一株彎曲乳桿菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株彎曲乳桿菌及其應用。本發(fā)明公開一株彎曲乳桿菌(Lactobacillus crispatus)，其保藏編號為CGMCC No.9388。本發(fā)明公開的彎曲乳桿菌(Lactobacillus crispatus)IMC-12，具有較強的產(chǎn)生H2O2的能力，可有效抑制外來的病原菌和其他條件致病菌的生長，同時又具有較強的對陰道上皮細胞的粘附作用，保證了菌株在陰道上皮的定植，彎曲乳桿菌IMC-12在泌尿生殖道感染防治方面具有一定的應用前景。
CGMCC No.9388
2014.06.27
【專利說明】一株彎曲乳桿菌及其應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株彎曲乳桿菌及其應用，屬于微生物領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 泌尿生殖道感染為婦女最為常見但又未受到重視的多發(fā)病，發(fā)病率僅次于呼吸 道感染，可高達40% ;女性泌尿生殖道感染是尿路感染和生殖道感染的總稱，它不僅直接影 響婦女的身心健康，而且也會影響眾多家庭的幸福和穩(wěn)定，進而影響全社會的人口質(zhì)量和 經(jīng)濟發(fā)展。女性尿路感染常見的病原是革蘭氏陰性桿菌，其中以大腸埃希菌最多見，葡萄 球菌次之；這些多數(shù)為人體腸道及皮膚黏膜上的正常菌群，由于機體免疫力下降，這些細 菌可由腸道及皮膚粘膜等寄居部位遷移至泌尿系統(tǒng)并大量繁殖引起尿路感染。女性常見的 生殖道感染病原包括滴蟲、霉菌和衣原體等，生殖道感染絕大多數(shù)先由陰道感染而起；因病 情遷延擴散可引起盆腔炎，并導致不孕癥。泌尿生殖道感染是"小疾病，大麻煩"，還可增加 艾滋病和淋病等性病的危險；患者生活質(zhì)量明顯下降，精神負擔很重。妊娠婦女可出現(xiàn)一系 列妊娠并發(fā)癥，如早產(chǎn)及絨毛膜羊膜炎等不良妊娠結(jié)局；分娩時由產(chǎn)道還可直接使新生兒 受同類病原體感染而致病。
[0003] 目前，泌尿生殖道感染的治療主要依靠各種抗生素，但治療效果不佳，治愈率在 40%以下，而且復發(fā)的比例很高，可達40%以上。原因主要是患者生殖道內(nèi)耐藥性病原菌的 存在致使抗生素失效；另外，抗生素治療即使可以殺死病原菌，但同時也殺死了有益菌（益 生菌），因此，難以恢復健康狀態(tài)下的泌尿生殖道優(yōu)勢菌群。
[0004] 健康育齡婦女泌尿生殖道內(nèi)存在著大量的細菌，總稱為泌尿生殖道菌群，其中包 括多種不同種類的細菌，可粗略分為"有益菌"和"致病菌"兩大類，其中乳酸桿菌是維持泌 尿生殖道健康最常見和最重要的有益菌（"正義菌"），大腸埃希菌、葡萄球菌、滴蟲、霉菌和 衣原體則為致病菌（"邪惡菌")。某些因素導致某一種致病菌異常增殖，引起泌尿生殖道感 染。陰道內(nèi)細菌種類的變化與婦女和胎兒的健康密切相關(guān)，其中的彎曲乳桿菌和詹氏乳酸 桿菌是維持陰道健康微生態(tài)環(huán)境的主要優(yōu)勢"正義菌"，可占健康泌尿生殖道菌群細菌總量 的90%以上。它們主要通過抑制外來的病原菌和其他條件致病菌（"邪惡菌"）的生長和 侵入來維持泌尿生殖道菌群的健康環(huán)境，"正義菌（有益菌）"戰(zhàn)勝"邪惡菌"的作用機制主 要包括以下幾方面：（1)通過分解陰道黏膜上皮中貯存的糖原產(chǎn)生乳酸、乙酸等酸性物質(zhì)， 維持陰道的酸性環(huán)境，以抑制病原菌的的生長；（2)產(chǎn)生過氧化氫和乳酸菌素等多種抑菌 物質(zhì)，用以殺死入侵的病原菌；（3)乳酸桿菌類有益菌通過在陰道黏膜上皮定植后，會形 成先入為主的占位保護作用，阻止病原微生物的入侵。
[0005] 育齡婦女隨年齡增長，陰道內(nèi)彎曲乳桿菌或詹氏乳酸桿菌數(shù)量會逐漸減少。絕經(jīng) 后，卵巢雌激素分泌逐漸停止，陰道上皮細胞糖原儲備缺乏，陰道pH上升，彎曲乳桿菌 或詹氏乳酸桿菌會進一步減少，致病菌因而增多。所以，彎曲乳桿菌或詹氏乳酸桿菌對老 年婦女的泌尿生殖健康也具有重要作用。
[0006] 微生態(tài)學理論認為，通過生態(tài)制劑調(diào)整療法，扶正和保護陰道內(nèi)的優(yōu)勢菌群的組 成和比例，可以驅(qū)除外來"邪惡的"致病菌的侵擾，提高婦女本身固有的"扶正祛邪"的自 我保護作用。乳桿菌是健康婦女陰道菌群的優(yōu)勢菌群，占陰道細菌總量90%以上，泌尿生殖 道感染患者陰道乳酸桿菌明顯減少，有的甚至完全檢測不到，因此，喪失了抵御外來病原菌 感染的能力。而通過補充缺失的乳桿菌，則有利于重建女性泌尿生殖道的優(yōu)勢菌群，恢復其 固有的"扶正祛邪"的保護作用。
