一種水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗組合的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗組合。本發(fā)明組合為使用烷化劑作為病毒滅活劑的水貂病毒性腸炎滅活疫苗兼作組合中犬瘟熱活疫苗的稀釋液；組合中兩種疫苗具有特定的配比關(guān)系。該疫苗組合相比兩種疫苗傳統(tǒng)的應(yīng)用方法達(dá)到一針兩防(預(yù)防水貂病毒性腸炎和犬瘟熱)，降低了疫苗成本、減少了動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)、提高了免疫效果、減輕了飼養(yǎng)者的勞動(dòng)強(qiáng)度從而取得顯著的經(jīng)濟(jì)效益。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗組合

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種水貂病毒性腸炎滅活疫苗及犬瘟熱活疫苗組合。屬于獸用生物制 品領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 水紹病毒性腸炎是由水紹腸炎病毒（Mink Enteritis Virus, MEV)引起的一種急 性、烈性和高度接觸性傳染病，主要以劇烈腹瀉為主要特征，1949年由加拿大學(xué)者Sehofield 首次發(fā)現(xiàn)本?。⊿chofield F W. Virus enteritis in mink. Am Vet, 1949, 30:6512654·)。 1981年姜廷秀等（姜挺秀，樸厚坤，王喜龍等.疑似水貂病毒性腸炎初報(bào).毛皮動(dòng)物飼養(yǎng)， 1981，（2):224.)首先報(bào)道了我國(guó)發(fā)生水貂病毒性腸炎，此后該病逐漸蔓延全國(guó)，給我國(guó)養(yǎng) 貂業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失（高云，宋純林，吳玉林等水貂病毒性腸炎（MEV)流行病學(xué)調(diào)查及 防治.特產(chǎn)科學(xué)實(shí)驗(yàn)，1984,（4) 33234.)。
[0003] 犬癌熱是由犬癌熱病毒（Canine distemper virus, (DV)引起的犬科、融科和熊 科動(dòng)物的一種高度接觸性傳染病，病死率30 %?80 %。犬瘟熱病毒為副粘病毒科麻疹病毒 屬，呈圓形或不整形。直徑100?300nm，含有直徑為15?17nm的螺旋狀核衣殼，外覆一 層雙輪膜，膜上長(zhǎng)I. 3nm的纖突。發(fā)病率高，幾乎可以達(dá)到100%，且臨床癥狀多樣，容易繼 發(fā)其他細(xì)菌、病毒的混合感染和二次感染，死亡率高，素有"毀滅性傳染病"之稱(chēng)，對(duì)養(yǎng)犬業(yè)、 毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。自1809年Jeneer首次報(bào)道犬瘟熱，1905年Carre通過(guò)動(dòng) 物接種分離的濾過(guò)性致病因子復(fù)制出病例以來(lái)，各國(guó)學(xué)者已經(jīng)對(duì)犬瘟熱病毒的分離培養(yǎng)、 理化特性、流行病學(xué)以及免疫與防制作了大量的研究。近年來(lái)，其感染范圍不斷擴(kuò)大，危害 也越來(lái)越大，甚至已經(jīng)有人感染犬瘟熱病毒的病例。Mee等也從患Pagets疾病的病人組織 中檢測(cè)出犬瘟熱病毒核酸，這使得犬瘟熱有可能成為繼狂犬病之后犬傳播給人的第二種疫 病。在我國(guó)，隨著近幾年來(lái)軍犬、警犬、實(shí)驗(yàn)用犬和寵物犬飼養(yǎng)量的大幅度增加，以及異地交 流的不斷增多，犬瘟熱在我國(guó)犬中的發(fā)病率和致死率也均有升高的趨勢(shì)，而且臨床癥狀也 與以往的表現(xiàn)有所不同。
[0004] 水貂病毒性腸炎與犬瘟熱是毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖中發(fā)病率最高的兩種疾病，均需要免疫 預(yù)防，目前這兩種疾病均有單獨(dú)疫苗可以使用。但是由于毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖中，每次免疫均會(huì)對(duì) 動(dòng)物造成較大的應(yīng)激，因而尋找一種將兩種疫苗聯(lián)合使用的方法極為重要。由于傳統(tǒng)的水 貂病毒性腸炎滅活疫苗使用的是甲醛溶液滅活劑，如果與犬瘟熱活疫苗共同使用則會(huì)造成 犬瘟熱抗原的失效，無(wú)法實(shí)現(xiàn)聯(lián)合使用。
