黨參多糖硫酸酯在制備抗Ⅰ型單純皰疹病毒藥物中的應(yīng)用及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種黨參多糖硫酸酯在制備抗Ⅰ型單純皰疹病毒藥物中的應(yīng)用及其制備方法。本發(fā)明采用氨基磺酸法對(duì)黨參多糖進(jìn)行硫酸酯化修飾，優(yōu)化了修飾方法，并發(fā)現(xiàn)黨參多糖硫酸酯對(duì)單純皰疹病毒Ⅰ型具有較強(qiáng)的預(yù)防及治療效果。同時(shí)還篩選出活性最好的黨參多糖硫酸酯（取代度為0.763），無(wú)論是預(yù)防給藥還是治療給藥，細(xì)胞存活率均高于病毒對(duì)照組（P<0.01），且其預(yù)防作用與阿昔洛韋相當(dāng)（P>0.05），治療效果優(yōu)于阿昔洛韋（P<0.05）。表明其抗病毒活性最強(qiáng)，可以作為研制新型抗HSV-Ⅰ病毒藥物的材料，為研制新型抗HSV-Ⅰ病毒藥物提供了材料和理論依據(jù)。
【專利說(shuō)明】黨參多糖硫酸酯在制備抗I型單純皰疹病毒藥物中的應(yīng)用 及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種藥學(xué)領(lǐng)域，尤其是一種黨參多糖硫酸酯在制備抗I型單純皰疹病 毒藥物中的應(yīng)用及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 單純痛疫病毒I型（herpes simplex virus type I , HSV- I )屬于痛疫病毒亞 科，主要引起生殖器以外的皮膚、粘膜（口腔粘膜）和器官（腦）的感染，可引起人腰部以 上黏膜和神經(jīng)系統(tǒng)感染，所致疾病主要有角膜炎、皰疹性腦炎、唇皰疹和齦口炎等，并可形 成潛伏感染。人是單純皰疹病毒的唯一自然宿主。病毒經(jīng)呼吸道、口腔、生殖器粘膜以及破 損皮膚進(jìn)入體內(nèi)，潛居于人體正常粘膜、血液、唾液及感覺(jué)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)。原發(fā)性感染多為 隱性，大多無(wú)臨床癥狀或呈亞臨床表現(xiàn)，僅有少數(shù)可出現(xiàn)臨床癥狀。原發(fā)感染發(fā)生后，病毒 可長(zhǎng)期潛伏于體內(nèi)。正常人群中約有50%以上為該病毒的攜帶者。HSV在人體內(nèi)不產(chǎn)生永 久免疫力，每當(dāng)機(jī)體抵抗力下降時(shí)，如發(fā)熱、胃腸功能紊亂、月經(jīng)、妊娠、病灶感染和情緒改 變時(shí)，體內(nèi)潛伏的HSV被激活而發(fā)病。研究證明，復(fù)發(fā)性單純皰疹患者可有細(xì)胞免疫缺陷。 HSV- I是普遍存在的且接觸傳染的，當(dāng)患者產(chǎn)生和釋放病毒時(shí)，單純皰疹病毒就會(huì)傳播，危 害很大。HSV- I -般傳播的非?？焖俸蛷V泛，對(duì)人的潛伏感染的時(shí)間是非常長(zhǎng)的。
[0003] 單純皰疹病毒I型具有宿主變化范圍大，在細(xì)胞培養(yǎng)中繁殖與傳播速度快，易破 壞感染細(xì)胞和常在神經(jīng)節(jié)中建立潛伏感染的特點(diǎn)。感染人體后可侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起單 純皰疹病毒性腦炎，腦膜炎，導(dǎo)致病毒性腦損傷，能感染人體臟器組織導(dǎo)致器官病變（如 非嗜肝病毒性肝炎），危及生命。還能能引起口唇皰疹、角膜炎、內(nèi)臟器官感染等。病毒由 包膜、被膜、核衣殼和含有病毒DNA的核心組成，由于HSV的基因?yàn)殡p鏈DNA，易與宿主DNA 發(fā)生整合作用，或形成潛伏狀態(tài)，限制了病毒疫苗的發(fā)展和作用。因此，研制開(kāi)發(fā)高效低 毒的新型抗病毒藥物仍是當(dāng)今抗病毒研究熱點(diǎn)之一。
