抑制ALCAM基因表達(dá)的siRNA序列及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥領(lǐng)域，公開了一種高效抑制ALCAM基因表達(dá)的siRNA序列及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。應(yīng)用ALCAM siRNA可以更高效、特異、方便的抑制靶基因的表達(dá)，本發(fā)明篩選出能高效抑制ALCAM基因表達(dá)的siRNA序列，并作用于腫瘤細(xì)胞，檢測微量ALCAM siRNA抑制ALCAM表達(dá)后腫瘤細(xì)胞在增殖、細(xì)胞周期及凋亡方面的變化，為ALCAM siRNA應(yīng)用于惡性腫瘤的臨床治療奠定重要基礎(chǔ)。
【專利說明】抑制ALCAM基因表達(dá)的siRNA序列及其應(yīng)用
所屬【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種小分子干擾核糖核酸(siRNA)，具體為涉及一種抑制ALCAM基因表達(dá)的siRNA及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]癌癥對人類健康造成了巨大的威脅，全世界每年約700萬人死于癌癥，我國每年癌癥死亡約130萬人，在各類死因中高居第二位。攻克癌癥、減輕病人痛苦一直是一個難題。腫瘤的發(fā)生、演進(jìn)、侵襲和轉(zhuǎn)移是一個多基因參與的漸進(jìn)和積累的過程，涉及眾多基因調(diào)控、表達(dá)、突變等變化。利用分子生物學(xué)技術(shù)治療癌癥的病理根源是為臨床提供有效診治手段的有效途徑。
[0003]siRNA由于強(qiáng)力有的特異性RNA干擾作用，現(xiàn)已成為一種理想的細(xì)胞水平敲除手段。siRNA的出現(xiàn)在哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生特異的基因表達(dá)抑制，使得siRNA為人類疾病的治療開創(chuàng)了新的天地。自2001年RNA干擾現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)以來，RNA干擾技術(shù)的研究、開發(fā)和應(yīng)用得到了迅速發(fā)展，2006發(fā)明此技術(shù)的兩位美國科學(xué)家Andrew Fire和Craig Mello因此獲得了諾貝爾獎。與常規(guī)的反義核苷酸技術(shù)相比，siRNA抑制基因的表達(dá)不但高效特異，而且效應(yīng)持久、操作簡便。人類的許多疾病如腫瘤、傳染性疾病等與人體的某些基因大量表達(dá)或外來的病毒、細(xì)菌基因的表達(dá)有密切的因果關(guān)系，因此，可以通過向腫瘤細(xì)胞或感染細(xì)胞中引入siRNA特異性沉默與疾病發(fā)生相關(guān)的基因，從而達(dá)到治療疾病的目的。美國SirnaTherapeutics, Inc公司獲得了血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的siRNA專利，這種siRNA能壓抑VEGF基因表達(dá)，而VEGF基因會刺激老年性黃斑變性患者視網(wǎng)膜上血管的生長分子，將VEGF的siRNA直接注射到眼部，用以治療年齡相關(guān)的黃斑退化癥(UK Patent N0.GB2406569,United StatesPatent7022828)。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，美國的 Alnylam Pharmaceuticals,SirnaTherapeutics, Acuity Pharmaceuticals, Bentitec 等生物藥物公司已研制治療呼吸道疾病、肌肉萎縮、艾滋病、肝炎、腦神經(jīng)退化等多種疾病的siRNA類藥物，目前已有多個進(jìn)入臨床前或臨床試驗(yàn)。因此，siRNA在治療和預(yù)防腫瘤發(fā)生中機(jī)制研究中顯示了光明前景。
[0004]ALCAM(活化白細(xì)胞粘附分子，Gene ID:214，Locat1n:3ql3.1)基因是近年來發(fā)現(xiàn)的新基因，它與多種腫瘤的惡性程度相關(guān)，有望成為腫瘤檢測的新標(biāo)志物和腫瘤治療的新靶點(diǎn)。本發(fā)明人發(fā)明出一種抑制ALACM基因表達(dá)的siRNA序列，并試驗(yàn)證明其有效性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的第一個目的是提供一種特異性抑制ALCAM基因表達(dá)的siRNA。
[0006]本發(fā)明提供的抑制ALCAM基因表達(dá)的siRNA，包含siRNAl、siRNA2及siRNA3，所述siRNAl、siRNA2及siRNA3的堿基序列如下:
[0007]siRNAl:正義鏈 5’ -GCTAGTGACCGAGGACAAT-3’
[0008]反義鏈5，-ATTGTCCTCGGTCACTAGC-3，
[0009]siRNA2:正義鏈 5’ -GCATTTCAAGAGACAGTTA-3，