[0005] 燒化劑屬于細(xì)胞毒類(lèi)藥物，又稱(chēng)生物燒化劑（Bioalkylating Agengts)，在體內(nèi)能 形成碳正離子或其他具有活潑的親電性基團(tuán)的化合物，進(jìn)而與細(xì)胞中的生物大分子中含有 豐富電子的基團(tuán)發(fā)生共價(jià)結(jié)合，使其喪失活性或使DNA分子發(fā)生斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。其中 二乙烯亞胺（BEI)可以破壞病毒核酸，不改變病毒蛋白質(zhì)，而且不同病毒對(duì)BEI的抵抗力不 盡相同，同時(shí)BEI對(duì)核酸具有較高的誘變作用。本發(fā)明使用BEI溶液作為水貂病毒性腸炎 滅活疫苗生產(chǎn)過(guò)程中的滅活劑，使得水貂病毒性腸炎滅活疫苗滿(mǎn)足了作為犬瘟熱活疫苗稀 釋液進(jìn)行使用的可能，并通過(guò)各種創(chuàng)造性試驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)了水貂病毒性腸炎滅活疫苗與犬瘟熱 活疫苗的聯(lián)合應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗 組合，將水紹病毒性腸炎滅活疫苗作為犬癌熱活疫苗稀釋液，達(dá)到降低疫苗成本、減少動(dòng)物 應(yīng)激、提高經(jīng)濟(jì)效益的目的。
[0007] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案在于：
[0008] 1. -種水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗組合，是由水貂病毒性腸炎滅活 疫苗和犬瘟熱活疫苗組成，其中水貂病毒性腸炎滅活疫苗兼作犬瘟熱活疫苗的稀釋劑。
[0009] 2. -種水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗組合中水貂病毒性腸炎滅活疫 苗使用的滅活劑為烷化劑，優(yōu)選滅活終濃度為〇. 05%?0. 3%的BEI溶液。
[0010] 3. -種水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗組合中兩種疫苗具有每3毫升 水貂病毒性腸炎滅活疫苗稀釋1頭份犬瘟熱活疫苗的配比關(guān)系，其中水貂病毒性腸炎滅 活疫苗滅活前病毒含量為每暈升I. ox i〇7_°tcid5(i以上，犬癌熱活疫苗每頭份病毒含量為 104_ 5TCID5tl 以上。
[0011] 4. 一種水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗組合中水貂病毒性腸炎滅活疫 苗制備步驟包括：
[0012] (1)將F81細(xì)胞系或者CRFK細(xì)胞系進(jìn)行傳代和培養(yǎng)；
[0013] (2)將水貂病毒性腸炎病毒接種到長(zhǎng)滿(mǎn)80%的F81或者CRFK單層細(xì)胞的介質(zhì)上， 用維持液培養(yǎng)，制備生產(chǎn)用種毒；
[0014] (3)通過(guò)微載體平衡、細(xì)胞接種及消化轉(zhuǎn)移、細(xì)胞罐放大轉(zhuǎn)移使細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)大至 1000L的細(xì)胞罐。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到I. 5X 106cells/ml時(shí)，接種水貂腸炎病毒MEV-RCl株，得 到水貂病毒性腸炎病毒抗原液；
[0015] (4)將水貂病毒性腸炎病毒抗原液分別加入BEI溶液滅活，混合均勻，加入水溶性 佐劑，優(yōu)選滅菌的氫氧化鋁膠配苗，即得。
[0016] 5.組合中水貂病毒性腸炎滅活疫苗制備中使用水貂病毒性腸炎病毒（Mink Enteritis Virus，MEV)為MEV-RCl株該毒株已于2012年04月12日送交北京市朝陽(yáng)區(qū)北 辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物 中心保藏，編號(hào)為：CGMCC No. 4331。

【具體實(shí)施方式】
[0017] 一、水貂病毒性腸炎滅活疫苗
[0018] 1.水貂病毒性腸炎滅活疫苗的生產(chǎn)制備
[0019] (1)生產(chǎn)用毒種制備
[0020] 取生長(zhǎng)良好的F81細(xì)胞或者CRFK細(xì)胞按常規(guī)方法傳代，待細(xì)胞長(zhǎng)成80%單層后， 棄去生長(zhǎng)液，換以含0. 5%?1% MEV-RCl株毒種的維持液（含2%在56°C下滅活30分鐘 的新生牛血清的MEM) (MEM購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，新生牛血清購(gòu)自濟(jì)南勁牛生物科技有限公 司），置37°C繼續(xù)培養(yǎng)，待80%左右的細(xì)胞出現(xiàn)典型拉網(wǎng)式病變時(shí)收獲，凍融1次，定量分 裝，冷凍保存，注明收獲日期、毒種代次等。