[0004] 目前國(guó)內(nèi)外治療單純皰疫病毒的藥物以阿昔洛韋及其衍生物為多，但該類藥物存 在毒副作用大、易耐藥等許多不足，在臨床應(yīng)用中受到限制。因此國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者都在不斷 尋求安全有效的抗HSV- I的新型藥物。
[0005] 多糖（Polysaccharide)是中藥重要活性成分之一，由10個(gè)以上的單糖分子通 過(guò)糖苷鍵聚合而成，在生物體內(nèi)作為能量物質(zhì)，廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)和微生物細(xì)胞壁中， 參與細(xì)胞的各種生理活動(dòng)。多糖作為生物活性物質(zhì)能夠抗各種病毒，如免疫缺陷病毒、肝炎 病毒、流感病毒、單純皰疫病毒、巨細(xì)胞病毒等有抑制作用，具有無(wú)細(xì)胞毒性且質(zhì)量通過(guò)化 學(xué)手段容易控制等優(yōu)點(diǎn)，己引起醫(yī)藥界的高度重視，顯示了廣闊的藥用前景。
[0006] 但天然藥物的藥效相對(duì)較低，多糖的活性直接或間接地受其分子結(jié)構(gòu)的影響，與 其初級(jí)和高級(jí)結(jié)構(gòu)特別是三維空間構(gòu)象密切相關(guān)，而且與分子量、溶解度、粘度等物理化學(xué) 性質(zhì)有關(guān)。采取一定的方法對(duì)多糖分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，通過(guò)改變多糖的空間結(jié)構(gòu)、分子量及 取代基種類、數(shù)目和位置，可以提高或賦予多糖新的生物活性、降低其毒副作用。目前最為 常見(jiàn)的修飾方法有：硫酸化、磷酸化、乙?；⑼榛?、羧甲基化等。無(wú)論天然或化學(xué)合成多 糖經(jīng)不同程度的硫酸化修飾后其抗病毒活性會(huì)有明顯的變化，尤其是一些無(wú)抗病毒作用的 多糖硫酸化修飾后具有了抗病毒活性。如香菇多糖本身雖無(wú)抗HIV活性，硫酸化修飾后卻 可抑制人類免疫缺陷病毒HIV產(chǎn)生的細(xì)胞病變。多糖硫酸化的抗病毒活性研究成為多糖修 飾研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，已成為多糖結(jié)構(gòu)修飾中的一個(gè)重要方向。
[0007] 多糖硫酸酯（polysaccharides sulfate，PSS)，也稱硫酸多糖（sulfated potysaccharides，SPS)，是多糖大分子鏈中單糖分子上的輕基被硫酸根所取代而形成的天 然及半合成的酸性多糖，為聚陰離子化合物糖。具有廣泛的生物學(xué)性質(zhì)，包括抗病毒、抗腫 瘤、對(duì)免疫系統(tǒng)作用和抗凝活性。有文獻(xiàn)報(bào)道多種多糖硫酸酯具有抗病毒作用。有研究資 料表明，多糖硫酸酯顯著的抗病毒活性可能是硫酸基團(tuán)的負(fù)電荷與病毒上蛋白的正電荷通 過(guò)靜電作用結(jié)合，進(jìn)而阻止了病毒對(duì)細(xì)胞的吸附，封閉了包膜病毒與細(xì)胞受體結(jié)合的部 位，其硫酸聚陰離子對(duì)病毒感染細(xì)胞進(jìn)行抑制作用發(fā)揮更強(qiáng)的抗病毒活性。此外多糖硫酸 酯的抗病毒作用機(jī)制也歸功于對(duì)病毒向細(xì)胞吸附相關(guān)作用的抑制，即直接抑制病毒進(jìn)入細(xì) 胞或進(jìn)入細(xì)胞后復(fù)制的某一步驟。從已有的多糖硫酸酯研究來(lái)看，大多是通過(guò)病毒與宿主 細(xì)胞之間的分子親和力來(lái)完成吸附過(guò)程，從而達(dá)到抗病毒的作用。此外引入硫酸基團(tuán)后所 引起的多糖立體結(jié)構(gòu)的變化也是硫酸化多糖產(chǎn)生生物學(xué)活性的重要原因。
