綠原酸在制備治療少突膠質(zhì)瘤的藥物中的用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了綠原酸在制備治療少突膠質(zhì)瘤的藥物中的用途。本發(fā)明綠原酸具有抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤的功效，并能抑制腦腫瘤干細(xì)胞的生長，能替代部分放化療，減輕患者可以因放化療引起的不適反應(yīng)，是治療少突膠質(zhì)瘤新的藥物治療手段和選擇。
【專利說明】綠原酸在制備治療少突膠質(zhì)瘤的藥物中的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及綠原酸在制備治療少突膠質(zhì)瘤的藥物中的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，癌癥的死亡率已躍居國內(nèi)各種死因之首。可能與抽煙、人口老齡化、工業(yè) 化的進(jìn)程等有關(guān)。傳統(tǒng)的生活貧困地區(qū)常見腫瘤如食管癌、胃癌、肝癌等發(fā)病率仍居高不 下，而富裕國家的肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多發(fā)腫瘤卻已快速增長。最新調(diào)查顯示，發(fā)達(dá)國家 腦腫瘤的發(fā)病率不斷上升，該病還表現(xiàn)出明顯的低齡化趨勢，逐漸逼近40歲以下青年人， 且成為威脅兒童健康的重要腫瘤之一。據(jù)美國統(tǒng)計，在20-40歲人群腫瘤死亡病因中，腦腫 瘤在男性是第一位的死亡病因，在女性排第五位，可見腦腫瘤對社會的危害之大。目前，腦 腫瘤仍是病死率最高的成人腫瘤之一，同時也是兒童發(fā)病率最高的實體瘤。
[0003] 神經(jīng)膠質(zhì)瘤亦稱膠質(zhì)細(xì)胞瘤，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的一種惡性腫瘤，來源于神經(jīng) 上皮占全部顱內(nèi)腫瘤的40 %?50 %，具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高病死率和低治愈率的特 點。根據(jù)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的分化情況分為星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)瘤、室管膜瘤等，其生長特點為 浸潤性生長，與正常腦組織無明顯界限，多數(shù)不限于一個腦葉，向腦組織外呈指狀深入破壞 腦組織。目前腦膠質(zhì)瘤的主要治療措施是手術(shù)切除，但術(shù)后5年存活率很低，對放療和化療 都不敏感，因此，急需開發(fā)治療膠質(zhì)瘤的生物藥物。
[0004] 腦腫瘤分類的方法很多，目前尚無統(tǒng)一的分類方法，并且各種腫瘤的組織發(fā)生與 病理特征不同，其良性與惡性以及物學(xué)特性也不一樣。而星形細(xì)胞瘤和少突膠質(zhì)瘤、室管膜 瘤在多方面都存在差異，具體差異如下：
[0005] 1.星形細(xì)胞瘤是指由星形膠質(zhì)細(xì)胞所組成的膠質(zhì)瘤的一種，是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的 難治性腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的13%?26%，占神經(jīng)上皮腫瘤的21. 2%?51. 6%。其中膠質(zhì) 瘤膠質(zhì)母細(xì)胞瘤為成人最常見的原發(fā)性腦腫瘤，其患者的中位生存期僅有15個月左右。膠 質(zhì)膜細(xì)胞瘤呈現(xiàn)浸潤性生長，可向正常腦組織廣泛浸潤，導(dǎo)致手術(shù)切除困難；其次，膠質(zhì)母 細(xì)胞瘤對常規(guī)的放、化療具有抵抗性，成為其致死率高和復(fù)發(fā)率高的重要原因。由于尚未完 全闡明其發(fā)病機(jī)制，目前缺乏針對腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的有效治療方法。星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤與少 突膠質(zhì)細(xì)胞瘤在RTN4的表達(dá)量存在差異，在少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤中，RTN4A表達(dá)明顯高于星形 膠質(zhì)細(xì)胞瘤，用以鑒別少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤的特異性和靈敏度。