[0021] (2)制苗用材料的選擇
[0022] 選擇生長(zhǎng)良好、符合現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》生產(chǎn)、檢驗(yàn)用細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)的或者CRFK細(xì)胞做 為制苗用材料，細(xì)胞代次為F6?F35代。
[0023] (3)制苗用毒液的繁殖
[0024] 1)生物反應(yīng)器清洗滅菌及微載體平衡
[0025] 將生物反應(yīng)器清洗干凈，121°C滅菌30分鐘。滅菌結(jié)束后，將滅菌好的微載體打入 細(xì)胞培養(yǎng)罐中，將平衡培養(yǎng)基MEM打入罐中至最小培養(yǎng)體積，平衡20?24小時(shí)。平衡載體 期間完成溶氧電極100%點(diǎn)的校正。
[0026] 2)細(xì)胞接種及消化轉(zhuǎn)移
[0027] 選擇生長(zhǎng)旺盛的轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞，用EDTA-胰蛋白酶分散液消化后，用含8%新生牛血 清的MEM和微載體（Cytodex I型微載體，購(gòu)自GE公司）懸浮制成細(xì)胞懸液，接種30L細(xì) 胞培養(yǎng)罐，接種密度5. 0?6. OX 105cells/ml，連續(xù)培養(yǎng)2?3天，細(xì)胞罐培養(yǎng)過(guò)程中當(dāng) 葡萄糖含量低于500mg/L，用含5 %新生牛血清的MEM培養(yǎng)基批次換液，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到 2. OX 106cells/ml以上后進(jìn)行消化轉(zhuǎn)移，即培養(yǎng)規(guī)模的放大。轉(zhuǎn)移前，將在細(xì)胞培養(yǎng)罐內(nèi) 連續(xù)培養(yǎng)2?3日的或者CRFK細(xì)胞取樣觀(guān)察并用0. 1 %結(jié)晶紫染色計(jì)數(shù)，細(xì)胞密度達(dá)到 2X106cells/ml時(shí)，按3?4倍放大到90L細(xì)胞罐。
[0028] 3)細(xì)胞罐放大轉(zhuǎn)移
[0029] 按照上述步驟逐級(jí)放大，將90L細(xì)胞罐依次放大轉(zhuǎn)移至350L、1000L細(xì)胞罐。
[0030] 4)接毒及收獲
[0031] 1000L細(xì)胞罐培養(yǎng)2?3日，細(xì)胞密度達(dá)到1.5X106cells/ml時(shí)，接種水貂腸炎 病毒MEV-RCl株，接毒時(shí)采用含1 %新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基，溫度37°C，接毒量為MOI = 〇. 1。接毒后定時(shí)取樣觀(guān)察細(xì)胞，待微載體表面80%細(xì)胞病變突起且有少量脫落時(shí)，連續(xù)高 速攪拌10?15分鐘，通過(guò)消化器濾除微載體收獲病毒液，取樣進(jìn)行病毒含量測(cè)定后，收獲 的病毒液標(biāo)明名稱(chēng)、收獲日期、批號(hào)，存放_(tái)15°C低溫冷庫(kù)，待檢備用。
[0032] (4)病毒液滅活
[0033] 向病毒液中加入2%的BEI溶液，使其終濃度為0. 2%，37°C滅活48小時(shí)，期間每 隔4?8小時(shí)混勻1次；滅活完全后，向病毒液中添加50%的硫代硫酸鈉溶液，使其終濃度 為0. 4%，加入后攪拌1小時(shí)。
[0034] (5)半成品檢驗(yàn)
[0035] 1)無(wú)菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。
[0036] 2)病毒含量每暈升病毒含量應(yīng)不低于107_°TCID5(i。
[0037] 3)滅活檢驗(yàn)將滅活病毒液和MEM按1 : 5的比例混合后接種已長(zhǎng)成80 %單層的 或者CRFK單層細(xì)胞4瓶（每瓶細(xì)胞瓶底面積為5cmX 7cm)，每瓶接種lml，置37°C下吸附 30分鐘后，換維持液（含2%在56°C下滅活30分鐘的新生牛血清的MEM)，繼續(xù)培養(yǎng)觀(guān)察4 日，應(yīng)無(wú)細(xì)胞病變；再盲傳1代，仍應(yīng)無(wú)細(xì)胞病變。取培養(yǎng)液作血凝試驗(yàn)，應(yīng)為陰性。
[0038] (6)配苗將滅活病毒液和滅菌的氫氧化鋁膠（附注3)按9 : 1的比例進(jìn)行配苗， 使疫苗中氫氧化鋁膠含量以氧化鋁表示不超過(guò)3. 9mg/ml，充分?jǐn)嚢琛?br> [0039] (7)分裝定量分裝。分裝時(shí)，應(yīng)隨時(shí)攪拌使其混合均勻。
[0040] 2.成品檢驗(yàn)
[0041] (1)性狀靜置后，上層為粉紅色液體，下層為淡粉紅色沉淀，振搖后呈均勻混懸液。