[0010]反義鏈 5，-TAACTGTCTCTTGAAATGC-3，
[0011 ] siRNA3:正義鏈 5 ’ -CCATCACAGTTCACTACTT-3 ’
[0012]反義鏈5，-AAGTAGTGAACTGTGATGG-3 ’
[0013]抑制ALCAM基因表達(dá)的siRNA通過人工合成，可通過載體表達(dá)。
[0014]所述的抑制ALCAM基因表達(dá)的siRNA及其表達(dá)載體在腫瘤生物治療中的應(yīng)用，如腫瘤靶向基因治療。
[0015]本發(fā)明提供的siRNA可以特異性抑制ALCAM基因的表達(dá)。rt_RCR實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明的s1-RNA可以特異性的抑制ALCAM基因的轉(zhuǎn)錄。免疫組化實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明的s1-RNA可以特異性的抑制ALCAM基因在細(xì)胞膜的表達(dá)。裸鼠腫瘤模型表明siRNA可抑制肝癌細(xì)胞的增殖、并能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡。重要的是實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明設(shè)計(jì)的siRNA對正常組織及生理活動沒有殺傷及影響作用，卻能有效抑制ALCAM基因高表達(dá)的肝癌細(xì)胞，為預(yù)防和治療肝癌及其他腫瘤提供了一個有效途徑和重要可能。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是本發(fā)明的s1-RNA干擾抑制人肝癌細(xì)胞0fepG2細(xì)胞)Alcam基因后RT-PCR檢測結(jié)果圖。
[0017]圖2是本發(fā)明的s1-RNA干擾抑制人肝癌細(xì)胞Alcam基因后，免疫組織化學(xué)檢測Al cam蛋白表達(dá)水平變化圖。
[0018]圖3是本發(fā)明的s1-RNA干擾抑制人肝癌細(xì)胞并移植于裸鼠體內(nèi)，肝癌腫塊生長情況圖。

【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步地詳細(xì)說明。
[0020]實(shí)施例1:根據(jù)生物信息學(xué)方法在genebank獲取ALCAM的mRNA序列，采用RNAstrcture分析軟件對ALCAM mRNA序列的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測,根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則,綜合分析其GC含量、兩端自由能大小、mRNA作用位點(diǎn)的二級結(jié)構(gòu)、siRNA對堿基偏愛性等要求。采用NCBI GenBank(美國國立醫(yī)學(xué)圖書館和美國國立衛(wèi)生研究院編寫)提供的BLAST軟件，對選擇的靶序列進(jìn)行同源分析，排除siRNA非特異性地抑制其他基因片段的可能。通過AdEasy將本發(fā)明的s1-RNA重組于含有紅色熒光蛋白基因的腺病毒。
[0021]實(shí)施例2:本發(fā)明的s1-RNA干擾人肝癌細(xì)胞0fepG2細(xì)胞)后RT-PCR檢測其ALCAMmRNA表達(dá)。取人肝癌細(xì)胞，細(xì)胞處理及轉(zhuǎn)染方法如上述，本發(fā)明的ALCAM siRNAl、siRNA2、siRNA3濃度均為50nmol/L。轉(zhuǎn)染48h后，TRIZOL(Invitrogen)法常規(guī)提取細(xì)胞總RNA，ReverTra Dash TMRT-PCR 試劑盒(Toyobo C0.Japan code n0.PCR400 美津生物公司)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR條件設(shè)置為94°C預(yù)變性5min后，94°C持續(xù)30s，56°C持續(xù)30s，72°C持續(xù)lmin,共30個循環(huán),72°C后延伸5min。ALCAM擴(kuò)增引物序列為:P15，agg aca gcc tga aggcat aa3，;P25，ccc cac ttg ggt tta agg at3’，同時擴(kuò)增 GAPDH 作為內(nèi)參，引物序列為PH，aac age ctc aag ate ate age 3，，P2，5，gga tga tgt tot gga gag cc 3，，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后拍照(圖2)，s7-9代表RNA干擾抑制Alcam基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明的s1-RNA干擾Alcam基因序列能有效抑制Alcam基因的表達(dá)。
