然而，酶的絕對水平因藥物處理組而不同，在7種收獲物 中觀察到以下平均GA-GCB產(chǎn)生水平：38. 3±3. 5mg/L(對照，未藥物處理）、24. 5±4. Omg/ L(苦馬豆素，1 μ g/ml)和 21. 3±2. 8mg/L(kifunensine, 1 μ g/ml)。因此，這兩種藥物都導(dǎo) 致穩(wěn)定的、但是較低的產(chǎn)生水平，kifunensine見到最大降低（與對照相比降低44% )。
[0237] 表1.甘露糖苷酶抑制劑處理的細(xì)胞中葡糖腦苷脂酶的搖瓶生產(chǎn)
[0238]
【權(quán)利要求】
1. 一種生產(chǎn)高甘露糖葡糖腦苷脂酶（hmGCB)的方法，包括： 提供一種能表達葡糖腦苷脂酶（GCB)的細(xì)胞；和 在防止去除遠離GCB前體寡糖的五糖核心的至少一個甘露糖殘基的條件下生產(chǎn)含有 前體寡糖的GCB，從而生產(chǎn)一種hmGCB制劑。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中防止去除遠離五糖核心的一個或多個a 1，2甘露糖殘基。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中防止去除遠離五糖核心的一個或多個a 1，3甘露糖殘基。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中防止去除遠離五糖核心的一個或多個a 1，6甘露糖殘基。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中該方法包括使細(xì)胞接觸一種物質(zhì)，該物質(zhì)可防止去除遠離 GCB前體寡糖五糖核心的至少一個甘露糖殘基。
6. 權(quán)利要求5的方法，其中該物質(zhì)是一種甘露糖苷酶抑制劑。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中該甘露糖苷酶抑制劑是一種1類加工甘露糖苷酶抑制劑。
8. 權(quán)利要求6的方法，其中該甘露糖苷酶抑制劑是一種2類加工甘露糖苷酶抑制劑。
9. 權(quán)利要求7的方法，其中1類加工甘露糖苷酶抑制劑選自：kifunensine、 deoxymannojirimycin 和其組合。
10. 權(quán)利要求7的方法，其中1類加工甘露糖苷酶抑制劑是kifunensine。
【文檔編號】A61K38/47GK104312995SQ201410418047
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2001年8月17日 優(yōu)先權(quán)日:2000年8月18日
【發(fā)明者】C·A·吉諾施塔, M·普拉施森特, M·布洛斯基, P·弗朗西斯-丹尼爾 申請人:夏爾人類遺傳性治療公司