一種具有肝癌靶向功能的低代數(shù)樹狀大分子包裹的金納米顆粒作為ct納米造影劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具有肝癌靶向功能的低代數(shù)樹狀大分子包裹的金納米顆粒作為CT納米造影劑的制備方法，包括：將LA-PEG-COOH溶解在溶劑中，然后加入EDC活化4-6h后滴加入G2-FITC溶液中，攪拌反應(yīng)，透析，冷凍干燥，得到G2-FITC-PEG-LA；將G2-FITC-PEG-LA溶解在蒸餾水中，加入氯金酸水溶液，攪拌10-20min，然后加入NaBH4水溶液，攪拌反應(yīng)2-3h，透析，冷凍干燥，即得。本發(fā)明使用原料價格相對低廉；制備的以低代數(shù)樹狀大分子為模板的金納米顆粒具備優(yōu)異的穩(wěn)定性和生物相容性，表現(xiàn)出延長的體內(nèi)血液循環(huán)時間，并且對肝癌細胞具有特異性的靶向作用，有望用于腫瘤的早期檢測。
【專利說明】一種具有肝癌靶向功能的低代數(shù)樹狀大分子包裹的金納米顆粒作為CT納米造影劑的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米造影劑的制備領(lǐng)域，特別涉及一種具有肝癌靶向功能的低代數(shù)樹狀大分子包裹的金納米顆粒作為CT納米造影劑的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]計算機X射線斷層掃描(Computed Tomography, CT)利用人體不同的組織對X射線的透過率的不同,可對人體內(nèi)部骨骼和組織進行成像,兼有空間分辨率高、可整體成像、圖像采集時間短、相對經(jīng)濟等優(yōu)點。為增加靶組織與正常組織的區(qū)分度，需要造影劑凸顯病灶。目前臨床廣泛使用的CT造影劑主要為含碘的小分子化合物(如泛影酸、碘海醇等)。由于腎臟對含碘小分子造影劑有快速消除效應(yīng)，含碘化合物只有非常短的成像時間，并且對腎臟有一定的毒副作用(Haller, C.；Hizoh, 1.1nvest.Rad1l.2004, 39, 149-154.) ? 因此，開發(fā)新型造影劑具有一定的必要性。
[0003]金元素由于X射線吸收系數(shù)大大高于碘而受到關(guān)注，單位質(zhì)量的金比碘的造影效果好2.7倍，顯示其做CT造影劑的潛力。通過表面修飾，金納米顆粒能在生理環(huán)境(如細胞培養(yǎng)液、血液、病變組織等)下具有良好的穩(wěn)定性和分散性。另外，報道的金納米顆粒造影劑具備良好的生物相容性和低生物毒性，揭示了金納米顆粒造影劑的良好前景。聚酰胺-胺樹枝狀大分子(PAMAM)因其精確的結(jié)構(gòu)、大量表面官能團和納米尺寸，作為載體廣受關(guān)注。已有研究人員用第四代、第五代聚酰胺-胺樹狀大分子作為模板制備金納米顆粒(< 5nm)用于CT成像，均取得優(yōu)于傳統(tǒng)造影劑更強的CT信號及更長的血液循環(huán)時間。
[0004]與高代數(shù)的樹狀大分子不同，低代數(shù)的樹狀大分子因其代數(shù)低而具有開放式的結(jié)構(gòu)，以及較少的表面基團。Liu等(Liu, H.；Xu, Y.H.；ffen, S.H.；Chen, Q.；Zheng, L.F.；Shenj M.W.；Zhao, J.L.；Zhang, G.X.；Shi, X.Y.Chemistry-A EuropeanJournal2013, 19，6409-6416.)用第二代聚酰胺-胺樹狀大分子作為穩(wěn)定劑制備金納米顆粒(> 5nm)并修飾葉酸祀向劑，實現(xiàn)對腫瘤組織的CT成像識別。另外，Liu 等(Liu, H.；ffang, H.；Xu, Y.H.；Shen, M.ff.；Zhao, J.L.；Zhang, G.X.；Shi, X.Y.Nanoscale2014, 6，4521-4526.)制備聚乙二醇化第二代樹狀大分子/金納米顆粒，成功控制顆粒納米尺寸，提高載金量和生物相容性。本專利在第二代樹狀大分子外圍修飾連接有一端為乳糖酸的聚乙二醇鏈，該載體包裹合成小尺寸金納米顆粒用于靶向肝癌的CT成像。另外，用熒光素化學(xué)標記載體，可以有效地跟蹤細胞對顆粒的吞噬情況。
