一種淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑及其應用，屬于醫(yī)藥【技術領域】。它是以淫羊藿總黃酮、水解酶、生物粘附制劑及其它藥劑學中常用的輔料制備成的可供口服的腸溶膠囊、腸溶丸劑或腸溶片劑等。按照本發(fā)明提供的技術方案開發(fā)的淫羊藿總黃酮仿生酶解口服給藥系統(tǒng)在體內腸道環(huán)境下（37℃，pH5.2~7.4），淫羊藿總黃酮可在腸道排空時間之前被完全酶解成更利于吸收的次級苷及苷元形式，并通過加入生物黏附劑延長該給藥系統(tǒng)在腸道吸收位點的滯留時間，從而實現(xiàn)藥物的“實時酶解，實時吸收”，進一步保證淫羊藿黃酮苷能充分酶解并提高生物利用度，為骨質疏松等癥提供更有效、更穩(wěn)定的治療手段。
【專利說明】
—種淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑及其應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑，該制劑是將淫羊藿總黃酮、水解酶、生物粘附劑及藥劑學中常用的輔料制備成腸溶膠囊、腸溶丸劑或腸溶片劑等，本發(fā)明還涉及該口服腸溶制劑的應用，屬于醫(yī)藥【技術領域】。

【背景技術】
[0002]淫羊藿作為傳統(tǒng)的補腎中藥，在民間沿用已有千年歷史，具有補腎陽，強筋骨、祛風濕的作用，臨床常用于治療陽痿遺精，筋骨萎軟，風濕痹痛等癥。
[0003]淫羊藿含有多種黃酮類成分，其中8-異戊烯基取代黃酮苷是其主要代表性活性黃酮，主要有淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B，朝藿定C和寶藿苷I等(結構見圖1)。現(xiàn)代藥理研究表明，淫羊藿異戊烯基取代黃酮苷具有很好的生物活性，除具有抗氧化、抗抑郁、抗腫瘤等作用外，還具有很好的抗骨質疏松活性。其作為一種有效的植物雌激素，可以選擇性地和植物雌激素受體結合，治療婦女更年期因雌激素缺乏引起骨丟失而導致的骨質疏松；另外還能夠增強成骨細胞的分化增殖、促進骨基質鈣化、抑制破骨細胞分化，從而抗骨質疏松，且次級苷和淫羊藿苷元的作用較強。
[0004]本課題組研究及已有文獻表明，淫羊藿黃酮苷腸道滲透性低，吸收較差，水解是淫羊藿黃酮苷生物轉化的起始步驟，去糖基化使得糖苷易于在腸道擴散和吸收。口服淫羊藿黃酮苷，主要以腸道代謝產物(次級苷或苷元)的形式被吸收而發(fā)揮療效。但人體腸道內存在的水解酶(腸道粘膜酶和腸道菌酶)會因病理、人種、年齡、飲食、藥物的影響而不同；且本課題組前期研究證實骨質疏松病理狀態(tài)下，存在腸道酶與腸道菌缺失的現(xiàn)象，因此難以保證口服淫羊藿黃酮苷后能在腸道穩(wěn)定快速地被水解吸收。因此，目前相關淫羊藿黃酮抗骨質疏松的制劑與專利如:如中國專利CN200610094777.4公開的一種仙茅總苷和淫羊藿總黃酮藥物組合物及制備方法和用途，是直接將淫羊藿總黃酮、仙茅總苷和藥學上的輔料組合制成固體或液體制劑，并不能很好地提高淫羊藿黃酮的生物利用度。雖然如中國專利CN03129242.9公開了一種含淫羊藿素、去甲基淫羊藿素的藥物組合物及其用途，但由于淫羊藿素、去甲基淫羊藿素溶解度很低，仍然存在腸道難于溶解吸收等問題，此外為了提高淫羊藿黃酮苷的生物利用度，提高藥效，人們嘗試了多種藥劑學方法，如制備自乳化軟膠囊，速釋滴丸、磷脂復合物、微孔滲透泵控釋片以及PVP載藥納米纖維膜等給藥系統(tǒng)，并通過體外溶出度測定和動物模型證實了這些方法雖能不同程度的提高淫羊藿總黃酮的生物利用度，但這些方法大多是通過增加淫羊藿黃酮原型藥物的分散度而促進藥物在體內的溶出過程，在制劑的過程中并沒有考慮藥物在體內的生物轉化和吸收的具體過程，更沒有考察在體內相關酶活力下降以及微生物菌群失調等特殊的生理病理狀態(tài)下藥物代謝及吸收情況的變化，因而在實際的臨床應用中往往不能達到預期的效果。
[0005]鑒于上述問題，本發(fā)明提出:向制劑中加入外源性水解酶，采用人工干預的方法幫助患者體內對淫羊藿總黃酮進行高效地酶解，在體內實現(xiàn)淫羊藿黃酮的實時酶解，實時吸收；其次，通過加入生物粘附劑，延長制劑在腸道位點的滯留時間，使得酶解產物次級苷和苷元在腸道排空時間之前完成高效地吸收。


【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑，能夠實現(xiàn)淫羊藿總黃酮在腸道內實時酶解、實時吸收，且延長藥物在腸道吸收位點的滯留時間，保證藥物充分酶解并吸收，以改善淫羊藿總黃酮口服生物利用度低等缺陷。
[0007]針對上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案:
一種淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑，由淫羊藿總黃酮、水解酶和藥學上可接受的輔料制備而成，所述藥學上可接受的輔料至少包括生物粘附劑。