[0006] 2.少突膠質(zhì)腫瘤是一種較少見的神經(jīng)上皮性腫瘤，少突膠質(zhì)瘤多發(fā)于成年人，平 均發(fā)病年齡為40歲左右。過去因檢查技術(shù)及病理診斷水平的限制，常被漏診或誤診為其 他類型膠質(zhì)瘤，以往文獻(xiàn)認(rèn)為少突膠質(zhì)腫瘤占顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤的2%?5%，占腦膠質(zhì)瘤的 2 %?12%，但近年來隨著臨床研究不斷深入以及病理診斷水平不斷提高，少突膠質(zhì)腫瘤檢 出率明顯增加，有文獻(xiàn)報道少突膠質(zhì)腫瘤約占顱內(nèi)膠質(zhì)瘤的33%。少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤是顱內(nèi) 起源于少突膠質(zhì)細(xì)胞的腫瘤，是膠質(zhì)瘤的一種獨立類型，約占顱內(nèi)腫瘤的4. 39%。近些年 來，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤的分子遺傳學(xué)研究有了較大的進(jìn)展，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤最常見的遺傳學(xué) 改變是19號染色體長臂的雜合性缺失，第二個常見的遺傳改變是1號染色體短臂的雜合性 缺失。根據(jù)2007年世界衛(wèi)生組織（WHO)最新分級病理分類，將少突膠質(zhì)腫瘤分為單純型少 突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和混合型少突星形細(xì)胞瘤，前者又可分為低級別少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤（II級）、高 級別少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤（III級）和多形性惡性膠質(zhì)瘤（IV級）；后者分為少突星形細(xì)胞瘤（II 級）、間變型少突星形細(xì)胞瘤（III級）。近年研究表明，低級別的少突膠質(zhì)腫瘤對化療較敏 感，且不同級別的少突膠質(zhì)腫瘤其臨床轉(zhuǎn)歸及預(yù)后有明顯差異。
[0007] 3.室管膜瘤來源于腦室與脊髓中央管的室管膜細(xì)胞或腦內(nèi)白質(zhì)室管膜細(xì)胞巢的 中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。在膠質(zhì)瘤中占18. 2%，男多于女，多見于兒童及青年，約75%位于幕 下，幕上僅占25%。腫瘤大多位于腦室內(nèi)，少數(shù)瘤主體在腦組織內(nèi)。室管膜瘤是一種起源于 室管膜上皮細(xì)胞的神經(jīng)上皮性腫瘤，可發(fā)生于顱內(nèi)及椎管內(nèi)，并可沿蛛網(wǎng)膜下腔播散，目前 還難以完全治愈。不同病理類型的膠質(zhì)瘤各有其高發(fā)年齡，室管膜瘤的高發(fā)年齡在10歲以 前。國外統(tǒng)計96%的脊髓室管膜瘤發(fā)生在成人，發(fā)病年齡多為35?45歲，是成人最常見 的脊髓腫瘤，大約占所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)室管膜瘤的34. 5%，占髓內(nèi)腫瘤的60%，占成人室 管膜瘤的75%。研究發(fā)現(xiàn)，在室管膜瘤中，50%以上有22號染色體片段的丟失，并且發(fā)現(xiàn) SV40基因與室管膜瘤的關(guān)系較為密切。WH02000年最新分類將室管膜腫瘤分為：（1)室管膜 瘤：又分類4個亞型①細(xì)胞型；②乳頭型；③透明細(xì)胞型；④腦室膜細(xì)胞型。（2)間變或惡 性室管膜瘤：腫瘤細(xì)胞致密成片，細(xì)胞及核形態(tài)各異，并可見核分裂相及灶性壞死。（3)粘 液乳頭型室管膜瘤：腫瘤細(xì)胞乳頭狀排列，圍繞乳頭狀結(jié)構(gòu)中心的結(jié)締組織常有粘液樣變。 (4)室管膜下瘤：構(gòu)成腫瘤的主要細(xì)胞是室管膜下膠質(zhì)細(xì)胞，可見假菊形團(tuán)樣排列。有時可 見少量室管膜細(xì)胞以及室管膜母細(xì)胞分布于膠質(zhì)纖維間。室管膜腫瘤是對化療不敏感的腫 瘤，臨床試驗中，各種化療藥的單獨使用或聯(lián)合使用收效甚微。
[0008] 神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療以手術(shù)為主，但由于其分化差、增殖快、侵襲性強，目前的手術(shù) 方式還無法完全切除腫瘤，一般都主張綜合治療。手術(shù)后放療和化療是普遍接受的治療方 法，然而腫瘤細(xì)胞對放療的輻射耐受性可能造成殘余病灶再次復(fù)發(fā)。此外，腦腫瘤對化療均 不太敏感，原因之一是只有少數(shù)藥物可以通過血腦屏障。由于血腦屏障、腫瘤組織內(nèi)及周邊 水腫腦組織間隙靜水壓較高等因素導(dǎo)致腫瘤內(nèi)化療藥物的有效濃度較低。另外，腫瘤耐藥 性的產(chǎn)生、全身用藥的不良反應(yīng)等因素均對化療的治療效果造成影響。為了提高膠質(zhì)瘤的 治療效果，人們從膠質(zhì)瘤的分子發(fā)病機(jī)制到新的臨床治療手段做了大量的工作。