[0007] 泌尿生殖道感染是婦女的常見病、多發(fā)病、易于復發(fā)，用抗生素雖有較好的短期 療效，但卻有40%的復發(fā)率。研究證明：有保護作用的優(yōu)勢菌株一彎曲乳桿菌或詹氏乳酸 桿菌的制劑將更容易在陰道內(nèi)定居和增殖，并產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，發(fā)揮持久的作用。因此，開 發(fā)適應我國婦女特點的特異性陰道乳桿菌制劑市場前景廣闊，改變以往在治療泌尿生殖道 感染上的純粹殺菌的用藥指導思想，避免由于大量應用抗生素作為治療所帶來的一系列不 良反應和弊端，有利于恢復女性泌尿生殖道的優(yōu)勢菌群并重建其微生態(tài)平衡；從而有效降 低泌尿生殖道感染的復發(fā)率，真正治愈女性泌尿生殖道感染。
[0008] 目前，國內(nèi)女性泌尿生殖道感染用益生菌菌劑只有一種，其主要成分是德氏乳桿 菌活菌。雖然它是從健康婦女陰道分離出來的一種乳桿菌，但不是我國婦女陰道菌群中的 主要有益菌，我國健康婦女陰道細菌以彎曲乳桿菌為主。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一株彎曲乳桿菌及其應用。
[0010] 本發(fā)明提供一株彎曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus)，其保藏編號為CGMCC No.9388 ；
[0011] 所述彎曲乳桿菌的菌落直徑大小約1-2毫米、不透明、突起的乳白色菌落，菌落邊 緣整齊、較濕潤，大小形態(tài)穩(wěn)定；革蘭染色陽性；處于對數(shù)生長期的所述彎曲乳桿菌經(jīng)鑒定 為無芽胞的桿菌，無鞭毛；兼性厭氧，生長最適溫度37-42°C，最適pH5. 8-6. 2,可發(fā)酵葡萄 糖、果糖、蔗糖、海藻糖、麥芽糖等多種糖。
[0012] 一種菌劑也屬于本發(fā)明的保護范圍，含有上述彎曲乳桿菌和/或上述彎曲乳桿菌 的發(fā)酵物。
[0013] 上述彎曲乳桿菌或上述菌劑在制備維持酸性環(huán)境的產(chǎn)品中的應用也屬于本發(fā)明 的保護范圍；
[0014] 所述酸性環(huán)境具體為泌尿生殖道的酸性環(huán)境，再具體為人的泌尿生殖道的酸性環(huán) 境；
[0015] 所述泌尿生殖道具體為陰道。
[0016] 上述彎曲乳桿菌或上述菌劑在制備抑制病原菌和/或條件致病菌的生長和/或繁 殖的產(chǎn)品中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍；
[0017] 所述病原菌和/或條件致病菌具體為泌尿生殖道的病原菌和/或條件致病菌，再 具體為人的泌尿生殖道的病原菌和/或條件致病菌；
[0018] 所述泌尿生殖道具體為陰道。
[0019] 上述彎曲乳桿菌或上述菌劑在制備對泌尿生殖道的上皮細胞具有粘附定植能力 的產(chǎn)品中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0020] 上述彎曲乳桿菌或上述菌劑在制備預防和/或治療泌尿生殖道感染的產(chǎn)品中的 應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0021] 上述彎曲乳桿菌或上述菌劑在制備預防和/或治療泌尿生殖道感染進而引發(fā)的 疾病的產(chǎn)品中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0022] 上述任一所述的應用中，所述泌尿生殖道為陰道。
[0023] 本發(fā)明提供的彎曲乳桿菌（Lactobacillus, crispatus) IMC-12,具有較強的產(chǎn)生 H202的能力，可有效抑制外來的病原菌和其他條件致病菌的生長，同時又具有較強的對陰道 上皮細胞的粘附作用，保證了菌株在陰道上皮的定植。彎曲乳桿菌頂C-12在泌尿生殖道感 染防治方面具有一定的應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1為彎曲乳桿菌MC-12菌落。
[0025] 圖2為彎曲乳桿菌MC-12與陰道上皮細胞的粘附作用。

【具體實施方式】
