一種間充質(zhì)干細(xì)胞體外向黑素細(xì)胞定向分化誘導(dǎo)的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種間充質(zhì)干細(xì)胞體外向黑色素細(xì)胞定向分化誘導(dǎo)的方法，具體涉及的是一種臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞體外向黑色素細(xì)胞定向分化誘導(dǎo)的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明通過采用植塊法培養(yǎng)臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，然后將獲得的臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的進(jìn)行鑒定，確定其具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，確定之后用改良后的黑素誘導(dǎo)培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)分化為黑素細(xì)胞，最近對(duì)培養(yǎng)后得到的黑素細(xì)胞進(jìn)行鑒定。ES細(xì)胞來源及骨髓或脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源有限或不易獲得，而本發(fā)明中臍帶容易獲得，免疫原性極低，不易產(chǎn)生個(gè)體差異，適合大批量規(guī)模化應(yīng)用于臨床；誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞有可能應(yīng)用到白癜風(fēng)治療。
【專利說明】一種間充質(zhì)干細(xì)胞體外向黑素細(xì)胞定向分化誘導(dǎo)的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種間充質(zhì)干細(xì)胞體外向黑色素細(xì)胞定向分化誘導(dǎo)的方法，具體涉及的是一種臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞體外向黑色素細(xì)胞定向分化誘導(dǎo)的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]白癜風(fēng)(vitiligo)是一種常見的局部或全身色素脫失性皮膚病，該病發(fā)病率約為0.5-1%,與遺傳因素、免疫因素、氧化應(yīng)激失衡等均有關(guān)系，目前公認(rèn)的觀點(diǎn)是綜合因素引起的黑素細(xì)胞被破壞，從而引起的色素脫失，及白斑形成。該病治療方法很多，如藥物，激光，手術(shù)等，但療效均不確切，有的甚至出現(xiàn)同形反應(yīng)。
[0003]近年來干細(xì)胞移植治療疾病的方法受到了越來越多的關(guān)注，利用干細(xì)胞的高增殖和多向分化潛能，使之在患者體內(nèi)分化成目標(biāo)細(xì)胞并替代病變細(xì)胞的功能，從而改善和阻止病情的發(fā)展。
[0004]種子細(xì)胞的選擇是細(xì)胞移植治療疾病的關(guān)鍵，目前采用胚胎干細(xì)胞(ES)、骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞及脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞來誘導(dǎo)分化為黑素細(xì)胞?，F(xiàn)有技術(shù)的客觀缺點(diǎn):ES細(xì)胞來源及骨髓或脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源有限或不易獲得，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)與其他來源的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，原始性及自我更新和增殖能力更強(qiáng)；免疫原性低，不會(huì)觸發(fā)免疫反應(yīng)；取材方便，純度高且無病毒及腫瘤細(xì)胞的污染，鑒于這些其他來源的間充質(zhì)干細(xì)胞無可比擬的優(yōu)勢，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在科研及臨床中有著廣泛的應(yīng)用前旦
-5^ O
[0005]目前，hUC-MSCs從臍帶的獲取主要是從臍帶華通氏膠，但其分離和培養(yǎng)方法沒有標(biāo)準(zhǔn)的步驟，不同實(shí)驗(yàn)室有不同的方法，主要有酶消化法和組織塊貼壁法。酶消化法是利用膠原酶將臍帶中的膠原纖維降解，從而分離出細(xì)胞。酶消化法可在較短時(shí)間內(nèi)獲得原代細(xì)胞，但該方法步驟多，極易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生化學(xué)污染和機(jī)械損傷；酶的濃度及消化時(shí)間不好掌握，且使用的膠原酶價(jià)格昂貴，因此不適合規(guī)模化生產(chǎn)。