[0042] (2)無(wú)菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。
[0043] (3)裝量檢查按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合規(guī)定。
[0044] (4)安全檢驗(yàn)用2?10月齡健康易感水貂（MEV HI抗體效價(jià)不高于1:4)5只，各 皮下注射疫苗3ml，連續(xù)觀(guān)察10日，應(yīng)全部健活。
[0045] (5)效力檢驗(yàn)
[0046] 取2?10月齡健康易感水貂（MEV HI抗體效價(jià)不高于1:4)5只，各皮下注射疫苗 lml，同時(shí)設(shè)不接種對(duì)照水貂5只。免疫后14日，對(duì)所有水貂分別通過(guò)口服途徑攻擊水貂腸 炎病毒MEV-RCl株病毒液15ml (病毒含量為15 X 107_ tlTCID5tl)，觀(guān)察10日。對(duì)照水貂應(yīng)全部 發(fā)病（附注2)，免疫水貂應(yīng)全部健活。
[0047] (6)汞類(lèi)防腐劑殘留量測(cè)定分別按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)符合獸用 生物制品通則的規(guī)定。
[0048] 二、犬瘟熱活疫苗
[0049] 1、犬瘟熱活疫苗的生產(chǎn)制備
[0050] (1)生產(chǎn)用種毒的制備
[0051] 犬瘟熱病毒株⑶V-Il株接種轉(zhuǎn)瓶上的Vero細(xì)胞單層，接毒量為維持液量的2%， 當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)80%時(shí)即可收獲，再傳1代，制備生產(chǎn)用種毒。
[0052] (2)病毒液的繁殖
[0053] 用生產(chǎn)用種毒,接種到轉(zhuǎn)瓶上的Vero細(xì)胞單層,接毒量為細(xì)胞維持液的2%。然后 將轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞置37°C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為8?10r/h。
[0054] 接種后，每天觀(guān)察細(xì)胞病變情況，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)80%左右時(shí)即可收獲，凍融1次， 置一 15°C凍結(jié)保存，此為半成品。
[0055] (3)凍干
[0056] 經(jīng)過(guò)半成品合格檢驗(yàn)合格后，用常規(guī)凍干保護(hù)劑（《中國(guó)獸藥典》）與病毒液的體 積比按照1:1混合，分裝成2ml/瓶，按照設(shè)計(jì)好的凍干曲線(xiàn)進(jìn)行凍干，S卩：-65°C，維持2小 時(shí)使疫苗迅速凍結(jié)，然后抽真空，當(dāng)真空度達(dá)13. 3Pa時(shí)，開(kāi)始升溫干燥，升華階段產(chǎn)品溫度 為一 20?一 KTC，擱板溫度為8°C，升華時(shí)間為10個(gè)小時(shí)；解析溫度為30°C，2個(gè)小時(shí)。
[0057] 2、犬癌熱活疫苗的成品檢驗(yàn)
[0058] (1)無(wú)菌檢驗(yàn)應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。按《中國(guó)獸藥典》中的規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)。
[0059] (2)支原體檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》中的規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)支原體生長(zhǎng)。
[0060] (3)鑒別檢驗(yàn)將疫苗作KT2稀釋?zhuān)c等量KT1稀釋的犬瘟熱陽(yáng)性血清混合，經(jīng)37°C 中和30分鐘，接種Vero細(xì)胞4瓶，同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照組2瓶，置37°C培養(yǎng)，連續(xù)觀(guān)察CPE 96? 120小時(shí)。
[0061] (4)外源病毒檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》中的規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)外源病毒。
[0062] (5)安全檢驗(yàn)將每頭份疫苗用Iml生理鹽水溶化后，肌肉接種2?3月齡易感犬 (SN抗體效價(jià)彡1:4)5只，10頭份/只，觀(guān)察21日。