[0008]本發(fā)明所述的淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑首先能夠避開胃液的降解，然后在體內腸道環(huán)境(37°C，pH 5.2?7.4)下轉化成次級苷及苷元，并伴隨著在腸道排空時間內快速有效地吸收。
[0009]本發(fā)明所述的淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑加入了可增加腸道滯留時間的生物黏附劑，能夠延長藥物在腸道吸收位點的滯留時間，保證藥物充分酶解并吸收。
[0010]所述的淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑，所述淫羊藿總黃酮、水解酶及生物黏附劑的用量比為淫羊藿總黃酮I mg:水解酶酶活疒800U:生物黏附劑0.f 0.6 mg，次優(yōu)選淫羊藿總黃酮I mg:水解酶酶活6飛OOU:生物黏附劑0.2、.5 mg，最優(yōu)選淫羊藿總黃酮Img:水解酶酶活1(T400U:生物黏附劑0.3^0.4 mg。
[0011]其中，酶的相對用量是在體外模擬體內腸道環(huán)境(37°C，pH 5.4)下測定得到的。
[0012]在該用例范圍內，所制備淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑在腸道環(huán)境(37°C，pH pH5.2?7.4)下，在腸道排空前，其中的淫羊藿總黃酮能夠完全被釋放、酶解并吸收。
[0013]本發(fā)明所述的水解酶為β -葡萄糖苷酶、纖維素酶、蝸牛酶、柚苷酶、橙皮苷酶、苦杏仁酶的一種或幾種。優(yōu)選蝸牛酶和葡萄糖苷酶。
[0014]本發(fā)明所述的生物黏附劑選自卡波姆、殼聚糖及其衍生物、海藻酸及其鈉鹽、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素、低取代羥丙基纖維素、白芨膠、阿拉伯膠中的一種或幾種，優(yōu)選卡波姆和羥丙基甲基纖維素。
[0015]本發(fā)明所述的淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑，所述淫羊藿總黃酮的制備方法優(yōu)選但并不局限于為:用6?40倍量40%?90%乙醇采用熱回流提取后濃縮，所得的提取物經大孔吸附樹脂法進一步純化，得到含量不低于60%的淫羊藿總黃酮純品(紫外分光光度法測得，以淫羊藿苷為對照)，總黃酮中淫羊藿苷、朝藿定Α、朝藿定B、朝藿定C和寶藿苷I的總含量不低于30% (HPLC測得)。
[0016]上述淫羊藿總黃酮的制備方法優(yōu)選如下:稱取淫羊藿藥材，加15?19倍量50%乙醇，回流提取兩次，每次2 h，合并兩次濾液，回收乙醇，濃縮，上大孔吸附樹脂柱，分別用水、30%、60%乙醇洗脫，收集60%乙醇洗脫液，濃縮，干燥得棕褐色淫羊藿總黃酮粉末。
[0017]本發(fā)明所述的淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑，除生物粘附劑以外的其他所述的輔料的加入質量是淫羊藿總黃酮的O?0.7倍，優(yōu)選0.3?0.5倍。
[0018]本發(fā)明所述的淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑可進一步為腸溶丸劑、腸溶片劑或腸溶膠囊劑。
[0019]其中，所述腸溶丸劑的制備方法為:按比例分別稱取淫羊藿總黃酮、水解酶、生物粘附制劑及其它藥學上可接受的輔料，混合均勻，用適量潤濕劑泛丸，包衣，干燥即得腸溶丸劑；
所述腸溶片劑的制備方法為:按比例分別稱取淫羊藿總黃酮、水解酶、生物粘附制劑及其它藥學上可接受的輔料，混合均勻，直接壓片包衣或加入適量潤濕劑，濕法制粒后壓片包衣制成腸溶片劑；
所述腸溶膠囊劑的制備方法為:按比例分別稱取淫羊藿總黃酮、水解酶、生物粘附制劑及其它藥學上可接受的輔料，混合均勻，加入適量潤濕劑，濕法制粒后干燥，整粒，制成腸溶月父囊。
[0020]其中，所述腸溶制劑的優(yōu)選制備方法(此部分以酶為蝸牛酶，填充劑為α-乳糖，生物黏附劑為卡波姆為例敘述):分別取42%淫羊藿總黃酮粉末、28%蝸牛酶、15% α-乳糖、15%卡波姆、適量95%乙醇作為潤濕劑，混合均勻，制成軟材(握之成團、觸之即散)，過篩制粒，低溫干燥，整粒，裝入2號腸溶膠囊，每粒約0.22 g。
[0021]本發(fā)明所述的輔料選用醫(yī)藥上允許的腸溶制劑輔料選自填充劑、潤濕劑與黏合劑、崩解劑、腸溶包衣劑、潤滑劑中的一種或幾種；
其中，所述的填充劑，選自糊精、鹿糖、α-乳糖、微晶纖維素、淀粉、甘露醇、木糖醇中的一種或幾種；所述的潤濕劑與黏合劑，選自水、乙醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素、淀粉漿、明膠、蔗糖中的一種或幾種；所述的崩解劑，選自羧甲淀粉鈉、微晶纖維素、干淀粉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、交聯(lián)聚維酮中的一種或幾種；所述的腸溶包衣齊U，選自醋酸纖維素酞酸酯、聚乙烯醇酞酸酯、醋酸纖維素苯三酸酯、羥丙基纖維素酞酸酯或丙烯酸樹脂中的一種或幾種；所述的潤滑劑，選自硬脂酸鎂、硬脂酸、滑石粉、微粉硅膠、氫化植物油、聚乙二醇類中的一種或幾種。