[0008] 黨參為桔?？浦参稂h參Cbt/orfFpsis (Franch. ) Nannf.、素花黨參 Codonopsis pilosula Nannf. var. modesta (Nannf. ) L. T. Shen 5? j 11 Codonopsi s Oliv.的干燥根，以肉質(zhì)根食用或入藥。黨參具有健脾益肺，養(yǎng)血生津的作用。 常用于脾肺氣虛，食少倦怠，咳嗽虛喘，氣血不足等病癥。黨參主要成分有黨參多糖、黨參皂 苷、甾醇類、三廠類、生物堿、內(nèi)酯類、香豆素類等。黨參多糖（Oliv. polysaccharides)是從黨參的干燥根中提取分離得到的水溶性雜多糖，藥理試驗(yàn)證明黨參 多糖具有明確的增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗應(yīng)激、抗衰老等多個(gè)方面的藥理作用。但黨參抗病 毒研究的文獻(xiàn)只見(jiàn)茍鵬報(bào)到了輪葉黨參提取物對(duì)犬細(xì)小病毒有一定的抑制作用，和黨參多 糖硫酸酯對(duì)雞新城疫病毒（NDV)有抑制作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是：提供一種黨參多糖硫酸酯的新用途。
[0010] 還提供了一種黨參多糖硫酸酯的新制備方案。
[0011] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：黨參多糖硫酸酯在制備抗I型單純皰疹病毒藥物中的應(yīng) 用。
[0012] 黨參多糖硫酸酯的制備方法，先提取、純化黨參多糖，用氨基磺酸法對(duì)黨參多糖進(jìn) 行硫酸化修飾，修飾條件為黨參多糖與氨基磺酸的摩爾質(zhì)量比為1:0. 〇4g/mol，反應(yīng)時(shí)間15 min〇
[0013] 獲得取代度為0. 763的黨參多糖硫酸酯。
[0014] 為了驗(yàn)證本發(fā)明的技術(shù)效果，發(fā)明人進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)： 1、黨參多糖的提取 用水煎-醇沉法。取黨參飲片1000 g，粉碎，至于索氏提取器中，用80%乙醇加熱回流 3次脫脂，藥渣加10倍量水煎煮3次，第1次3 h，第2次2 h，第3次1 h ;抽濾藥渣，合并 3次濾液后濃縮。濃縮液加入95%乙醇到乙醇含量為80%，于4 °C冰箱內(nèi)靜置12 h后，3000 r/min離心，收集沉淀部分，真空干燥后，復(fù)溶，加95%乙醇到乙醇含量為80%后，離心，收集 沉淀，凍干，干燥沉淀物，得到深棕色黨參粗多糖。黨參多糖的最佳提取工藝是溫度l〇〇°C， 料液比為16倍，提取時(shí)間為3h，提取次數(shù)為2次，在此條件下，黨參粗糖的提取率為26%左 右。
[0015] 2、黨參多糖的純化 (1)粗多糖中除去蛋白質(zhì)：黨參粗多糖按照1:100(g/mL)溶解于足量蒸餾水中后，另取 少量溶液，加蒸餾水稀釋后，在紫外分光光度計(jì)下從800nm到200nm波長(zhǎng)進(jìn)行掃描。對(duì)溶 解有粗多糖的溶液中，每l〇〇〇mL中加入lg胃蛋白酶，并在37°C下進(jìn)行恒溫水浴12h后，將 200mL的氯仿與正丁醇混合物加入含有胃蛋白酶的粗多糖中，充分震蕩，靜置12h后分離收 集下層有機(jī)相，棄去中層變性蛋白層，收集上層含有黨參多糖的水溶液，并在紫外分光光度 計(jì)下做全波長(zhǎng)掃描，反復(fù)數(shù)次，直至水溶液無(wú)蛋白的特征吸收峰26(T280nm處無(wú)蛋白特征 吸收峰時(shí)，證明多糖中的蛋白已經(jīng)清除干凈。