[0009] 綠原酸廣泛存在于各種藥用植物，如金銀花中，目前對它的化學(xué)結(jié)構(gòu)研究已經(jīng) 清楚，已有人對其進(jìn)行藥用研究，報道了綠原酸可以應(yīng)用于治療腫瘤等疾病。目前報 道的關(guān)于綠原酸用于治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的文獻(xiàn)主要是從作用機(jī)制來闡述，如文獻(xiàn)：The chemopreventive properties of chlorogenic acid reveal a potential new role for the microsomal glucose-6-phosphate translocase in brain tumor progression (綠 原酸的化學(xué)預(yù)防特性揭示了其在腦腫瘤進(jìn)展中對葡萄糖-6_磷酸轉(zhuǎn)移酶的新作用），報道 了腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株（U87)中的葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)移酶（G6PT)可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號通路，呈高 表達(dá)狀態(tài)，與腫瘤細(xì)胞的浸潤性密切相關(guān)；綠原酸能對抗G6PT誘導(dǎo)的U87細(xì)胞遷移，綠原 酸能明顯抑制神經(jīng)鞘氨醇（SIP)誘導(dǎo)的U87細(xì)胞遷移。證實綠原酸通過抑制基質(zhì)金屬蛋 白轉(zhuǎn)移酶和葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，達(dá)到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的效果。文獻(xiàn)inhibition of MMP-2 secretion from brain tumor cells suggests chemopreventive properties of a furanocoumarin glycoside and of chalcones isolated from the twigs of Dorstenia turbinata (呋喃香豆素苷和查耳酮類在腦腫瘤細(xì)胞中具有抑制MMP-2的分泌活性）》，報道 了綠原酸作為基質(zhì)金屬蛋白轉(zhuǎn)移酶的抑制劑可以抑制MMP-2的分泌，達(dá)到抑制腦腫瘤中膠 質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。綠原酸是G6PT抑制劑。間接說明綠原酸的抗腦腫瘤作用。但是 文獻(xiàn)所闡述的G6PT為廣義的致癌物質(zhì)，涉及的腦腫瘤也是一個廣義概念，不能說明綠原酸 對腦腫瘤的直接作用。王樂，從元寶楓葉中提取、分離純化綠原酸的工藝研究，西北大學(xué)，碩 士學(xué)位論文20100401，報道了綠原酸抗癌抗衰老作用，其中公開了綠原酸可抑制神經(jīng)膠質(zhì) 瘤的遷移以及人Η印3B肝癌細(xì)胞中的金屬硫蛋白（MMP)分泌，對大腸癌、肝癌和喉癌均有顯 著療效，被認(rèn)為是癌癥的有效防護(hù)劑。
[0010] 綜上所述，現(xiàn)有文獻(xiàn)均披露的綠原酸對腦腫瘤的作用一方面局限于星形細(xì)胞瘤中 的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（作用機(jī)制方面闡述），沒有綠原酸治療腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的體內(nèi)藥效試驗 證明，沒有綠原酸治療少突膠質(zhì)瘤的相關(guān)報道，也沒有綠原酸關(guān)于有抑制腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞 作用的相關(guān)報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了綠原酸的新用途。
[0012] 本發(fā)明綠原酸在制備治療少突膠質(zhì)瘤的藥物中的用途。
[0013] 其中，所述的藥物是對移植性腦膠質(zhì)瘤抑制作用的藥物。
[0014] 其中，所述的藥物是對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞有生長抑制作用的藥物。
[0015] 其中，所述的藥物是對C6膠質(zhì)瘤干細(xì)胞有生長抑制作用的藥物。
[0016] 其中，所述的藥物是以有效量的綠原酸為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或 者輔助性成分制備而成的制劑。
[0017] 其中，所述的藥物制劑中每制劑單位含有綠原酸1?3000mg。
[0018] 進(jìn)一步地，所述的藥物制劑中綠原酸的使用劑量為10_40mg/kg。
[0019] 更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的藥物制劑中綠原酸的使用劑量為20mg/kg。
[0020] 其中，所述的藥劑是口服制劑或者注射劑。