[0022]本發(fā)明所述的濕潤劑優(yōu)選為95%乙醇。
[0023]此外，本發(fā)明進一步要求保護上述淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑在制備治療骨質疏松藥物中的應用。
[0024]本發(fā)明所述口服腸溶制劑與普通淫羊藿總黃酮相比，生物利用度可以提高0.5?2.5 倍。
[0025]本發(fā)明在淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑中加入外源水解酶，能夠模擬體內腸道酶與腸道菌的作用，在腸道內增強淫羊藿總黃酮的水解，保證淫羊藿黃酮在腸道排空前實時酶解、實時吸收，提高生物利用度，從而保持穩(wěn)定和較好的抗骨質疏松等藥效。
[0026]本發(fā)明在淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑中加入生物黏附劑，可以延長藥物在腸道吸收位點的滯留時間，保證淫羊藿黃酮充分吸收，提高生物利用度，保持良好的抗骨質疏松作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為淫羊藿所含主要黃酮及酶解產物的化學結構示意圖；
圖2為淫羊藿苷、朝藿定Α、朝藿定B、朝藿定C的轉化率隨時間的變化示意圖；
圖3為淫羊藿苷、朝藿定Α、朝藿定B、朝藿定C酶解產物的生成率隨時間的變化示意圖； 圖4為淫羊藿總黃酮中四種主要黃酮苷的轉化率隨時間的變化示意圖；
圖5為淫羊藿總黃酮中四種黃酮苷的主要酶解產物生成率隨時間的變化示意圖；
圖6為淫羊藿總黃酮粉末的HPLC圖譜；
圖7為不同生物粘附劑對淫羊藿總黃酮釋放度的影響示意圖；
圖8為不同生物粘附劑對大鼠腸道粘附力的比較示意圖；
圖9為淫羊藿總黃酮的累計釋放曲線圖；
圖10為生物粘附腸溶膠囊中四種主要黃酮苷的轉化率隨時間的變化示意圖；
圖11為生物粘附腸溶膠囊中四種主要酶解產物的生成率隨時間的變化示意圖。

【具體實施方式】
[0028]下面結合實例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明的范圍并不受這些實例的任何限制。
[0029]本發(fā)明實施例中所選用的水解酶信息:β -葡萄糖苷酶(>2 U/mg, sigma公司),纖維素酶(>400 U/mg，南京奧多福尼生物科技有限公司)，蝸牛酶(>300 U/mg，上海源葉生物科技有限公司)，柚苷酶(>10 U/mg，濟寧和美生物工程有限公司)，橙皮苷酶(>100 U/mg，河北百味生物科技有限公司)，苦杏仁酶(>6 U/mg，上海瀘峰化工有限公司)。
[0030]除特殊說明外，本發(fā)明所用的各種原料/制劑均為市售的已知產品。
[0031]實施例1
稱取淫羊藿總黃酮粉末42.0 g、β-葡萄糖苷酶8.4X 14 U (42.0 g)、羥丙基甲基纖維素10.0 g、殼聚糖6.8 g，混合均勻，加入適量95%乙醇作為潤濕劑，制成軟材(握之成團、觸之即散)，過篩制粒，干燥，整粒，加入適量硬脂酸鎂混合均勻，壓片，包衣，制成淫羊藿總黃酮口服腸溶片劑。所制得的腸溶片劑的生物利用度比淫羊藿總黃酮粉末提高了 0.52倍。
[0032]實施例2
稱取淫羊藿總黃酮粉末42.0 g、柚苷酶4.2X 15 U (42.0 g)、低取代羥丙基纖維素
15.0 g、卡波姆6.0 g,微晶纖維素12.6 g,混合均勻,加入適量95%乙醇作為潤濕劑泛丸，包衣，干燥，制成淫羊藿總黃酮口服腸溶丸劑。所制得的腸溶丸劑的生物利用度比淫羊藿總黃酮粉末提高了 0.88倍。
[0033]實施例3
稱取淫羊藿總黃酮粉末42.0 g、纖維素酶3.36X 107 U (84.0 g)、羥丙基甲基纖維素
16.0 g、卡波姆4.6 g，白友膠4.6 8,0-乳糖16.8 g,混合均勻,加入適量95%乙醇作為潤濕劑，過篩制粒，干燥，整粒，裝入腸溶膠囊。所制得的腸溶膠囊的生物利用度比淫羊藿總黃酮粉末提高了 1.13倍。
[0034]實施例4
稱取淫羊藿總黃酮粉末42.0 g、蝸牛酶2.52 X 17 U (84.0 g)、卡波姆4.2 g，α-乳糖8.4 g，混合均勻，加入適量95%乙醇作為潤濕劑，過篩制粒，干燥，整粒，裝入腸溶膠囊。所制得的腸溶膠囊的生物利用度比淫羊藿總黃酮粉末提高了 1.93倍。所制得的腸溶膠囊的生物利用度比淫羊藿總黃酮粉末提高了 1.84倍。
[0035]實施例5
稱取淫羊藿總黃酮粉末42.0 g、纖維素酶1.26X 107 U (31.5 g)、橙皮苷酶4.2X 16U (42.0 g)、殼聚糖14.7 g，α -乳糖21.0 g，混合均勻，加入適量95%乙醇作為潤濕劑，過篩制粒，干燥，整粒，裝入腸溶膠囊。所制得的腸溶膠囊的生物利用度比淫羊藿總黃酮粉末提高了 1.37倍。
[0036]實施例6