[0006]組織塊貼壁法主要是利用小塊臍帶組織中間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)塑料培養(yǎng)瓶具有較強(qiáng)的粘附能力，可以在組織塊貼壁培養(yǎng)過程中逐步遷移出，而組織塊中內(nèi)皮細(xì)胞及造血系細(xì)胞等不貼壁，可以在培養(yǎng)換液過程中被逐漸棄去。該方法步驟簡單快捷，減少了細(xì)胞機(jī)械損傷和化學(xué)污染的概率，能更好地保持細(xì)胞的活力，同時(shí)省去了酶的使用，減少了經(jīng)濟(jì)成本，也適合規(guī)?；a(chǎn)，因此植塊法比酶消化法有更多的優(yōu)點(diǎn)。而文獻(xiàn)報(bào)道未見將hUC-MSCs誘導(dǎo)分化為黑素細(xì)胞。
[0007]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種間充質(zhì)干細(xì)胞體外向黑色素細(xì)胞定向分化誘導(dǎo)的方法，本發(fā)明通過采用植塊法培養(yǎng)臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，采用改良后的黑素誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)其體外定向分化為黑素細(xì)胞。
[0009]本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞體外向黑色素細(xì)胞定向分化誘導(dǎo)的方法，包括如下步驟:臍帶組織塊的獲??；原代臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、細(xì)胞的傳代培養(yǎng)；獲得的臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定；體外誘導(dǎo)分化為黑素細(xì)胞，黑素細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定。
[0010](I)其中所述的臍帶組織塊的獲取的步驟包括:
A.手術(shù)臺(tái)獲取人臍帶后，將其浸沒于0.9%滅菌生理鹽水中，無菌運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。
[0011]B.在超凈臺(tái)取出，含1%雙抗(青霉素和鏈霉素)PBS緩沖液洗滌3次，以除去血潰和充分清洗臍靜脈管腔，剝離掉動(dòng)靜脈，取臍帶結(jié)締組織，剪為4-5mm3大小的組織塊。
[0012](2)所述的原代臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、細(xì)胞的傳代培養(yǎng)步驟包括:
A.接種組織塊于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)板內(nèi)預(yù)先加0.5-lmL的DMEM/F12 (1:1)
培養(yǎng)基(含10%胎牛血清(FBS))，置培養(yǎng)板于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(37 °C、5%體積C02飽和濕度)。
[0013]B.細(xì)胞培養(yǎng)24h后首次換液，以后每2-3d換液一次，培養(yǎng)12_14 d后原代細(xì)胞長出并長滿60%后去除組織塊。
[0014]C.hUC-MSCs的傳代培養(yǎng):置培養(yǎng)板于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，條件溫度37 V，
5%C02飽和濕度，24h后首次換液，以后每2-3d更換培養(yǎng)基，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。
[0015](3)獲取的hUC-MSCs分別進(jìn)行免疫表型和成脂成骨等檢測，以證實(shí)其具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。
[0016](4)所述體外誘導(dǎo)分化為黑素細(xì)胞，黑素細(xì)胞的培養(yǎng)步驟包括:
將hUC-MSCs細(xì)胞傳代后接種于24孔板，使用DMEM/12培養(yǎng)基(含10%FBS)培養(yǎng)細(xì)胞至70%融合后，更換黑素誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，2天換液一次，細(xì)胞達(dá)60%融合時(shí)傳代，連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)9周。
[0017]其中改良的黑素誘導(dǎo)液，包括50ng/mL SCF、20%MCDB201、4ng/mL bFGFUOOnMEDN3、50% L-Wnt3a 上清、20pM cholera toxin,0.05 μ M 地塞米松、50nM TPA、20% 低糖DMEM、1X胰島素鐵硒傳遞蛋白、104M L-抗壞血酸、I mg/mL亞油酸-牛血清白蛋白。