[0063] (6)效力檢驗(yàn)用含2%新生牛血清的MEM將疫苗溶化，使每Iml疫苗含1頭份，然 后作10倍遞進(jìn)稀釋?zhuān)?〇_2、1〇_ 3、1〇_4、1〇_54個(gè)稀釋度，分別接種已長(zhǎng)成單層的Vero細(xì)胞96 孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度接種8個(gè)孔，每孔100 μ 1，同時(shí)設(shè)不接毒對(duì)照，置37°C、5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀(guān)察96?120小時(shí)，記錄細(xì)胞病變（CPE)孔數(shù)，按Reed-Muench法 計(jì)算 TCID5tl，應(yīng)達(dá)到 104·5TCID5qij
[0064] (7)剩余水分測(cè)定每批凍干制品任抽4個(gè)樣品，各樣品剩余水分均不應(yīng)超過(guò)4%。 如果有超過(guò)時(shí)，可重檢1次，重檢后如有1個(gè)樣品超過(guò)規(guī)定，該批制品應(yīng)判為不合格（《中國(guó) 獸藥典》）。
[0065] (8)真空度測(cè)定包裝前測(cè)定真空度，無(wú)真空的制品，應(yīng)予剔除報(bào)廢，不得重抽空出 售（《中國(guó)獸藥典》）。
[0066] 三、組合方法
[0067] 按照3毫升水貂病毒性腸炎滅活疫苗稀釋1頭份犬瘟熱活疫苗（本發(fā)明人自行生 產(chǎn)，生產(chǎn)批準(zhǔn)文號(hào)：獸藥生字（2010) 150256017)的比例，將水貂病毒性腸炎滅活疫苗做為 犬瘟熱活疫苗的稀釋液，配比后進(jìn)行使用。
[0068] 其中，水貂病毒性腸炎滅活疫苗滅活前病毒含量為每毫升I. OX 107_ciTCID5ciAil以 上；犬瘟熱活疫苗病毒含量為IO4 5TCID5tl/頭份以上。
[0069] 本發(fā)明涉及的微生物菌種
[0070] 本發(fā)明涉及到的水紹病毒性腸炎病毒（Mink Enteritis Virus，MEV)MEV_RCl株已 于2012年04月12日送交北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中 國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，編號(hào)為：CGMCC No. 4331 ;
[0071] 本發(fā)明涉及到的犬癌熱病毒（Canine distemper virus,Q)V)OW-Il株已于2009 年07月15日送交北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生 物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，編號(hào)為：CGMCC No. 3201。
[0072] 本發(fā)明的積極意義
[0073] 本發(fā)明提供一種水貂病毒性腸炎滅活疫苗及犬瘟熱活疫苗組合。本發(fā)明利用BEI 滅活后可以用硫代硫酸鈉中和的特點(diǎn)，使用BEI滅活劑滅活水貂病毒性腸炎滅活疫苗，并 按一定比例稀釋犬癌熱活疫苗進(jìn)行組合，達(dá)到了降低疫苗成本、減少動(dòng)物應(yīng)激、提高經(jīng)濟(jì)效 益、減輕了飼養(yǎng)者的勞動(dòng)強(qiáng)度的目的。該發(fā)明有以下優(yōu)點(diǎn) ：
[0074] 1.犬瘟熱活疫苗的目前應(yīng)用中，往往是凍干產(chǎn)品，需要單獨(dú)配制適用的疫苗稀釋 液；水貂病毒性腸炎滅活疫苗的目前應(yīng)用中，往往是甲醛滅活的液體疫苗，也只能是單獨(dú)使 用。
[0075] 而本發(fā)明中，兩種疫苗產(chǎn)品的應(yīng)用采用BEI滅活的水貂病毒性腸炎滅活疫苗稀釋 犬瘟熱活疫苗的方法，直接省去了犬瘟熱活疫苗的疫苗稀釋液，降低了疫苗成本。
[0076] 2.與傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝相比，水貂病毒性腸炎滅活疫苗滅活劑由甲醛溶液改為BEI溶 液，BEI作用于病毒核酸，不破壞病毒的抗原蛋白，不影響病毒免疫原性。由于米用BEI對(duì) 病毒也進(jìn)行滅活后，可以使用硫代硫酸鈉將BEI滅活劑中和，因此滅活病毒后無(wú)殘留，相比 甲醛溶液滅活，對(duì)動(dòng)物應(yīng)激小、安全性好。
[0077] 3.本發(fā)明利用了使用BEI滅活劑滅活病毒后無(wú)殘留的特點(diǎn)，使得滅活疫苗與活疫 苗的組合后共同使用成為了可能，且疫苗組合免疫效果優(yōu)于原兩種單苗分別免疫的效果。
[0078] 4.本發(fā)明兩種疫苗產(chǎn)品的組合，能夠?qū)⒁酝鶅煞N疫苗產(chǎn)品單獨(dú)應(yīng)用時(shí)飼養(yǎng)者需要 一次捕抓動(dòng)物注射兩針降低為注射1針，減輕了疫苗免疫的勞動(dòng)強(qiáng)度。
[0079] 實(shí)施例
[0080] 以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