[0005]檢索國內(nèi)外有關(guān)金納米顆粒用于CT造影方面的文獻和專利結(jié)果發(fā)現(xiàn):在本發(fā)明完成之前，還未發(fā)現(xiàn)熒光素標記和乳糖酸修飾的聚乙二醇化第二代樹狀大分子包裹金納米顆粒的制備及其CT成像應(yīng)用的相關(guān)報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種具有肝癌靶向功能的低代數(shù)樹狀大分子包裹的金納米顆粒作為CT納米造影劑的制備方法，本發(fā)明制備過程簡單，反應(yīng)條件溫和，具有產(chǎn)業(yè)化實施的前景；制備得到的金納米顆粒具備優(yōu)異的穩(wěn)定性和生物相容性。
[0007]本發(fā)明的一種具有肝癌靶向功能的低代數(shù)樹狀大分子包裹的金納米顆粒作為CT納米造影劑的制備方法，包括:
[0008](I)用熒光素標記樹狀大分子，得到異硫氰酸熒光素修飾的樹狀大分子G2-FITC ；
[0009](2)將乳糖酸-聚乙二醇LA-PEG-C00H溶解在溶劑中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDC活化4-6h后滴加入G2-FITC溶液中，室溫條件下攪拌反應(yīng)72-80h，透析，冷凍干燥，得到熒光素標記和乳糖酸修飾的聚乙二醇化樹狀大分子G2-FITC-PEG-LA ；
[0010](3)將上述熒光素標記和乳糖酸修飾的聚乙二醇化樹狀大分子G2-FITC-PEG-LA溶解在蒸餾水中，加入氯金酸水溶液，在室溫條件下攪拌10-20min，然后加入NaBHjK溶液，室溫下攪拌反應(yīng)2-3h，透析，冷凍干燥，即得具有肝癌靶向功能的CT納米造影劑。
[0011]所述步驟(I)中樹狀大分子為第2代聚酰胺-胺樹狀大分子。
[0012]所述步驟(I)中樹狀大分子與異硫氰酸熒光素的摩爾投料比為1:3.5。
[0013]所述步驟⑵中溶劑為二甲基亞砜。
[0014]所述步驟(2)中乳糖酸-聚乙二醇LA-PEG-C00H中乳糖酸與聚乙二醇的摩爾投料比為1.5:1。
[0015]所述步驟(2)中LA-PEG-C00H溶解在溶劑中后的濃度為10_15mg/mL。
[0016]所述步驟(2)中G2-FITC溶液的溶劑為二甲基亞砜，G2-FITC溶液的濃度為0.3-0.5mg/mL。
[0017]所述步驟⑵中LA-PEG-C00H、EDC與G2-FITC的摩爾投料比為15:15:1。
[0018]所述步驟(3)中G2-FITC-PEG-LA溶解在蒸餾水中的濃度為5_10mg/mL ;氯金酸水溶液的濃度為20-30mg/mL ;NaBH4水溶液的濃度為10_15mg/mL。
[0019]所述步驟(3)中NaBH4水溶液為冰浴預(yù)處理后的NaBH4水溶液。
[0020]所述步驟(3)中NaBH4與氯金酸的摩爾投料比為5_8:1 ;氯金酸與樹狀大分子的摩爾投料比為8:1。
[0021]所述步驟(2)、(3)中的透析為用透析膜先在PBS緩沖液中透析20_30h，然后再在蒸餾水透析40-60h。其中步驟(2)按順序所述所用透析膜為纖維素透析膜MWCO = 14000 ；步驟(3)所述的透析膜為纖維素透析膜MWCO = 14000。
[0022]用熒光素標記樹狀大分子，得到異硫氰酸熒光素修飾的樹狀大分子G2-FITC，具體為:
[0023]第二代聚酰胺-胺樹狀大分子(G2.NH2)溶于二甲基亞砜中，邊攪拌邊加入異硫氰酸熒光素(0.4mg/mL)的二甲基亞砜溶液。室溫反應(yīng)24h，對反應(yīng)液進行透析，蒸餾水(6次，2L/次)，透析3天。然后冷凍干燥得到異硫氰酸熒光素修飾的樹狀大分子，_20°C保存；其中樹狀大分子與異硫氰酸熒光素的摩爾投料比為1:3.5 ;透析所用的透析膜為纖維素透析膜 MWCO = 1000。
[0024]LA-PEG-C00H 的制備為:
[0025]乳糖酸溶于磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH = 6.0，0.02M)中，邊攪拌邊加入1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)。室溫反應(yīng)3h?；罨?，滴加入溶有聚乙二醇(Mw2000，兩末端分別為氨基和羧基，10mg/mL)的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH = 6.0,0.02M)中。室溫反應(yīng)72h,對反應(yīng)液進行透析,蒸餾水(6次，2L/次)，透析3天。然后冷凍干燥得到乳糖酸修飾的聚乙二醇，_20°C保存；其中乳糖酸與聚乙二醇的摩爾投料比為1.5:1。
[0026]本發(fā)明的一種熒光素標記和乳糖酸修飾的聚乙二醇化樹狀大分子包裹金納米顆粒用于CT成像。
[0027]本發(fā)明使用核磁共振氫譜(1H NMR)、紫外一可見分光光度計(UV-Vis)、透射電子顯微鏡(TEM)、MTT法、細胞流式術(shù)、CT成像等方法表征本發(fā)明制備的異硫氰酸熒光素標記、乳糖酸修飾的聚乙二醇化樹狀大分子包裹金納米顆粒，具體測試結(jié)果如下:
[0028](I)1H NMR 譜
[0029]核磁共振氫譜結(jié)果證實了 {(Au0)8- G2.Nh2-FITC-PEG6-LA4.JDENPs的結(jié)構(gòu)正確，參見附圖1。其中a對應(yīng)G2-FITC，b對應(yīng)PEG-LA，c對應(yīng)G2-FITC-PEG-LA。
[0030](2) UV-Vis 測試結(jié)果
[0031]合成的{(Au0)8-G2.Nh2-FITC-PEG6-LA4.8} DENPs 在 500_520nm 左右有一個特征吸收峰，它們分別是異硫氰酸熒光素的特征吸收峰和金納米顆粒的表面等離子體共振峰的疊力口，參見附圖2 ;異硫氰酸熒光素標記、乳糖酸修飾的聚乙二醇化樹狀大分子包裹金納米顆粒能穩(wěn)定分散在水中，且在不同的PH值(pH = 5.0-8.0)和不同溫度(4°C -50°C )范圍內(nèi)均具有非常好的穩(wěn)定性(PH值降低，異硫氰酸熒光素的特征吸收峰藍移，與金納米顆粒無關(guān))。參見附圖3和附圖4。
[0032](3) TEM測試結(jié)果
[0033]{(Au0)8- G2.Nh2-FITC-PEG6-LA4.JDENPs 的 TEM 圖片和粒度分布直方圖(參見附圖5)表明本方法合成的金納米顆粒的粒徑分布均勻，平均粒徑約為1.8nm。
[0034](4)體外X-射線衰減性能
[0035]體外X-射線衰減性能測試結(jié)果表明，異硫氰酸熒光素標記、乳糖酸修飾的聚乙二醇化樹狀大分子包裹金納米顆粒表現(xiàn)出優(yōu)于傳統(tǒng)造影劑碘海醇的X-射線衰減系數(shù)。參見附圖6。
[0036](5) MTT細胞活力檢測
[0037]將不同濃度的材料與細胞共培養(yǎng)，細胞毒性試驗結(jié)果表明在200-3000nM范圍內(nèi)，異硫氰酸熒光素標記、乳糖酸修飾的聚乙二醇化樹狀大分子包裹金納米顆粒顯示優(yōu)良的細胞相容性，沒有表現(xiàn)出顯著的細胞毒性。對比材料{(Au0)8- G2.NH2-FITC-mPEG6}DENPs (用NH2-PEg-COOH代替LA-PEG-C00H修飾G2-FITC)也以同樣的方案進行對比。參見附圖7。(6)流式細胞術(shù)對材料靶向HepG2細胞能力的檢測
[0038]流式細胞術(shù)結(jié)果表明相同濃度下的{(Au0)8- G2.Nh2-FITC-PEG6-LA4.JDENPs較于對比材料更容易進入HepG2細胞，證明異硫氰酸熒光素標記、乳糖酸修飾的聚乙二醇化樹狀大分子包裹金納米顆粒對HepG2細胞具有特異性靶向作用。參見附圖8。
[0039](7)體外材料靶向HepG2細胞的CT成像
[0040]CT 掃描結(jié)果表明相同金濃度下{(Au0) 8 - G2.NH2-FITC_PEG6-LA4.8} DENPs 與 H印G2細胞共培養(yǎng)后處理的細胞懸浮液的CT信號比對比材料強，證明異硫氰酸熒光素標記、乳糖酸修飾的聚乙二醇化樹狀大分子包裹金納米顆粒對H印G2細胞具有特異性靶向作用。參見附圖9。
[0041](8)體內(nèi)CT造影測試