[0018](4)鑒定由hUC-MSCs體外向黑素細(xì)胞分化后的細(xì)胞，以確定誘導(dǎo)分化后得到的細(xì)胞具有黑素細(xì)胞的特性。
[0019]本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)點(diǎn)
(1)ES細(xì)胞來源及骨髓或脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源有限或不易獲得，而臍帶容易獲得，免疫原性極低，不易產(chǎn)生個(gè)體差異，適合大批量規(guī)?；瘧?yīng)用于臨床；
(2)誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞有可能應(yīng)用到白癜風(fēng)治療。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1.植塊法培養(yǎng)原代hUC-MSCs形態(tài)學(xué)觀察圖；圖中，(a)為臍帶組織塊貼壁培養(yǎng)圖示；(b)為原代hUC-MSCs長出后的形態(tài)觀察(x40); (c)為原代細(xì)胞集落流水狀生長狀態(tài)(x40);⑷為P3代細(xì)胞長滿培養(yǎng)基的50% (x40)。
[0021]圖2.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)后的形態(tài)(油紅O染色’40) ； Ca)為對(duì)照組；(b)為誘導(dǎo)組。
[0022]圖3.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后的形態(tài)(茜素紅染色’40) ； Ca)為對(duì)照組；(b)為誘導(dǎo)組。
[0023]圖4.hUC-MSCs向黑素細(xì)胞誘導(dǎo)過程中光鏡下細(xì)胞形態(tài)變化圖示；(a)為誘導(dǎo)前；(b)為誘導(dǎo)3周后；(C)為誘導(dǎo)5周后；(d)為誘導(dǎo)9周后。
[0024]圖5.hUC-MSCs在向黑素細(xì)胞分化過程中黑素相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)圖(*:P<Q.05)；
圖6.hUC-MSCs來源的黑素細(xì)胞抗S-100，HMB45免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果(X200);圖中，(a)為對(duì)照組S-100的表達(dá)，呈陰性；(b)為誘導(dǎo)組S-100的表達(dá)，呈陽性；(c)為對(duì)照組HMB45的表達(dá)，呈陰性；(d)為誘導(dǎo)組HMB45的表達(dá)，呈陽性。
[0025]圖7.hUC-MSCs來源的黑素細(xì)胞抗MITF，S0X10免疫熒光圖(X 200);圖中，(a)為MITF免疫熒光；(b)為S0X10免疫熒光。

【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0027]臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞體外向黑色素細(xì)胞定向分化誘導(dǎo)的方法，按照以下步驟完成:
(I)植塊法培養(yǎng)原代hUC-MSCs (傳代培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察)
A.手術(shù)臺(tái)獲取人臍帶后，將其浸沒于0.9%滅菌生理鹽水中，無菌運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。
[0028]B.在超凈臺(tái)取出，含1%雙抗(青霉素和鏈霉素)PBS緩沖液洗滌3次，
以除去血潰和充分清洗臍靜脈管腔，剝離掉動(dòng)靜脈，取臍帶結(jié)締組織，剪為4-5mm3大小的組織塊。
[0029]C.接種組織塊于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，板內(nèi)預(yù)先加0.5-lmL的DMEM/F12 (I:
I)培養(yǎng)基(含10%FBS)，置培養(yǎng)板于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(37°C、5%體積C02飽和濕度)。
[0030]D.細(xì)胞培養(yǎng)24h后首次換液，以后每2-3d換液一次，培養(yǎng)12_14 d后原代細(xì)胞長出并長滿60%后去除組織塊。
[0031]原代hUC-MSCs傳代培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察如圖1所不。
[0032](2) hUC-MSCs多向分化潛能檢測(成骨細(xì)胞及成脂細(xì)胞誘導(dǎo)分化):檢測獲得的細(xì)胞具有干細(xì)胞特性。
[0033]A.hUC-MSCs向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化:
第3代hUC-MSCs胰酶消化后接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度適中，設(shè)成脂誘導(dǎo)組3孔，對(duì)照組3孔。
[0034]細(xì)胞培養(yǎng)生長到80%融合時(shí)換成脂誘導(dǎo)液:含10%FBS的高糖DMEM 100 mg/L的IBMX，ImM地塞米松，50mM吲哚美辛，1mM胰島素，對(duì)照組加常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液。
[0035]誘導(dǎo)期間每隔2-3天換液一次，誘導(dǎo)周期為2周，誘導(dǎo)結(jié)束后鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化及脂滴形成情況并進(jìn)行油紅染色法鑒定，顯微鏡下觀察并照相，結(jié)果如圖2所示。
[0036]B.hUC-MSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化
第3代hUC-MSCs胰酶消化后接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度適中(以105/mL為宜)，設(shè)成骨誘導(dǎo)組3孔，對(duì)照組3孔。
[0037]細(xì)胞培養(yǎng)貼壁生長到80%融合后換成骨誘導(dǎo)液:含10%FBS高糖DMEM，1mmol/Lb-磷酸甘油，200mmol/L抗壞血酸,1.0mmol/L地塞米松，對(duì)照組加常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液。
[0038]成骨誘導(dǎo)時(shí)間為2周，誘導(dǎo)期間每2-3天換液一次，2周后茜素紅染色鑒定，倒置相差顯微鏡觀察照相，結(jié)果如圖3所示。
[0039](3) hUC-MSCs向黑素細(xì)胞誘導(dǎo)分化
第3代hUC-MSCs細(xì)胞傳代后接種于24孔板，使用DMEM/12培養(yǎng)基(含10%FBS)培養(yǎng)細(xì)胞至70%融合后，對(duì)照組繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)組更換黑素誘導(dǎo)培養(yǎng)基:50ng/mL SCF,20%MCDB201,4ng/mL bFGF, 10nM EDN3,50% L_Wnt3a 上清，20pM cholera toxin, 0.05 μ M地塞米松，50nM TPA, 20%低糖DMEM，I X胰島素鐵硒傳遞蛋白，104M L-抗壞血酸，I mg/mL亞油酸-牛血清白蛋白，2天換液一次，細(xì)胞達(dá)60%融合時(shí)傳代，連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)9周。
[0040](4)從以下幾方面證明誘導(dǎo)分化后得到的細(xì)胞具有黑素細(xì)胞的特性:
A.誘導(dǎo)期間hUC-MSCs生長及形態(tài)觀察
在hUC-MSCs向黑素細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中，細(xì)胞形態(tài)3周后逐漸變?yōu)楦?xì)長的梭形，胞質(zhì)豐富，透明度下降，5周后，部分細(xì)胞逐漸伸展并出現(xiàn)雙極化及多極化，9周后，貼壁細(xì)胞形態(tài)多樣化，以多極化形態(tài)為多見，類似黑素細(xì)胞的樹突狀結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖4所示。
[0041]B.RT-PCR檢測相關(guān)基因表達(dá)
hUC-MSCs在向黑素細(xì)胞誘導(dǎo)的第3，5，7，9周后，與對(duì)照組比較，誘導(dǎo)組黑素細(xì)胞相關(guān)基因MITF，TYRPI, S0X10, MClRmRNA的表達(dá)隨時(shí)間的增加均顯著提高，0°〈0.05)，結(jié)果如圖5所示
C.免疫化學(xué)染色
誘導(dǎo)組細(xì)胞形態(tài)呈雙極化及多極化的類黑素細(xì)胞樹突狀結(jié)構(gòu)，HMB45及S-100染色后胞體及樹突被染成棕褐色，呈陽性，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)為長梭形，與誘導(dǎo)組有明顯差異，s-100, HMB45染色呈陰性，結(jié)果如圖6所示。
[0042]D.免疫熒光染色
誘導(dǎo)組細(xì)胞經(jīng)FITC標(biāo)記的二抗孵育后，MITF, S0X10均顯示綠色熒光，陽性表達(dá)，對(duì)照組則陰性表達(dá)，結(jié)果如圖7所示。
【權(quán)利要求】