[0026] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0027] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0028] 健康婦女陰道分泌物樣品由瀚思維康健康管理機構(gòu)提供。
[0029] MRS液體培養(yǎng)基的制備：將蛋白胨10. 0g，牛肉膏10. 0g，酵母膏5. 0g，檸檬酸 氫二銨2. 0g，葡萄糖20. 0g，吐溫801.0mL，乙酸鈉（CH3C00Na · 3H20)5. 0g，磷酸氫二鉀 (Κ2ΗΡ04 · 3Η20)2· 0g，硫酸鎂（MgS04 · 7Η20)0· 58g，硫酸錳（MnS04 · Η20)0· 25g 溶于蒸餾水， 并用蒸饋水定容至l〇〇〇mL，調(diào)至pH至6· 2-6. 6。
[0030] 實施例1、彎曲乳桿菌菌株的分離和鑒定
[0031] 一、彎曲乳桿菌菌株的分離
[0032] 將收集的200余例臨床檢測無陰道炎癥狀體征的健康婦女陰道分泌物樣品依次 編號，并接種于MRS液體培養(yǎng)基，37°C厭氧培養(yǎng)24h。每個樣本隨機挑選5個單菌落于2mL MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)增菌24h，并對菌落依次編號。將分離到的數(shù)百株細菌分別進行菌種 鑒定、產(chǎn)過氧化氫及與陰道上皮細胞粘附作用的檢測，把其中一株具有較強粘附作用且產(chǎn) 過氧化氫的彎曲乳桿菌命名為頂C-12。
[0033] 二、彎曲乳桿菌菌株的鑒定
[0034] (一）形態(tài)學鑒定
[0035] 在MRS乳酸桿菌培養(yǎng)基平板上，上述步驟一分離得到的菌株MC-12表現(xiàn)為菌落 直徑大小約1-2毫米、不透明、突起的乳白色菌落，且菌落邊緣整齊、較濕潤，大小形態(tài)穩(wěn)定 (如圖1所示）。
[0036] 處于對數(shù)生長期的所述彎曲乳桿菌經(jīng)鑒定為：革蘭染色陽性，無芽胞的桿菌，無鞭 毛。
[0037] (二）生理生化特征分析
[0038] 菌株頂C-12兼性厭氧，生長最適溫度37-42°C，最適ρΗ5· 8-6. 2。根據(jù)API細菌鑒 定標準，利用API 50 CHL培養(yǎng)基和API 50 CH試劑條（購自bioMe' rieux，Inc.，Marcy Γ Etoile，F(xiàn)rance)對檢測菌株頂C-12進行糖發(fā)酵反應判讀檢測菌株頂C-12的生理生化 特征。API 50 CHL是由49種可發(fā)酵碳水化合物的API 50 CH試驗條組成的簡易培養(yǎng)基。 以檢測菌株IMC-12制成懸液接種試驗條的每一個小管。當培養(yǎng)時，由于發(fā)酵碳水化合物產(chǎn) 酸，pH下降，使指示劑變色。
[0039] 結(jié)果顯示，菌株MC-12可發(fā)酵葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、麥芽糖等多種糖。
[0040] (三）16s rDNA序列同源性分析
[0041] 提取菌株MC-12的總DNA作為模板，采用通用引物27f和1492r進行PCR擴增， 得到含有菌株MC-1216S rRNA基因保守區(qū)的片段。
[0042] 27f (上游引物）：5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，（SEQ ID No. 1);
[0043] 1492r (下游引物）：5' -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3' （SEQ ID No. 2)。
[0044] PCR體系（25 μ L) :PCR擴增緩沖液，終濃度為200 μ mol/L dNTPs，終濃度均為 0· 2 μ mol/L的上游及下游引物，1 U Taq DNA聚合酶，1 μ L模板DNA，余量為ddH20。
[0045] PCR 條件：94°C預變性 5min ;94°C變性 30s，55°C退火 40s，72°C延伸 30s，共 25 個 循環(huán)；72°C延伸lOmin。
[0046] PCR擴增得到的菌株頂C-12的16s rDNA的序列如SEQ ID No. 3所示。
[0047] 菌株IMC-12的分類命名為彎曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus)，該菌株已于 2014年6月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地 址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為 CGMCC No. 9388。