[0042]體內(nèi)CT造影測試結(jié)果表明，聚乙二醇化樹狀大分子/金納米顆粒與傳統(tǒng)造影劑碘海醇相比，表現(xiàn)出延長的血液循環(huán)時間。相比之下，碘海醇20min左右即被迅速代謝。另外，相同劑量注射靶向材料和非靶向材料后，前者腫瘤部位的CT值更高，說明材料更易被運輸?shù)侥[瘤位點，有更好的造影效果。參見附圖10和11。
[0043](9)體內(nèi)分布情況檢測
[0044]ICP-OES結(jié)果顯示尾靜脈注射120min后，除了腎臟以外，納米顆粒主要富集于脾臟和肝臟等內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)。這說明，該聚乙二醇化樹狀大分子/金納米顆粒主要通過內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)代謝。而相對于非靶向?qū)φ战M，靶向金納米顆粒在腫瘤處富集量更多，證明了本材料的特異性靶向作用。參見附圖12。24h和48h的組織分布顯示納米顆粒仍然集中于脾臟、肝臟和腎臟，并逐步代謝。參見附圖13。
[0045]有益.效果
[0046](I)本發(fā)明的制備過程簡單，反應(yīng)條件溫和，具有產(chǎn)業(yè)化實施的可能性；
[0047](2)本發(fā)明方法制備的金納米顆粒具備優(yōu)異的穩(wěn)定性和生物相容性，表現(xiàn)出延長的體內(nèi)血液循環(huán)時間。
[0048](3)本發(fā)明的異硫氰酸熒光素標記、乳糖酸修飾的聚乙二醇化樹狀大分子包裹金納米顆粒對肝癌細胞H印G2具有較好的靶向性，同時具有優(yōu)于傳統(tǒng)造影劑碘海醇的CT值，是一種有潛力的新型造影劑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0049]圖1為本發(fā)明制備的中間產(chǎn)物的1H NMR，其中a對應(yīng)G2_FITC，b對應(yīng)PEG_LA，c對應(yīng) G2-FITC-PEG-LA ；
[0050]圖2 為本發(fā)明制備的{(Au0)8 - G2.NH2-FITC-PEG6-LA4 iJDENPs 在 25。。、pH = 7.0的紫外吸收光譜圖；
[0051 ] 圖3為本發(fā)明制備的{(Au0) 8 - G2.NH2-FITC-PEG6-LA4.8} DENPs在不同溫度下的UV-Vis 譜圖；
[0052]圖4 為本發(fā)明制備的{(Au。) 8-G2.NH2-FITC-PEG6-LA4 8} DENPs (a)和G2.NH2-FITC (b)在不同pH條件下的UV-Vis譜圖；
[0053]圖5 為本發(fā)明制備的{(Au0) 8 - G2.NH2-FITC_PEG6-LA4.8} DENPs 的(a) TEM 圖片；(b)高分辨TEM圖片；(c)粒徑分布圖；
[0054]圖6為本發(fā)明制備的{(Au0)8- G2.NH2-FITC_PEG6-LA4.8}DENPs與碘海醇的體外X-射線衰減系數(shù)比較；圖6a為CT成像圖片(I碘海醇，2 {(Au0)8- G2.NH2-FITC-PEG6-LA4.8}DENPs)，圖6b為測得的X-射線衰減強度結(jié)果；
[0055]圖7為本發(fā)明制備的{(Au0)8- G2.NH2-FITC_PEG6-LA4.JDENPs與對比材料的細胞毒性試驗結(jié)果；
[0056]圖8為流式細胞術(shù)測定的本發(fā)明制備的{(Autl)8 - G2.NH2-FITC_PEG6-LA4.JDENPs與對比材料被IfepG2細胞吞噬情況的比較；
[0057]圖9為本發(fā)明制備的{(Au0)8- G2.NH2-FITC_PEG6-LA4.JDENPs與對比材料的細胞CT成像效果和CT值的比較；圖9a為CT成像圖片，圖9b為測得的X-射線衰減強度結(jié)果；
[0058]圖10為本發(fā)明制備的{(Au0)8- G2.NH2-FITC_PEG6-LA4.8}DENPs與碘海醇、對照材料尾靜脈注射后對小鼠腫瘤模型造影效果；