1.一種間充質(zhì)干細(xì)胞體外向黑色素細(xì)胞定向分化誘導(dǎo)的方法，其特征在于，包 括如下步驟:臍帶組織塊的獲??；原代臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、細(xì)胞的傳代培養(yǎng)；獲得的臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定；體外誘導(dǎo)分化為黑素細(xì)胞，黑素細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種間充質(zhì)干細(xì)胞體外向黑色素細(xì)胞定向分化誘導(dǎo)的 方法，其特征在于，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞來源于臍帶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種間充質(zhì)干細(xì)胞體外向黑色素細(xì)胞定向分化誘導(dǎo)的 方法，其特征在于，所述的臍帶組織塊的獲取的步驟包括: 手術(shù)臺(tái)獲取人臍帶后，將其浸沒于0.9%滅菌生理鹽水中，無菌運(yùn)輸至實(shí) 驗(yàn)室； 在超凈臺(tái)取出，含1%雙抗(青霉素和鏈霉素)PBS緩沖液洗滌3次，以除去血潰和充分清洗臍靜脈管腔，剝離掉動(dòng)靜脈，取臍帶結(jié)締組織，剪為4-5mm3大小的組織塊。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種間充質(zhì)干細(xì)胞體外向黑色素細(xì)胞定向分化誘導(dǎo)的 方法，其特征在于，所述的原代臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、細(xì)胞的傳代培養(yǎng)步驟包括: 接種組織塊于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)板內(nèi)預(yù)先加0.5-lmL的DMEM/F12培養(yǎng) 基，置培養(yǎng)板于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 °C、5%體積C02飽和濕度； 細(xì)胞培養(yǎng)24h后首次換液，以后每2-3d換液一次，培養(yǎng)12-14 d后原代 細(xì)胞長出并長滿60%后去除組織塊； hUC-MSCs的傳代培養(yǎng):置培養(yǎng)板于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，條件溫度37 V, 5%C02飽和濕度，24h后首次換液，以后每2-3d更換培養(yǎng)基，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種間充質(zhì)干細(xì)胞體外向黑色素細(xì)胞定向分化誘導(dǎo)的 方法，其特征在于，所述體外誘導(dǎo)分化為黑素細(xì)胞，黑素細(xì)胞的培養(yǎng)步驟包括: 將hUC-MSCs細(xì)胞傳代后接種于24孔板，使用DMEM/12培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞至70%融合后，更換黑素誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，2天換液一次，細(xì)胞達(dá)60%融合時(shí)傳代，連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)9周。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的一種間充質(zhì)干細(xì)胞體外向黑色素細(xì)胞定向分化誘 導(dǎo)的方法，其特征在于，所述DMEM/F12培養(yǎng)基中DMEM和F12的比例為1:1; 所述DMEM/F12培養(yǎng)基中含10%胎牛血清。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種間充質(zhì)干細(xì)胞體外向黑色素細(xì)胞定向分化誘 導(dǎo)的方法，其特征在于，所述黑素誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分包括50ng/mL SCF、20%MCDB201、4ng/mL bFGFUOOnM EDN3、50% L_Wnt3a 上清、20pM cholera toxin,0.05 μ M 地塞米松、50nMTPA、20%低糖DMEM、1X胰島素鐵硒傳遞蛋白、104M L-抗壞血酸、I mg/mL亞油酸-牛血清白蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種間充質(zhì)干細(xì)胞體外向黑色素細(xì)胞定向分化誘導(dǎo)的方法，其特征在于，所得到的黑素細(xì)胞用于白癜風(fēng)的治療。
【文檔編號(hào)】A61K35/12GK104232574SQ201410467521
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月15日
【發(fā)明者】李遇梅, 李小戰(zhàn), 李興天, 劉莉萍 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院