稱取淫羊藿總黃酮粉末42.0 g、蝸牛酶1.26X 107 U (42.0 g)、白芨膠8.4 g，α-乳糖12.6 g，混合均勻，加入適量95%乙醇作為潤濕劑，過篩制粒，干燥，整粒，裝入腸溶膠囊。所制得的腸溶膠囊的生物利用度比淫羊藿總黃酮粉末提高了 2.05倍。
[0037]實施例7
稱取淫羊藿總黃酮粉末42.0 g、纖維素酶8.4X 16 U (21.0 g)、海藻酸鈉12.6 g，α -乳糖25.2 g，混合均勻，加入適量95%乙醇作為潤濕劑，過篩制粒，干燥，整粒，裝入腸溶膠囊。所制得的腸溶膠囊的生物利用度比淫羊藿總黃酮粉末提高了 0.82倍。
[0038]實施例8
稱取淫羊藿總黃酮粉末42.0 g、橙皮苷酶3.36X 16 U (33.6 g)、阿拉伯膠14.7g，α -乳糖29.4 g，混合均勻，加入適量95%乙醇作為潤濕劑，過篩制粒，干燥，整粒，裝入腸溶膠囊。所制得的腸溶膠囊的生物利用度比淫羊藿總黃酮粉末提高了 1.42倍。
[0039]實施例9
稱取淫羊藿總黃酮粉末42.0 g、橙皮苷酶2.1XlO6U (21.0 g)、羧甲基纖維素鈉4.2g，α -乳糖16.8 g,混合均勻,加入適量95%乙醇作為潤濕劑,過篩制粒,干燥,整粒,裝入腸溶膠囊。所制得的腸溶膠囊的生物利用度比淫羊藿總黃酮粉末提高了 1.07倍。
[0040]實施例10
稱取淫羊藿總黃酮粉末42.0 g、苦杏仁酶2.52X 15 U (42.0 g)、聚乙二醇4.2 g，α-乳糖15.1 g，混合均勻，加入適量95%乙醇作為潤濕劑，過篩制粒，干燥，整粒，裝入腸溶膠囊。所制得的腸溶膠囊的生物利用度比淫羊藿總黃酮粉末提高了 0.73倍。
[0041]實施例11
稱取淫羊藿總黃酮粉末42.0 g、β-葡萄糖苷酶4.2X 14 U (21.0 g)、苦杏仁酶1.26 X 15 U (21.0 g)、柚皮苷酶4.2 X 15 U (42.0 g)、低取代羥丙基纖維素21.0g,混合均勻，加入適量95%乙醇作為潤濕劑，過篩制粒，干燥，整粒，裝入腸溶膠囊。所制得的腸溶膠囊的生物利用度比淫羊藿總黃酮粉末提高了 1.59倍。
[0042]實施例12
稱取淫羊藿總黃酮粉末42.0 g、纖維素酶8.4X 16 U (21.0 g)、蝸牛酶1.26 X 17 U(42.0 g)、羥丙基甲基纖維素6.3 g，α -乳糖15.0 g，混合均勻，加入適量95%乙醇作為潤濕劑，過篩制粒，干燥，整粒，裝入腸溶膠囊。所制得的腸溶膠囊的生物利用度比淫羊藿總黃酮粉末提高了 1.16倍。
[0043]實施例13
稱取淫羊藿總黃酮粉末42.0 g、蝸牛酶8.4X106U(28.0 g)、羥丙基甲基纖維素16.0
g、卡波姆8.0 g, α-乳糖15.0 g,混合均勻,加入適量95%乙醇作為潤濕劑泛丸,包衣,干燥，制成淫羊藿總黃酮口服腸溶丸劑。所制得的腸溶丸劑的生物利用度比淫羊藿總黃酮粉末提高了 2.31倍。
[0044]實施例14 稱取淫羊藿總黃酮粉末42.0 g、蝸牛酶8.4X106U (28.0 g)、卡波姆15.0 g，α-乳糖15.0 g，混合均勻，加入適量95%乙醇作為潤濕劑，過篩制粒，干燥，整粒，裝入腸溶膠囊。所制得的腸溶膠囊的生物利用度比淫羊藿總黃酮粉末提高了 2.52倍。
[0045]以下提供若干試驗例以進一步說明本發(fā)明技術方案。
[0046]試驗例I體外模擬腸道環(huán)境(37°C，人工腸液)下不同水解酶酶解淫羊藿黃酮苷及酶解產物鑒定
以淫羊藿苷為例，取4份淫羊藿苷，每份10 mg，精密稱定，分別置于密閉容器中，分別加入人工腸液10 mL，每組分別加入適量的葡萄糖苷酶、纖維素酶、蝸牛酶、柚苷酶(各酶酶活均在規(guī)定范圍內)，在37°C，轉速為(100 土 5) r ^mirT1的氣浴恒溫振蕩器中反應，按照不同水解酶特點反應I飛h，取樣100 μ L，立即加入900 UL甲醇終止反應，渦旋，13
000r.mirT1離心10 min后取上清液,過0.22 μ m微孔濾膜,進HPLC測定,計算淫羊藿苷轉化率，并用UPLC/Q-T0F-MS聯(lián)用技術鑒定酶解產物。
[0047]同樣地，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C均可以按照上述方法進行酶解反應。
[0048]經UPLC/Q-T0F-MS鑒定結果表明，蝸牛酶、β -葡萄糖苷酶、纖維素酶、柚苷酶這四種酶酶解朝藿定A主要生成一個產物箭藿苷Α，酶解朝藿定B主要生成一個產物箭藿苷B，酶解朝藿定C主要生成一個產物鼠李糖基淫羊藿次苷II (各產物結構見圖1)。對于淫羊藿苷，β -葡萄糖苷酶、纖維素酶、柚苷酶酶解后均主要生成一個產物寶藿苷I，蝸牛酶酶解后生成兩個產物寶藿苷I及淫羊藿苷元。不同水解酶對淫羊藿苷、朝藿定Α、朝藿定B、朝藿定C的轉化率見表I。如結果(表I)所示，在體外模擬體內腸道環(huán)境(37°C，人工腸液)下，蝸牛酶、β -葡萄糖苷酶、纖維素酶、柚苷酶均可以酶解淫羊藿總黃酮中主要的黃酮苷單體，主要生成次級苷，表明它們均可用來作為淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑中的水解酶。