[0059]圖11為本發(fā)明制備的{(Au0)8- G2.NH2-FITC_PEG6-LA4.8}DENPs與碘海醇、對照材料尾靜脈注射后小鼠腫瘤區(qū)域CT值比較，灰色箭頭指向腫瘤區(qū)域；
[0060]圖12為本發(fā)明制備的{(Au0)8- G2.NH2-FITC_PEG6-LA4.JDENPs與對照材料尾靜脈注射120min后的體內(nèi)組織分布情況；
[0061]圖13 為本發(fā)明制備的{(Au0)8- G2.NH2-FITC_PEG6-LA4.JDENPs 尾靜脈注射 24h 和48h后的體內(nèi)組織分布情況；
[0062]圖14為本發(fā)明的反應(yīng)原理示意圖。

【具體實施方式】
[0063]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0064]實施例1
[0065](I)第二代聚酰胺-胺樹狀大分子(G2.NH2) 16.28mg溶于3.2mL 二甲基亞砜中，邊攪拌邊加入異硫氰酸熒光素(0.4mg/mL)的二甲基亞砜溶液17.04mL。室溫反應(yīng)24h，對反應(yīng)液進行透析，蒸餾水出次，2L/次)，透析3天。然后冷凍干燥得到異硫氰酸熒光素修飾的樹狀大分子，_20°C保存。1H NMR測試結(jié)果表明:譜圖中出現(xiàn)在2.0-3.7ppm和6.3-8.0ppm的化學(xué)位移峰分別對應(yīng)為樹狀大分子和異硫氰酸熒光素的特征峰。由積分面積計算可得，每個樹狀大分子表面修飾了約2.5個異硫氰酸熒光素分子(附圖1a)。
[0066](2)乳糖酸32.25mg溶于3.75mL磷酸氫二鈉_磷酸二氫鈉緩沖液(pH = 6.0，0.02M)中，邊攪拌邊加入17.25mgl-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和10.36mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)。室溫反應(yīng)3h?；罨?，滴加入12mL溶有聚乙二醇(Mw2000，兩末端分別為氨基和羧基，10mg/mL)的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH =6.0，0.02M)中。室溫反應(yīng)72h，對反應(yīng)液進行透析，蒸餾水(6次，2L/次)，透析3天。然后冷凍干燥得到乳糖酸修飾的聚乙二醇，_20°C保存。1H NMR測試結(jié)果表明:譜圖中出現(xiàn)在3.7ppm和3.8-4.3ppm的化學(xué)位移峰分別對應(yīng)為聚乙二醇和乳糖酸的特征峰。由積分面積計算可得，每個聚乙二醇修飾了約0.8個乳糖酸分子(附圖1b)。
[0067](3)將(2)所得產(chǎn)品132.35mg溶于9.0OmL 二甲基亞砜中。隨后，邊攪拌邊加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)Il.1Omgo室溫反應(yīng)6h?；罨螅渭尤?I)所得產(chǎn)品的二甲基亞砜溶液32.64mL(0.5mg/mL)中，室溫攪拌反應(yīng)72h。反應(yīng)結(jié)束后，對所得溶液進行透析，蒸餾水出次，2L/次)，透析3天。然后進行冷凍干燥處理得到異硫氰酸熒光素標記、乳糖酸修飾的聚乙二醇化樹狀大分子，-20°C保存。1H NMR測試結(jié)果表明:譜圖中出現(xiàn)在3.7ppm的化學(xué)位移峰為聚乙二醇中亞甲基的特征峰，2.0-3.7ppm的化學(xué)位移峰為樹狀大分子的特征峰。由積分面積計算可得，樹狀大分子表面修飾了約6個一端為乳糖酸的聚乙二醇分子(附圖1c)。







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8記、乳糖酸修飾的聚乙二醇化樹狀大分子包裹金納米顆粒對HepG2細胞具有特異性靶向作用。
[0080]實施例6
[0081]取實施例2所得產(chǎn)品以蒸餾水為溶劑，配制金濃度為0.08M的母液。之后梯度稀釋出0.06,0.04,0.02,0.01和0.005M的樣品。同時，以臨床用碘海醇為對照材料，以蒸餾水稀釋出相應(yīng)碘濃度的樣品。之后，對這兩組材料進行CT成像測試。