[0016] (2)黨參多糖脫色素處理 將去蛋白的黨參多糖溶液濃縮后，加入5倍量95%乙醇醇沉，離心收集醇沉多糖，復(fù)溶 后，再次醇沉處理，經(jīng)過(guò)數(shù)次后，醇沉上清液顏色變無(wú)色后，證明粗多糖中的色素已經(jīng)被脫 去。收集多次醇沉的黨參多糖凍干，得到灰白色黨參多糖，證明多糖中的色素已經(jīng)得到清 除，清除后的黨參多糖收集保存于4°C備用。
[0017] (3)膜分離純化黨參多糖 將去蛋白、脫色素的黨參粗多糖l〇g，溶解后將此溶液在3500r/min的速度下離心，棄 去不溶物后，上清液轉(zhuǎn)移到容量瓶中定容至500ml，使得黨參粗多糖溶液濃度為20mg/mL， 得到黨參多糖C0P-1組分，在4°C條件下保存待透析。
[0018] 將離心后的C0P-1多糖裝入不同截留量大小的透析袋中進(jìn)行透析，分別收集濃縮 透析袋內(nèi)透析液，凍干后得到C0P-2，C0P-3、C0P-4三份多糖樣品。C0P-2組分糖分子量在 350(Tl0000之間；C0P-3多糖分子量大于10000 ;C0P-4多糖分子量在350(Γ7000之間，將透 析袋分離后多糖凍干物均在4°C條件下保存?zhèn)溆谩?br> [0019] (4)DEAE-52陰離子交換柱層析分離黨參多糖 濕法裝DEAE-52陰離子交換層析柱，將用HC1、NaOH溶液中浸泡處理的DEAE-52粉末， 用大量去離子水反復(fù)沖洗至中性后，平衡，過(guò)夜，取膜分離純化處理后的黨參多糖C0P-2溶 液上樣，開(kāi)啟恒流泵，用〇、. 3mol/L的NaCl洗脫，恒流泵流速設(shè)置為0. 2mL/min，收集洗脫 液，5 mL /管，各管取樣后按照苯酚-硫酸法檢測(cè)多糖含量，繪制多糖洗脫曲線，合并收集含 糖管洗脫液，進(jìn)一步分離純化。
[0020] 黨參多糖經(jīng)過(guò)DEAE-52纖維素凝膠對(duì)分離后，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)， 取各管中洗脫液，采用苯酚-硫酸法做洗脫曲線見(jiàn)圖1所示，洗脫曲線顯示第25管-28管 中有較大吸收峰，收集25~28管合并。收集完組分1后，換用0. lmol/L的NaCl溶液洗脫 DEAE凝膠，后得到組分2。組分1含量較多，對(duì)收集合并后組分1反復(fù)過(guò)柱純化后，合并濃 縮凍干后得到第一個(gè)分離組分，該組分程白色粉末狀，無(wú)特殊氣味. (5)葡聚糖G-25凝膠柱層析分離黨參多糖 濕法裝葡聚糖G-25凝膠層析柱，用0. 9% NaCl沖洗，平衡，過(guò)夜，取經(jīng)DEAE-52陰離子 交換柱層析分離的黨參多糖組分1溶液上樣，開(kāi)啟恒流泵，用去離子水進(jìn)行洗脫，恒流泵流 速設(shè)置為〇.2mL/min，收集洗脫液，5 mL /管，各管取樣后按照苯酚-硫酸法檢測(cè)多糖含量， 繪制多糖洗脫曲線，合并收集含糖管洗脫液，再進(jìn)一步分離純化。
[0021] 采用G-25葡聚糖凝膠，對(duì)DEAE-52凝膠分離后的黨參多糖組分1進(jìn)一步做脫鹽處 理。DEAE凝膠分離的組分1部分經(jīng)G-25凝膠分離結(jié)果見(jiàn)圖2 :該凝膠下洗脫曲線做法與 DEAE-52下做法相同。由于在G-25凝膠中，最后洗脫組分為分子量較小的物質(zhì)，不是實(shí)驗(yàn)分 離設(shè)定的目標(biāo)多糖，因此對(duì)G-25凝膠分離后僅收集組分1部分。
[0022] (6)葡聚糖G-100凝膠柱層析分離黨參多糖 濕法裝葡聚糖G-100凝膠層析柱，用0. 15mol/L的NaCl沖洗，平衡，過(guò)夜，取經(jīng)G-25凝 膠分離后的黨參多糖溶液上樣，開(kāi)啟恒流泵，洗脫液為(TO. 3mol/L的NaCl溶液，恒流泵流 速設(shè)置為〇.2mL/min，收集洗脫液，5 mL /管，各管取樣后按照苯酚-硫酸法檢測(cè)多糖含量， 繪制多糖洗脫曲線，將G-25凝膠分離合并的組分1部分，再經(jīng)葡聚糖G-100凝膠多次分離 后進(jìn)行純化，對(duì)洗脫組分做洗脫曲線后，收集合并第21~27管組分，合并濃縮后凍干，分離 得到黨參多糖C0P-5(見(jiàn)圖3)組分，采用苯酚-硫酸法測(cè)定其多糖含量，糖含量達(dá)到98. 61%， 糖醛酸含量為4. 72%。