[0049]表I不同水解酶對淫羊藿苷、朝藿定Α、朝藿定B、朝藿定C的轉化率
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試驗例2大鼠腸道酶酶解淫羊藿黃酮苷單體及酶解產物鑒定取雌性SD大鼠，禁食過夜。用烏拉坦(劑量3 mL.Kg—1)肌肉注射麻醉。待大鼠麻醉好后，將大鼠全腸段取出，分別取十二指腸段、空腸段、回腸段和結腸段并用冰的生理鹽水沖洗干凈，然后用玻片邊緣刮取腸黏膜，稱重，按I g: 4 mL的比例加入冰的生理鹽水混合后組織勻漿機勻漿，勻漿液在3000 r.miiTWC離心10 min后取上清液，得到大鼠不同腸段腸黏膜孵育液。
[0050]取上述健康及骨質疏松病理狀態(tài)下大鼠腸黏膜孵育液各4 mL，分別各加入2mmol.L—1淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C供試品溶液I mL，立即放入37°C恒溫氣浴振蕩器中孵育，分別于2 h取樣0.5 mL，立即加入1.5 mL乙腈，充分渦旋混合30 s, 13000r ^mirT1,離心15 min，取上清液10 μ L，進HPLC，測定轉化率，并用UPLC/Q-TOF-MS聯(lián)用技術鑒定酶解產物。
[0051]經UPLC/Q-T0F-MS鑒定結果表明，腸道酶酶解淫羊藿苷主要生成兩個酶解產物寶藿苷I及淫羊藿苷元，酶解朝藿定A主要生成一個產物箭藿苷Α，酶解朝藿定B主要生成一個產物箭藿苷B，酶解朝藿定C主要生成一個產物鼠李糖基淫羊藿次苷II。此試驗例說明本發(fā)明所選用的水解酶酶解淫羊藿黃酮苷的主要產物與大鼠腸道酶的代謝產物基本一致，可以選用上述六種酶作為淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑中的水解酶。此外，四種淫羊藿黃酮苷在骨質疏松病理組大鼠腸道酶中的代謝速率顯著變慢，說明大鼠骨質疏松病理組腸道酶缺失或酶活降低，因此更需要在制劑中加入外源水解酶幫助腸道對淫羊藿總黃酮進行高效地酶解。
[0052]試驗例3大鼠腸道菌酶解淫羊藿黃酮苷單體并鑒定酶解產物
取新鮮的健康及骨質疏松病理組大鼠糞便按I g: 4 mL的比例與冰的生理鹽水混合制成懸濁液，I 000 r離心10 min后取上清液，得到大鼠腸菌液。取0.3 mL的大鼠腸菌液加到2.7 mL的厭氧培養(yǎng)液中，混勻后即得腸菌孵育液。
[0053]取上述健康及骨質疏松病理狀態(tài)下大鼠腸菌孵育液各4 mL，分別各加入淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C供試品溶液I mL，立即放入37°C恒溫氣浴振蕩器中孵育，于2 h取樣0.5 mL,立即加入1.5 mL乙腈,充分潤旋混合30 s, 13 000 r.mirT1,離心15min,取上清液10 μ L，進HPLC，測定轉化率，并用UPLC/Q-T0F-MS聯(lián)用技術鑒定酶解產物。
[0054]經UPLC/Q-T0F-MS鑒定結果表明，腸道菌水解淫羊藿苷、朝藿定Α、朝藿定B、朝藿定C各生成一個酶解產物，酶解淫羊藿苷主要生成寶藿苷I，酶解朝藿定A主要生成箭藿苷Α，酶解朝藿定B主要生成箭藿苷B，酶解朝藿定C主要生成鼠李糖基淫羊藿次苷11。此試驗例說明本發(fā)明所選用的水解酶酶解淫羊藿黃酮苷的主要產物與大鼠腸道菌的代謝產物基本一致，進一步說明可以選用上述六種酶作為淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑中的水解酶。此夕卜，四種淫羊藿黃酮苷在骨質疏松病理組大鼠腸道菌中的代謝速率變慢，說明大鼠骨質疏松病理組的腸道菌群可能發(fā)生了變化，導致腸道菌群的活力有所下降，從而影響了對藥物的代謝作用。因此更需要在制劑中加入外源水解酶幫助腸道對淫羊藿總黃酮進行高效地酶解。
[0055]試驗例4大鼠腸灌流模型研究淫羊藿黃酮苷單體的吸收代謝及代謝產物鑒定取雌性大鼠10只，體量240?270 g，分為兩組，每組5只，一組作為空白組，另一組摘除卵巢造去卵巢骨質疏松動物模型，3個月后做腸灌流實驗。肌肉注射50%烏拉坦溶液(0.7mL/300g)對大鼠麻醉，腹腔開口后，對十二指腸、空腸、回腸、結腸進行插管，之后將小腸部分小心放回腹腔，盡可能避免卷曲和扭結。將進口管隔離，在37°C循環(huán)水浴中保持灌注溫度恒定。分別用灌注泵將10 μ M的淫羊藿苷、朝藿定Α、朝藿定B、朝藿定C小腸灌流液同時灌入四段腸段(十二指腸，空腸，回腸末端，結腸)，泵的流速為0.2mL min'平衡30分鐘，然后每隔30min收集4份出口管中樣品。取腸灌流收集樣品400 μ L，加400 yL乙腈，離心，取上清液，供HPLC檢測，并用UPLC/Q-T0F-MS聯(lián)用技術鑒定代謝產物。