[0081] 實(shí)施例1
[0082] --生產(chǎn)用毒種制備
[0083] 1、毒種繁殖取生長(zhǎng)良好的F81細(xì)胞或者CRFK細(xì)胞按常規(guī)方法傳代，待細(xì)胞長(zhǎng)成 80%單層后，棄去生長(zhǎng)液，換以含1 %毒種的維持液（含2%在56°C下滅活30分鐘的新生牛 血清的MEM)，置37°C繼續(xù)培養(yǎng)，待80%左右的細(xì)胞出現(xiàn)典型拉網(wǎng)式病變時(shí)收獲，凍融1次， 定量分裝，冷凍保存，注明收獲日期、毒種代次等。
[0084] 2、毒種鑒定符合以上標(biāo)準(zhǔn)的毒種作為生產(chǎn)用毒種。
[0085] 3、毒種繼代不超過(guò)3代。
[0086] 4、毒種保存-15°C以下保存，有效期為24個(gè)月。
[0087] 實(shí)施例2
[0088] --水貂病毒性腸炎滅活疫苗的制造
[0089] 1、制苗用材料的選擇
[0090] 選擇生長(zhǎng)良好、符合現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》生產(chǎn)、檢驗(yàn)用細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)的F81細(xì)胞或者 CRFK細(xì)胞做為制苗用材料，細(xì)胞代次為F6?F35代。
[0091] 2、制苗用毒液的繁殖
[0092] (1)生物反應(yīng)器清洗滅菌及微載體平衡將生物反應(yīng)器清洗干凈，121°C滅菌30分 鐘。滅菌結(jié)束后，將滅菌好的微載體打入細(xì)胞培養(yǎng)罐中，將平衡培養(yǎng)基MEM打入罐中至最小 培養(yǎng)體積，平衡24小時(shí)。平衡載體期間完成溶氧電極100%點(diǎn)的校正。
[0093] (2)細(xì)胞接種及消化轉(zhuǎn)移選擇生長(zhǎng)旺盛的轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞，用EDTA-胰蛋白酶分散液 消化后，用含8%新生牛血清的MEM懸浮制成細(xì)胞懸液，接種30L細(xì)胞培養(yǎng)罐，接種密度 5. OX 105cells/ml，連續(xù)培養(yǎng)3天，細(xì)胞罐培養(yǎng)過(guò)程中當(dāng)葡萄糖含量低于500mg/L，用含5% 新生牛血清的MEM培養(yǎng)基批次換液，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到2. OX 106cells/ml以上后進(jìn)行消化轉(zhuǎn) 移，即培養(yǎng)規(guī)模的放大。轉(zhuǎn)移前，將在細(xì)胞培養(yǎng)罐內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)，或者CRFK細(xì)胞取樣觀(guān)察并用 〇. 1%結(jié)晶紫染色計(jì)數(shù)，細(xì)胞密度達(dá)到2X 106cells/ml時(shí)，按3倍放大到90L細(xì)胞罐。
[0094] (3)細(xì)胞罐放大轉(zhuǎn)移按照上述步驟逐級(jí)放大，將90L細(xì)胞罐依次放大轉(zhuǎn)移至350L、 1000L細(xì)胞罐。
[0095] (4)接毒及收獲1000L細(xì)胞罐培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到I. 5X 106cells/ml時(shí)，接種水 貂腸炎病毒MEV-RCl株，接毒時(shí)采用含1 %新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基，溫度37°C，接毒量為 MOI = 0. 1。接毒后定時(shí)取樣觀(guān)察細(xì)胞，待微載體表面80%細(xì)胞病變突起且有少量脫落時(shí)， 連續(xù)高速攪拌15分鐘，通過(guò)消化器濾除微載體收獲病毒液，取樣進(jìn)行病毒含量測(cè)定后，收 獲的病毒液標(biāo)明名稱(chēng)、收獲日期、批號(hào)，存放_(tái)15°C低溫冷庫(kù)，待檢備用。
[0096] 3、滅活向病毒液中加入2%的BEI溶液，使其終濃度為0. 2%，37°C滅活48小時(shí)， 期間每隔4?8小時(shí)混勻1次；滅活完全后，向病毒液中添加50%的硫代硫酸鈉溶液，使其 終濃度為〇. 4%，加入后攪拌1小時(shí)。
[0097] 4、配苗將滅活病毒液和滅菌的氫氧化鋁膠（附注3)按9 : 1(V/V)比例進(jìn)行配苗， 使疫苗中氫氧化鋁膠含量以氧化鋁表示不超過(guò)3. 9mg/ml，充分?jǐn)嚢琛?br> [0098] 5、分裝、貼簽、入庫(kù)保存。
[0099] 實(shí)施例3
[0100] -水貂病毒性腸炎滅活疫苗的成品檢驗(yàn)