[0023] (7)黨參多糖的分子量測(cè)定 黨參多糖分子量HPLC法測(cè)定條件：儀器：Agilent 1100型高效液相色譜系統(tǒng)；色譜 柱為：色譜柱：Ultrahydrogel?2000 和 Ultrahydrogel? 500 柱兩根串聯(lián)（25 cm X 0.75 cm ;流動(dòng)相：0. 2mol/mL的NaCl溶液；流速：0. 8mL/min，進(jìn)樣體積40 μ 1，柱溫40°C，檢測(cè)器： 示差檢測(cè)器，參比為液體流動(dòng)相，在上述色譜條件下對(duì)黨參多糖進(jìn)行分子量測(cè)定。
[0024] 測(cè)定方法：精密稱取已知相對(duì)分子量的普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，用蒸餾水溶解 后，配制lmg/ml的溶液，對(duì)照品相對(duì)分子量分別為為：2.0X 106,7.88X 105,4.04X 105， 2. 12 X105，1. 12 X 104,4. 73 X 103,按照3. 5. 1下方法測(cè)定分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0025] 精密稱取lmg的黨參多糖C0P-5樣品后，加入到lmL的流動(dòng)相中，充分振蕩溶解 后，離心lOmin除去不溶物后，取上清液，得到多糖供試品后，進(jìn)樣后對(duì)不同的多糖樣品分 子量進(jìn)行測(cè)定。
[0026] 取已知分子量的糖，采用SEC色譜法測(cè)定分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線后以分子量作為縱坐 標(biāo)，時(shí)間作為橫坐標(biāo)，采用最小二乘法對(duì)數(shù)據(jù)處理后，得到分子量-時(shí)間曲線先回歸方程 Y=-0. 2291X+9. 453 (r=0. 998)，分子量在 4. 73X 103?2. 0X106 內(nèi)線性關(guān)系良好。
[0027] 對(duì)不同條件下分離得到的幾種黨參多糖分子量，進(jìn)行凝膠排阻法進(jìn)行分子量、純 度測(cè)定，具體的數(shù)據(jù)如表1所示，經(jīng)過(guò)DEAE-52凝膠、G-25、G-100凝膠層析柱聯(lián)合分離后的 多糖C0P-5組分，凝膠排阻色譜測(cè)定其純度D值為1. 42,表明糖的均一性好，90%的分子量 與數(shù)均分子量、眾均分子量，分布系數(shù)數(shù)據(jù)顯示，C0P-5組分的黨參多糖這4個(gè)指標(biāo)接近，也 表明了凝膠分離多糖后，對(duì)于多糖的分子量得到了較好的控制。

【權(quán)利要求】
1. 一種黨參多糖硫酸酯在制備抗I型單純皰疹病毒藥物中的應(yīng)用。
2. -種黨參多糖硫酸酯的制備方法，其特征在于：先提取、純化黨參多糖，再用氨基磺 酸法對(duì)黨參多糖進(jìn)行硫酸化修飾，修飾條件為黨參多糖與氨基磺酸的摩爾質(zhì)量比為1:0. 04 g/mol，反應(yīng)時(shí)間15 min。
3. 權(quán)利要求2所述的黨參多糖硫酸酯的制備方法，其特征在于：獲得取代度為0. 763 的黨參多糖硫酸酯。
【文檔編號(hào)】A61K31/737GK104147042SQ201410441135
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月2日
【發(fā)明者】余蘭, 王毅 申請(qǐng)人:遵義醫(yī)學(xué)院