[0056]經UPLC/Q-T0F-MS鑒定結果表明，淫羊藿苷大鼠腸灌流后主要代謝產物為寶藿苷I，朝藿定A大鼠腸灌流后主要代謝產物為箭藿苷A，朝藿定B大鼠腸灌流后主要代謝產物為箭藿苷B，朝藿定C大鼠腸灌流后主要代謝產物為鼠李糖基淫羊藿次苷II。此試驗例說明本發(fā)明所選用的水解酶酶解淫羊藿黃酮苷的主要產物與大鼠腸灌流的代謝產物基本一致，進一步說明可以選用上述六種酶作為淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑中的水解酶。此外，各淫羊藿黃酮在骨質疏松大鼠的腸道吸收明顯減少，可能是由于大鼠摘除雙側卵巢后，各腸段腸道酶活力降低，導致各腸段代謝產物的量減少，因此更需要在制劑中加入外源水解酶幫助腸道對淫羊藿總黃酮進行高效地酶解。
[0057]試驗例5蝸牛酶在37°C人工腸液中酶解淫羊藿黃酮苷單體
分別取淫羊藿苷50 mg、朝藿定A 10 mg、朝藿定B 10 mg、朝藿定C 10 mg,精密稱定，分別置于密閉容器中，分別加入人工腸液10 mL，分別加入50、10、10、10 mg的蝸牛酶，在37°C，轉速為(100 土 5) r.mirT1的氣浴恒溫振蕩器中反應，分別在0、0.25、0.5、
0.75、1、1.5、2、3、4、6、8 h時取樣100 μ L，立即加入900 μ L甲醇終止反應，渦旋，13 000!■?mirT1離心10 min后取上清液，過0.22 μπι微孔濾膜，進HPLC測定并計算轉化率。結果見圖2、3，淫羊藿苷在6 h時基本酶解完全，朝藿定A和朝藿定C在2 h時基本酶解完全，朝藿定B在3 h時基本酶解完全。酶解產物箭藿苷A、箭藿苷B及鼠李糖基淫羊藿次苷II生成率的達峰時間與對應的反應物酶解完全所需時間基本一致，淫羊藿苷主要酶解產物寶藿苷I的生成率在4 h達到最大值。
[0058]綜上所述，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C都能在6 h內酶解成相應的次級苷和苷元。
[0059]試驗例6蝸牛酶在37°C人工腸液中酶解淫羊藿總黃酮
取淫羊藿總黃酮粉末143 mg(相當于100 mg淫羊藿總黃酮)，精密稱定，置于密閉容器中，加入100 mg蝸牛酶，及10 mL人工腸液，在37°C，轉速為(100 土 5) r ^mirT1的氣浴恒溫振蕩器中反應，分別在0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、8 h時取樣200 μ L，加入適量甲醇稀釋20倍，渦旋，13 000 rmirr1離心10 min后取上清液，過0.22 μπι微孔濾膜，進樣測定并計算主要淫羊藿黃酮單體的轉化率或生成率。結果見圖4、5，淫羊藿苷、朝藿定Α、朝藿定B和朝藿定C在2 h時基本酶解完全。酶解產物箭藿苷A、箭藿苷B及鼠李糖基淫羊藿次苷II生成率在2 h達到最大值。淫羊藿苷酶解產物寶藿苷I的生成率在2 h達到最大值。
[0060]綜上所述，淫羊藿總黃酮中主要黃酮苷在2 h內能夠酶解成相應的次級苷或苷元。
[0061]試驗例7淫羊藿總黃酮的提取及分離純化
稱取淫羊藿300 g，加15倍量50%乙醇，回流提取兩次，每次2 h，合并兩次濾液，回收乙醇，濃縮，上AB-8大孔吸附樹脂柱，用6倍柱體積水洗滌至無色，再用5倍柱體積30%乙醇洗去雜質,再用5倍柱體積60%的乙醇溶液進行洗脫，收集60%乙醇洗脫液，濃縮,冷凍干燥得棕褐色淫羊藿總黃酮粉末。
[0062]結果淫羊藿總黃酮粉末經紫外-可見分光光度計測定計算得總黃酮純度為70.0%(以淫羊藿苷計);經HPLC測定計算得淫羊藿苷含量為20.4%，總黃酮中淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和寶藿苷I的總含量為31.8%。淫羊藿總黃酮粉末的HPLC圖譜見圖6。
[0063]試驗例8含不同生物黏附劑的淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑的釋放度考察
淫羊藿總黃酮生物粘附腸溶膠囊處方淫羊藿總黃酮粉末42.0 g、蝸牛酶8.4X106U(28.0 g)、α -乳糖15.0 g、不同生物粘附劑15.0 g、適量潤濕劑。
[0064]按處方稱取淫羊藿總黃酮粉末、蝸牛酶及α -乳糖，共5份，再分別加入不同生物黏附劑卡波姆(CP)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、低取代羥丙基纖維素(L-HPC)、殼聚糖(CS)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，加入適量95%乙醇作為潤濕劑，混合均勻，制成軟材(握之成團、觸之即散)，過篩制粒，干燥，整粒，裝入腸溶膠囊，每粒裝入約0.22 g。照2010版藥典中釋放度測定法(附錄XD第二法(一)法)，考察各膠囊的釋放度。結果如圖7所示，本發(fā)明所選的不同生物黏附劑所制備的淫羊藿總黃酮口服腸溶膠囊均具有不同程度的緩釋作用，且生物黏附劑能夠延長淫羊藿總黃酮在腸道內的滯留時間，使淫羊藿黃酮達到實時酶解，實時吸收的效果。
[0065]試驗例9含不同生物黏附劑的淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑的生物黏附性考察淫羊藿總黃酮生物粘附腸溶膠囊處方淫羊藿總黃酮粉末42.0 g、蝸牛酶8.4X106U