[0101] (1)性狀靜置后，上層為粉紅色液體，下層為淡粉紅色沉淀，振搖后呈均勻混懸液。
[0102] (2)無(wú)菌檢驗(yàn)無(wú)菌生長(zhǎng)。
[0103] (3)裝量檢查按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，均符合規(guī)定。
[0104] (4)安全檢驗(yàn)用5月齡健康易感水貂（MEV HI抗體效價(jià)不高于1 : 4)5只，各皮下 注射疫苗3ml，連續(xù)觀(guān)察10日，均未出現(xiàn)異常，全部健活。
[0105] (5)效力檢驗(yàn)
[0106] 取5月齡健康易感水貂（MEV HI抗體效價(jià)不高于1 : 4) 5只，各皮下注射疫苗lml， 同時(shí)設(shè)不接種對(duì)照水貂5只。免疫后14日，對(duì)所有水貂分別通過(guò)口服途徑攻擊水貂腸炎病 毒MEV-RCl株病毒液15ml (病毒含量為15 X 107_ tlTCID5tl)，觀(guān)察10日。對(duì)照水貂全部發(fā)病， 免疫水貂全部健活。
[0107] (6)汞類(lèi)防腐劑殘留量測(cè)定分別按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果為： 未檢出。
[0108] 實(shí)施例4
[0109] --犬瘟熱活疫苗的制備
[0110] 1、生產(chǎn)用種毒的制備
[0111] 犬瘟熱病毒株⑶V-Il株接種轉(zhuǎn)瓶上的Vero細(xì)胞單層，接毒量為維持液量的2%， 當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)80%時(shí)即可收獲，再傳1代，制備生產(chǎn)用種毒。
[0112] 2、病毒液的繁殖
[0113] 用生產(chǎn)用種毒,接種到轉(zhuǎn)瓶上的Vero細(xì)胞單層,接毒量為細(xì)胞維持液的2%。然后 將轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞置37°C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為10r/h。
[0114] 接種后，每天觀(guān)察細(xì)胞病變情況，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)80%左右時(shí)即可收獲，凍融1次， 置-15°C凍結(jié)保存，此為半成品。
[0115] 3、凍干
[0116] 經(jīng)過(guò)半成品合格檢驗(yàn)合格后，用常規(guī)凍干保護(hù)劑（《中國(guó)獸藥典》）與病毒液的體 積比按照1:1混合，分裝成2ml/瓶，按照設(shè)計(jì)好的凍干曲線(xiàn)進(jìn)行凍干，S卩：-65°C，維持2小 時(shí)使疫苗迅速凍結(jié)，然后抽真空，當(dāng)真空度達(dá)13. 3Pa時(shí)，開(kāi)始升溫干燥，升華階段產(chǎn)品溫度 為-20?-KTC，擱板溫度為8°C，升華時(shí)間為10個(gè)小時(shí)；解析溫度為30°C，2個(gè)小時(shí)。
[0117] 實(shí)施例5
[0118] --犬瘟熱活疫苗的成品檢驗(yàn)
[0119] (1)無(wú)菌檢驗(yàn)無(wú)菌生長(zhǎng)。
[0120] (2)支原體檢驗(yàn)無(wú)支原體生長(zhǎng)。
[0121] (3)鑒別檢驗(yàn)將疫苗作KT2稀釋?zhuān)c等量KT1稀釋的犬瘟熱陽(yáng)性血清混合，經(jīng)37°C 中和30分鐘，接種Vero細(xì)胞4瓶，同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照組2瓶，置37°C培養(yǎng)，連續(xù)觀(guān)察CPE 96? 120小時(shí)。中和組和細(xì)胞對(duì)照組均未出現(xiàn)CPE，不中和對(duì)照組全部出現(xiàn)CPE。
[0122] (4)外源病毒檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》中的規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，均無(wú)外源病毒。
[0123] (5)安全檢驗(yàn)將每頭份疫苗用Iml生理鹽水溶化后，肌肉接種3月齡易感犬（SN抗 體效價(jià)彡1:4) 5只，10頭份/只，觀(guān)察21日，5只接種易感犬均未出現(xiàn)異常反應(yīng)。
[0124] (6)效力檢驗(yàn)每頭份疫苗病毒含量為105 57TCID50。
[0125] (7)剩余水分測(cè)定4個(gè)樣品結(jié)果為：1. 84%、1. 81%、1. 73%、1. 80%。
[0126] 實(shí)施例6
[0127] --水貂病毒性腸炎滅活疫苗加倍劑量安全性比較試驗(yàn)