[0048] 實施例2、彎曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus) IMC-12的功能分析
[0049] 一、彎曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus) IMC-12 產(chǎn) H202 的檢測
[0050] ( -）H202標準曲線的制作：首先用濃度為100mmol/L的哌嗪-N，Ν' -二-乙磺酸 (Piperazine_N，N_-Bis 2-ethanesulfonic acid，PIPES)的水溶液將體積百分含量為 30% 的H202水溶液（相當于9. 128mol/L)儲存液稀釋成lmol/L，再用lOOmmol/LPIPES的水溶液 將上述 lmol/L 的 H202 分別稀釋成 20 μ mol/L、40 μ mol/L、60 μ mol/L、80 μ mol/L、100 μ mol/ L，將上述各稀釋液以及100mm〇l/L PIPES的水溶液記作H202工作液；然后分別取100μ L 上述H202工作液與100 μ L濃度為20mmol/L的TMB (四甲基聯(lián)苯胺）的水溶液、2 μ L濃度 為lmg/mL的辣根過氧化物酶（購自TaKaRa公司）混合，16°C孵育10min，測量0D63Q值。以 H202的濃度（單位：μ mol/L)為橫坐標，0D63(I為縱坐標，制作標準曲線，得到標準曲線公式 y = 0. 0033X-0. 0496, R2 = 0. 992。
[0051] (二）彎曲乳桿菌IMC-12液體培養(yǎng)H202濃度檢測：挑取彎曲乳桿菌IMC-12菌落， 將其接種于MRS液體培養(yǎng)基，在厭氧條件下進行培養(yǎng)48h，取lmL接種于10mL MRS液體培養(yǎng) 基中，使培養(yǎng)液中菌的濃度為l〇5cfu/ml，于厭氧環(huán)境下，37°C靜置培養(yǎng)21h后，轉(zhuǎn)換為37°C 振蕩培養(yǎng)3h，轉(zhuǎn)速為220r/min，旋轉(zhuǎn)半徑為2. 54cm。培養(yǎng)結(jié)束后，收集培養(yǎng)液，12000r/min 離心2min，得上清。取100 μ L上清與100 μ L濃度為20mmol/L的TMB (四甲基聯(lián)苯胺）的 水溶液、2 μ L濃度為lmg/mL的辣根過氧化物酶（購自TaKaRa公司）混合，16°C孵育10min， 測量(》63(|值，將其帶入步驟（一）得到的標準曲線公式，計算上清中的H 202濃度。實驗重 復三次，結(jié)果取平均值。
[0052] 結(jié)果如表1所示。
[0053] 表1彎曲乳桿菌頂C-12產(chǎn)生H202的能力檢測
[0054]

【權(quán)利要求】
1. 一株彎曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus)，其保藏編號為 CGMCC No. 9388。
2. -種菌劑，含有權(quán)利要求1所述的彎曲乳桿菌和/或權(quán)利要求1所述的彎曲乳桿菌 的發(fā)酵物。
3. 權(quán)利要求1所述的彎曲乳桿菌或權(quán)利要求2所述的菌劑在制備維持酸性環(huán)境的產(chǎn)品 中的應用。
4. 權(quán)利要求1所述的彎曲乳桿菌或權(quán)利要求2所述的菌劑在制備抑制病原菌和/或條 件致病菌的生長和/或繁殖的產(chǎn)品中的應用。
5. 權(quán)利要求1所述的彎曲乳桿菌或權(quán)利要求2所述的菌劑在制備對泌尿生殖道的上皮 細胞具有粘附定植能力的產(chǎn)品中的應用。
6. 權(quán)利要求1所述的彎曲乳桿菌或權(quán)利要求2所述的菌劑在制備預防和/或治療泌尿 生殖道感染的產(chǎn)品中的應用。
7. 權(quán)利要求1所述的彎曲乳桿菌或權(quán)利要求2所述的菌劑在制備預防和/或治療泌尿 生殖道感染進而引發(fā)的疾病的產(chǎn)品中的應用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5-7任一所述的應用，其特征在于：所述泌尿生殖道為陰道。
【文檔編號】A61P13/00GK104232537SQ201410446067
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月3日
【發(fā)明者】朱寶利, 張瑞芬, 李晶, 王江 申請人:中國科學院微生物研究所