(28.0 g)、α-乳糖15.0 g、不同生物粘附劑(卡波姆、羥丙基甲基纖維素、低取代羥丙基纖維素、殼聚糖或羧甲基纖維素鈉)15.0 g、適量潤濕劑。
[0066]體外生物粘附力測定取禁食16 h的雌性SD大鼠，麻醉后取出小腸，用pH 6.8的磷酸鹽緩沖液沖洗除去內容物，注意保持粘膜粘液層的完整。取實驗藥物，研成細粉，用磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)制成10%的溶液,涂布于I cmXl cm背面帶掛鉤的硬塑料薄板上Oa),厚度0.1 cm, 50°C烤干,為供試藥物,備用。將腸組織剪切成小塊，固定于IcmX Icm背面帶掛鉤的硬塑料薄板上(b)，取(a)，用磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)潤濕10 min后與(b)接觸，并給予100 g壓力(100 g砝碼)，維持10 S，將(a)掛鉤垂直固定，在(b)掛鉤上系一塑料袋，通過輸液瓶以5 mL ?mirT1速度向塑料袋中加水,直至因拉力過大而分離,稱取塑料袋中水的重量，即為組織粘附力大小。
[0067]不同種類生物黏附劑對大鼠腸道粘附力的大小見圖8，表明本發(fā)明所選的不同生物黏附劑均具有不同程度的生物黏附性，其中卡波姆的生物粘附力最大，為27.4 g.cm_2。此實施例結果顯示本發(fā)明通過加入生物黏附劑所制備的制劑能夠延長淫羊藿黃酮在腸道位點的滯留時間，有利于淫羊藿黃酮在腸道排空時間之前完成高效地吸收。
[0068]試驗例10淫羊藿總黃酮口服腸溶膠囊的釋放及酶解的考察
淫羊藿總黃酮生物粘附腸溶膠囊處方(實施例14)淫羊藿總黃酮粉末42.0 g、蝸牛酶8.4X 16 U (28.0 g)、α-乳糖15.0 g、卡波姆15.0 g、適量潤濕劑。
[0069]釋放度考察照釋放度測定法(附錄XD第二法(一)法)，以0.1 mol -Γ1鹽酸溶液750 mL為釋放介質,轉速為(100±5) r ^irT1,依法操作，經2小時后,取溶液10 mL濾過，立即補充相同溶液，精密量取續(xù)濾液5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液作為供試品(I)。然后向溶出杯中加入(37±0.5) °〇的0.2 mol.Γ1磷酸鈉溶液250 mL (必要時調節(jié)pH值至6.8±0.05)，繼續(xù)運轉，分別在0.5、1、2、3、4、6、8、10、12 h時取樣10 mL，立即補充相同溶液，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液作為供試品(2)。另取本品I粒，重復上述釋放度實驗，待腸溶膠囊溶蝕完全后，精密量取續(xù)濾液5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液作為空白對照溶液。測定270 nm處的紫外吸光度，計算累計釋放度。取空白對照溶液、供試品(I)、供試品(2)各8 mL，吹干，加入I mL甲醇溶解定容，離心，過濾，進HPLC。淫羊藿總黃酮的累計釋放度曲線見圖9 ;淫羊藿總黃酮中主要黃酮苷的轉化率及主要酶解產物的生成率隨時間變化規(guī)律見圖10、11。
[0070]本實施例所選用的處方為制劑優(yōu)選處方，由圖9可知，所制備出的腸溶膠囊中淫羊藿總黃酮的釋放緩慢，在0.1 mol.L—1鹽酸溶液中2 h內無裂縫或崩解；2 h時，累積釋放度約30.93% ;6 h時，累積釋放度約67.51% ;12 h時，累積釋放度大于90%。由圖10、11可知，主要淫羊藿黃酮苷在12 h時基本酶解完全，主要酶解產物的量在12 h時基本達到最高值。主要淫羊藿黃酮苷朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的釋放量在2 h時達到最大值，在(Γ2 h間呈上升趨勢，表明它們的釋放速度大于酶解速度；在2?14 h間呈下降趨勢，表明它們的釋放速度小于酶解速度。本實施例表明淫羊藿總黃酮在釋放介質中能夠實現(xiàn)緩慢釋放并酶解，且生物黏附劑卡波姆能夠延長淫羊藿黃酮在腸道內的滯留時間，有利于淫羊藿黃酮的實現(xiàn)實時酶解，實時吸收。
[0071]試驗例11淫羊藿總黃酮口服腸溶膠囊的生物利用度研究
取骨質疏松雌性SD大鼠12只，隨機分成兩組，每組6只，給藥前禁食不禁水12 h，大鼠灌胃前取空白血漿0.5 mL于肝素化試管。I h后，各組分別灌胃給藥淫羊藿總黃酮、淫羊藿總黃酮腸溶膠囊(實施例14制備)，分別于給藥后0.083，0.25，0.5，0.75，1，2，3，4，6，8，10，12，24，48 h眼眶取血0.5 mL于肝素化試管中，5 000 r.mirT1離心5 min取上清液，置于_20°C條件下保存待測。取200 μ L血漿樣品置于具塞離心管中，800 yL乙酸乙酯沉淀蛋白，潤旋混勻30 s,混勻后,8 000 r.mirT1離心10 min。將上清液轉移至另一尖底試管中，氮氣吹干。殘渣定量加入甲醇100 yL溶解，渦旋混勻30 s，混勻后，8