[0082]CT成像測試結(jié)果顯示，在試驗濃度范圍內(nèi)，異硫氰酸熒光素標記、乳糖酸修飾的聚乙二醇化樹狀大分子包裹金納米顆粒表現(xiàn)出優(yōu)于碘海醇的X-射線衰減系數(shù)(附圖6)。
[0083]實施例7
[0084]取實施例2所得產(chǎn)品以PBS緩沖液為溶劑，用無菌PBS緩沖液配制成30000nM的母液。之后梯度稀釋為2000、5000、10000、20000nM的樣品溶液。另以同樣方案準備不含乳糖酸靶向分子的對照材料的樣品溶液。
[0085]取培養(yǎng)好的H印G2細胞種于6孔板中，按照200萬細胞/孔的密度接種，每孔體積2mL。培養(yǎng)過夜后，加入上述兩種各稀釋梯度的樣品，與細胞共培養(yǎng)4h。每個梯度用培養(yǎng)液稀釋10倍，即每孔終濃度分別為200、500、1000、2000nM。以PBS緩沖液作為空白對照。胰酶消化離心后收集細胞，并將細胞均勻的分散在200 μ L PBS緩沖液中。之后，對這兩組材料進行CT成像測試。
[0086]CT成像測試結(jié)果顯示，在試驗濃度范圍內(nèi)，異硫氰酸熒光素標記、乳糖酸修飾的聚乙二醇化樹狀大分子包裹金納米顆粒表現(xiàn)出優(yōu)于不含乳糖酸靶向試劑的對照材料的CT值(附圖9)。證明異硫氰酸熒光素標記、乳糖酸修飾的聚乙二醇化樹狀大分子包裹金納米顆粒對HepG2細胞具有特異性靶向作用。
[0087]實驗例8
[0088]取實施例2所得產(chǎn)品12.1mg,分散于無菌PBS緩沖液中，制備得到金濃度為0.05M的溶液。取荷瘤裸鼠(肝癌)一只，尾靜脈注射造影劑0.lmL，進行活體CT成像實驗。以碘海醇和相同劑量不含靶向的對照材料為對照，注射碘的劑量與金一致。三只裸鼠重量為24-28g，腫瘤大小為 0.5-0.8cm3。
[0089]體內(nèi)CT造影測試結(jié)果(附圖10和11)表明，聚乙二醇化樹狀大分子包裹的金納米顆粒與傳統(tǒng)造影劑碘海醇相比，表現(xiàn)出延長的血液循環(huán)時間。相比之下，碘海醇20min左右即被迅速代謝。另外，相同劑量注射的靶向材料和非靶向材料后，前者腫瘤部位的CT值更高，說明材料更易被運輸?shù)侥[瘤位點，有更好的造影效果。
[0090]實驗例9
[0091]實施例8中荷瘤裸鼠的CT掃描結(jié)束后，立即將其處死，取血液、腫瘤和各主要器官(心、肝、脾、肺、腎)稱重，以注射碘海醇的荷瘤裸鼠作為空白對照。將取好的器官浸泡于王水過夜。隨后過濾、稀釋，進行ICP-OES測試(附圖12)。
[0092]另取兩只近似大小的荷瘤裸鼠通過尾靜脈注射同上相同劑量的終產(chǎn)品，分別在24h和48h后處死，取腫瘤和各主要器官(心、肝、脾、肺、腎)稱重。將取好的器官浸泡于王水過夜。隨后過濾、稀釋，進行ICP-OES測試(附圖13)。
[0093]ICP-OES結(jié)果顯示尾靜脈注射120min后，除了腎臟以外，納米顆粒主要富集于脾臟和肝臟等內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)。這說明，該聚乙二醇化樹狀大分子/金納米顆粒主要通過內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)代謝。而相對于非靶向?qū)φ战M，靶向金納米顆粒在腫瘤處富集量更多，證明了本材料的特異性靶向作用。24h和48h的組織分布顯示納米顆粒仍然集中于脾臟、肝臟和腎臟，并逐步代謝。
【權(quán)利要求】
1.一種具有肝癌靶向功能的低代數(shù)樹狀大分子包裹的金納米顆粒作為CT納米造影劑的制備方法，包括: (1)用熒光素標記樹狀大分子，得到異硫氰酸熒光素修飾的樹狀大分子G2-FITC； (2)將乳糖酸-聚乙二醇LA-PEG-COOH溶解在溶劑中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDC活化4-6h后滴加入G2-FITC溶液中，室溫條件下攪拌反應(yīng)72-80h，透析，冷凍干燥，得到熒光素標記和乳糖酸修飾的聚乙二醇化樹狀大分子G2-FITC-PEG-LA ； (3)將上述熒光素標記和乳糖酸修飾的聚乙二醇化樹狀大分子G2-FITC-PEG-LA溶解在蒸餾水中，加入氯金酸水溶液，在室溫條件下攪拌10-20min，然后加入NaBH4水溶液，室溫下攪拌反應(yīng)2-3h，透析，冷凍干燥，即得具有肝癌靶向功能的CT納米造影劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有肝癌靶向功能的低代數(shù)樹狀大分子包裹的金納米顆粒作為CT納米造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中樹狀大分子為第2代聚酰胺-胺樹狀大分子；樹狀大分子與異硫氰酸熒光素的摩爾投料比為1:3.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有肝癌靶向功能的低代數(shù)樹狀大分子包裹的金納米顆粒作為CT納米造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中溶劑為二甲基亞砜；LA-PEG-C00H溶解在溶劑中后的濃度為10-15mg/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有肝癌靶向功能的低代數(shù)樹狀大分子包裹的金納米顆粒作為CT納米造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中G2-FITC溶液的溶劑為二甲基亞砜，G2-FITC溶液的濃度為0.3-0.5mg/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有肝癌靶向功能的低代數(shù)樹狀大分子包裹的金納米顆粒作為CT納米造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中乳糖酸-聚乙二醇LA-PEG-C00H中乳糖酸與聚乙二醇的摩爾投料比為1.5:1 ;LA-PEG-C00H、EDC與G2-FITC的摩爾投料比為15:15:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有肝癌靶向功能的低代數(shù)樹狀大分子包裹的金納米顆粒作為CT納米造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中G2-FITC-PEG-LA溶解在蒸餾水中的濃度為5-10mg/mL ;氯金酸水溶液的濃度為20_30mg/mL ;NaBH4水溶液的濃度為10_15mg/mLo
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有肝癌靶向功能的低代數(shù)樹狀大分子包裹的金納米顆粒作為CT納米造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中NaBHpK溶液為冰浴預(yù)處理后的NaBH4水溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有肝癌靶向功能的低代數(shù)樹狀大分子包裹的金納米顆粒作為CT納米造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中NaBH4與氯金酸的摩爾投料比為5-8:1 ;氯金酸與樹狀大分子的摩爾投料比為8:1。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有肝癌靶向功能的低代數(shù)樹狀大分子包裹的金納米顆粒作為CT納米造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)、(3)中的透析為用透析膜先在PBS緩沖液中透析20-30h，然后再在蒸餾水透析40-60h。
【文檔編號】A61K49/04GK104258420SQ201410432031
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月28日
【發(fā)明者】史向陽, 曹已蕓, 劉輝, 夏進東, 何瑤 申請人:東華大學(xué), 上海市第一人民醫(yī)院