[0022]實(shí)施例3:免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測本發(fā)明的s1-RNA干擾人肝癌細(xì)胞后其ALCAM蛋白表達(dá)。將經(jīng)過處理的蓋玻片置入24孔板，每孔加入lmL5X 104/mL濃度的人肝癌細(xì)胞，24h后按上述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48h取出玻片，中性緩沖福爾馬林固定，0.3%的Triton-X-1OO透膜處理，3%甲醇雙氧水(A液)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉后加入鼠抗人PCNA單克隆抗體，37°C孵育2h后，依次加入生物素標(biāo)記的二抗，鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物的三抗，DAB(二氨基聯(lián)苯胺)顯色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。如圖2所示，A:正常對照IfepG2胞，ALCAM陽性表達(dá)于細(xì)胞膜(褐色)；B:50nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染后48h HepG2細(xì)胞膜ALCAM表達(dá)明顯降低。
[0023]實(shí)施例4:本發(fā)明的s1-RNA干擾抑制人肝癌細(xì)胞并移植于裸鼠體內(nèi)，觀察肝癌腫塊生長情況。人肝癌細(xì)胞在37°C，含50mL.L-1C02
[0024]孵箱內(nèi)培養(yǎng)，于含10mL.L-1小牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)液中貼壁生長，以2.5g-L-1胰酶消化液消化傳代培養(yǎng)。按上述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞。6只4周齡的BALB/cnu/nu裸鼠(雌性)，隨機(jī)分為兩組，第一組每只予以未經(jīng)s1-RNA干擾的0.1mL肝癌細(xì)胞懸液注入裸鼠右大腿背側(cè)皮下；第二組每只予以經(jīng)本發(fā)明的s1-RNA干擾的0.1mL肝癌細(xì)胞懸液注入裸鼠右大腿背側(cè)皮下。22d處死裸鼠后取出瘤體用精密卡尺測量瘤體橫徑和長徑，第一組瘤體平均直徑(腫瘤長徑和橫徑之和的均值)為1.83cm，第二組瘤體平均直徑為1.12。
[0025]綜上所述，本發(fā)明篩選出的ALCAM siRNAl、siRNA2、siRNA3能夠通過高效抑制細(xì)胞內(nèi)ALCAM基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，可阻斷腫瘤細(xì)胞的增殖途徑而顯著抑制細(xì)胞增殖，明顯阻滯細(xì)胞周期，并高效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，為ALCAMiRNA應(yīng)用于惡性腫瘤的基因治療奠定了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。同時，篩選出的ALCAM siRNA序列能高效沉默細(xì)胞內(nèi)ALCAM基因的表達(dá)，為ALCAM基因功能的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。
【權(quán)利要求】
1.一種抑制人ALCAM基因表達(dá)的SiRNA序列，包括下述序列中的任一條或一條以上。本發(fā)明提供的抑制ALCAM基因表達(dá)的siRNA，包含siRNAl、siRNA2及siRNA3，所述siRNAl、siRNA2及siRNA3的喊基序列如下:
siRNAl:正義鏈 5’ -GCTAGTGACCGAGGACAAT-3’
反義鏈 5’ -ATTGTCCTCGGTCACTAGC-3’
siRNA2:正義鏈 5’ -GCATTTCAAGAGACAGTTA-3’
反義鏈 5’ -TAACTGTCTCTTGAAATGC-3’
siRNA3:正義鏈 5’ -CCATCACAGTTCACTACTT-3’ 反義鏈 5’ -AAGTAGTGAACTGTGATGG-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抑制人ALCAM基因表達(dá)的siRNA序列，其特征在于，所述正義鏈和反義鏈均包含黏性末端。
3.權(quán)利要求1或2所述的任一條或一條以上的siRNA序列在制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K48/00GK104328120SQ201410466533
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年9月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月15日
【發(fā)明者】張秉強(qiáng), 鐘立, 茍菊花, 鄧念, 申昊 申請人:重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院