[0128] 取2月齡水貂30只，隨機(jī)分為3組。第1組后腿部肌肉注射一針本發(fā)明疫苗組合 3ml (10頭份犬瘟熱活疫苗用3ml水貂病毒性腸炎滅活疫苗稀釋?zhuān)?，?組左右后腿內(nèi)側(cè)肌 肉分別免疫犬瘟熱活疫苗10頭份和水貂病毒性腸炎滅活疫苗3ml作為疫苗對(duì)照，第3組不 免疫作為空白對(duì)照。分別隔離飼養(yǎng)，觀(guān)察10日，觀(guān)察水貂精神、飲食變化。并在14日時(shí)將 所有水貂剖殺作病理學(xué)檢查。
[0129] 結(jié)果一針兩防免疫組接種水貂精神、飲食均正常；體溫?zé)o明顯變化，均在正常 38. 5°C?39. 4°C范圍內(nèi)，與對(duì)照水貂各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)明顯差別；接種部位沒(méi)有出現(xiàn)腫脹、壞死， 無(wú)全身不良反應(yīng)；免疫后14日將所有水貂剖殺，免疫組接種部位均未出現(xiàn)腫塊和潰瘍等不 良反應(yīng)。
[0130] 實(shí)施例7
[0131] --疫苗組合與各自單苗對(duì)水貂免疫效力比較試驗(yàn)
[0132] 取2月齡水貂30只，隨機(jī)分為3組。第1組（疫苗組合免疫組）腿部肌肉注射一 針兩防疫苗Iml (1頭份犬瘟熱活疫苗用3ml水貂病毒性腸炎滅活疫苗稀釋?zhuān)?組（免疫 對(duì)照組）兩側(cè)腿部肌肉分別免疫2種疫苗（福爾馬林滅活的水貂腸炎滅活疫苗Iml、犬瘟熱 活疫苗0. 33頭份/lml)，第3組不免疫作為空白對(duì)照。免疫后21天，采血，分別測(cè)定犬瘟 熱、水貂病毒性腸炎病毒抗體效價(jià)。
[0133] 結(jié)果顯示一針兩防免疫方式抗MEV HI值與⑶VSN抗體值均達(dá)到保護(hù)要求，且均高 于兩種疫苗分別注射免疫方式。具體結(jié)果見(jiàn)表1。
[0134] 表1疫苗組合與各自單苗對(duì)水貂免疫效力比較試驗(yàn)結(jié)果
[0135]

【權(quán)利要求】
1. 一種水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗組合，其特征在于該組合是由水貂病 毒性腸炎滅活疫苗和犬瘟熱活疫苗組成，其中水貂病毒性腸炎滅活疫苗兼作犬瘟熱活疫苗 的稀釋劑。
2. 權(quán)利要求1所述的一種水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗組合，其特征在于 組合中水貂病毒性腸炎滅活疫苗使用的滅活劑為烷化劑。
3. 權(quán)利要求1所述的一種水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗組合，其特征在于 組合中兩種疫苗具有每3毫升水貂病毒性腸炎滅活疫苗稀釋1頭份犬瘟熱活疫苗的配比關(guān) 系，其中水貂病毒性腸炎滅活疫苗滅活前病毒含量為每毫升l.〇Xl〇 7_°TCID5(l以上、犬瘟熱 活疫苗每頭份病毒含量為l〇4 5TCID5(l以上。
4. 如權(quán)利要求1、2所述的一種水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗組合，其特征 在于該組合中水貂病毒性腸炎滅活疫苗制備步驟包括： (1) 將F81細(xì)胞系或者CRFK細(xì)胞進(jìn)行傳代和培養(yǎng)； (2) 將水貂病毒性腸炎病毒接種到長(zhǎng)滿(mǎn)70%?90% F81或者CRFK單層細(xì)胞的介質(zhì)上， 用維持液培養(yǎng)，制備生產(chǎn)用種毒； (3) 通過(guò)微載體平衡、細(xì)胞接種及消化轉(zhuǎn)移、細(xì)胞罐放大轉(zhuǎn)移使細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng) 細(xì)胞密度達(dá)到1.5X106cells/ml以上時(shí)，接種水貂腸炎病毒，得到水貂病毒性腸炎病毒抗 原液； (4) 將水貂病毒性腸炎病毒抗原液滅活后加入水溶性佐劑即得。
5. 權(quán)利要求2所述的水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗組合，其特征在于所述 烷化劑為滅活終濃度為0. 05 %?0. 3 %的BEI溶液。
6. 權(quán)利要求4所述的水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗組合，其特征在于是其 中的水貂病毒性腸炎病毒為水貂病毒性腸炎病毒（Mink Enteritis Virus，MEV)MEV-RC1 株，保藏號(hào)為CGMCC No. 4331。
【文檔編號(hào)】A61K39/175GK104258386SQ201410462321
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】禚寶山, 宋曉飛, 李營(yíng), 秦緒偉, 田真, 王景偉, 王蕾, 鮑海忠 申請(qǐng)人:齊魯動(dòng)物保健品有限公司