000r.min—1離心10 min，取上清液，作為樣品液，進HPLC測定。
[0072]本實驗采用非房室模型計算淫羊藿黃酮藥代動力學參數(shù)，比較研究淫羊藿總黃酮口服腸溶膠囊及普通淫羊藿總黃酮粉末的藥代動力學差異。結果，淫羊藿總黃酮口服腸溶膠囊的 AUC 為 54.76 mg.L—1 -^17Cmax 為 5.10 mg.IAtmax 為 0.5 h，平均駐留時間為 16.38
h。淫羊藿總黃酮口服腸溶膠囊的生物利用度比普通淫羊藿總黃酮粉末提高了 2.52倍。
【權利要求】
1.一種淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑，其特征在于，由淫羊藿總黃酮、水解酶和藥學上可接受的輔料制備而成，所述藥學上可接受的輔料包括生物粘附劑。
2.根據(jù)權利要求1所述的淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑，其特征在于，所述淫羊藿總黃酮、水解酶及生物黏附劑的用量比為:淫羊藿總黃酮I mg:水解酶酶活疒800U:生物黏附劑0.f 0.6 mg，優(yōu)選淫羊藿總黃酮I mg:水解酶酶活6飛OOU:生物黏附劑0.2?0.5mg，更優(yōu)選淫羊藿總黃酮I mg:水解酶酶活1(T400U:生物黏附劑0.3?0.4 mg。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑，其特征在于，所述的水解酶為葡萄糖苷酶、纖維素酶、蝸牛酶、柚苷酶、橙皮苷酶、苦杏仁酶的一種或幾種，優(yōu)選β-葡萄糖苷酶和蝸牛酶。
4.根據(jù)權利要求1-3任一項所述的淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑，其特征在于，所述的生物黏附劑為卡波姆、殼聚糖及其衍生物、海藻酸及其鈉鹽、白芨膠、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素、低取代羥丙基纖維素、阿拉伯膠中的一種或幾種，優(yōu)選卡波姆和羥丙基甲基纖維素。
5.根據(jù)權利要求1-4任一項所述的淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑，其特征在于所述淫羊藿總黃酮的制備方法為:淫羊藿用6?40 (m/v)倍量409Γ90%乙醇采用熱回流提取后濃縮，經大孔吸附樹脂法進一步純化，得到含量不低于60%的淫羊藿總黃酮，其中，總黃酮中淫羊藿苷、朝藿定Α、朝藿定B、朝藿定C和寶藿苷I的總含量不低于30%。
6.根據(jù)權利要求1-5任一項所述的淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑，其特征在于，除生物粘附劑以外的其他所述的輔料的加入質量是淫羊藿總黃酮的(Γ0.7倍，優(yōu)選0.3^0.5倍。
7.根據(jù)權利要求1-6任一項所述的淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑，其特征在于，所述的淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑為腸溶丸劑、腸溶片劑或腸溶膠囊劑。
8.根據(jù)權利要求7所述的淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑，其特征在于所述腸溶丸劑的制備方法為:按比例分別稱取淫羊藿總黃酮、水解酶、生物粘附制劑及其它藥學上可接受的輔料，混合均勻，用潤濕劑泛丸，包衣，干燥即得腸溶丸劑； 所述腸溶片劑的制備方法為:按比例分別稱取淫羊藿總黃酮、水解酶、生物粘附制劑及其它藥學上可接受的輔料，混合均勻，直接壓片包衣或加入潤濕劑，濕法制粒后壓片包衣制成腸溶片劑； 所述腸溶膠囊的制備方法為:按比例分別稱取淫羊藿總黃酮、水解酶、生物粘附制劑及其它藥學上可接受的輔料，混合均勻，加入潤濕劑，濕法制粒后干燥，整粒，制成腸溶膠囊。
9.根據(jù)權利要求7所述的淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑，其特征在于所述腸溶膠囊的制備方法如下:按重量百分比計，分別取42%淫羊藿總黃酮粉末、28%蝸牛酶、15%卡波姆、15%α -乳糖，以95%乙醇作為潤濕劑，混合均勻，制成軟材，過篩制粒，低溫干燥，整粒，裝膠囊即得。
10.權利要求1-9任一項所述淫羊藿總黃酮口服腸溶制劑在制備治療骨質疏松藥物中的應用。
【文檔編號】A61K9/00GK104127466SQ201410419546
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年8月22日 優(yōu)先權日:2013年8月23日
【發(fā)明者】陳彥, 高霞, 王瑩 申請人:江蘇省中醫(yī)藥研究院