[0021] 雖然文獻(xiàn)報道了綠原酸在體外實驗中可對抗重組體G6PT蛋白的過分表達(dá)所誘發(fā) 的U-87膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)移，僅僅說明了綠原酸在腦腫瘤進(jìn)展中對葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)移酶 的作用，沒有直接證明綠原酸具有抗U-87膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的作用；且綠原酸抑制U-87人膠質(zhì) 母細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)移，是屬于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，但膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、室管膜瘤是膠 質(zhì)瘤的不同類型，是不同的適應(yīng)癥。因此，不能推之綠原酸具有抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和室管 膜瘤的功效。
[0022] 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、室管膜瘤在病因?qū)W、組織病理學(xué)和臨床方面有 著明顯的不同。室管膜瘤是一種起源于室管膜上皮細(xì)胞的神經(jīng)上皮性腫瘤，可發(fā)生于顱內(nèi) 及椎管內(nèi)，并可沿蛛網(wǎng)膜下腔播散，目前還難以完全治愈。國外統(tǒng)計96%的脊髓室管膜瘤發(fā) 生在成人，發(fā)病年齡多為35?45歲，是成人最常見的脊髓腫瘤，大約占所有中樞神經(jīng)系統(tǒng) 室管膜瘤的34. 5%，占髓內(nèi)腫瘤的60%，占成人室管膜瘤的75%。WH02000年最新分類將 室管膜腫瘤分為：（1)室管膜瘤：又分類4個亞型①細(xì)胞型；②乳頭型；③透明細(xì)胞型；④ 腦室膜細(xì)胞型。（2)間變或惡性室管膜瘤：腫瘤細(xì)胞致密成片，細(xì)胞及核形態(tài)各異，并可見 核分裂相及灶性壞死。（3)粘液乳頭型室管膜瘤：腫瘤細(xì)胞乳頭狀排列，圍繞乳頭狀結(jié)構(gòu)中 心的結(jié)締組織常有粘液樣變。（4)室管膜下瘤：構(gòu)成腫瘤的主要細(xì)胞是室管膜下膠質(zhì)細(xì)胞， 可見假菊形團(tuán)樣排列。有時可見少量室管膜細(xì)胞以及室管膜母細(xì)胞分布于膠質(zhì)纖維間。目 前對于沒有腦脊液播散的室管膜瘤的治療方式為手術(shù)盡可能全切并在術(shù)后輔以局部放射 治療可以提供最佳的治療效，但是無論是傳統(tǒng)聯(lián)合化療還是大劑量化療似乎都不能改善預(yù) 后，盡管部分試驗顯示腫瘤對化療敏感。
[0023] 少突膠質(zhì)腫瘤是一種較少見的神經(jīng)上皮性腫瘤，以往文獻(xiàn)認(rèn)為少突膠質(zhì)腫瘤占顱 內(nèi)原發(fā)性腫瘤的2%?5%，占腦膠質(zhì)瘤的2%?12%，但近年來隨著臨床研究不斷深入以 及病理診斷水平不斷提高，少突膠質(zhì)腫瘤檢出率明顯增加，有文獻(xiàn)報道少突膠質(zhì)腫瘤約占 顱內(nèi)膠質(zhì)瘤的33%。根據(jù)2007年世界衛(wèi)生組織（WHO)最新分級病理分類，將少突膠質(zhì)腫瘤 分為單純型少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和混合型少突星形細(xì)胞瘤，前者又可分為低級別少突膠質(zhì)細(xì)胞 瘤（II級）、高級別少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤（III級）和多形性惡性膠質(zhì)瘤（IV級）；后者分為少突 星形細(xì)胞瘤（II級）、間變型少突星形細(xì)胞瘤（III級）。近年研究表明，少突膠質(zhì)腫瘤對化 療較敏感，且不同級別的少突膠質(zhì)腫瘤其臨床轉(zhuǎn)歸及預(yù)后有明顯差異。
[0024] 本發(fā)明綠原酸具有抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤的功效，并能抑制腦腫瘤干細(xì)胞的生長， 能替代部分放化療，減輕患者可以因放化療引起的不適反應(yīng)，是治療少突膠質(zhì)瘤新的藥物 治療手段和選擇。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1綠原酸對人腦少突膠質(zhì)瘤的劑量效應(yīng)曲線

【具體實施方式】
[0026] 以下通過具體的藥效學(xué)試驗證明本發(fā)明的有益效果
[0027] 為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進(jìn)一 步詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明 上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0028] 試驗例1綠原酸誘導(dǎo)人少突膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)凋亡的實驗研究
[0029] 1.材料
[0030] 細(xì)胞：人少突膠質(zhì)瘤細(xì)胞由四川大學(xué)華西醫(yī)院衛(wèi)生部移植工程和移植免疫重點實 驗室提供。
[0031] 藥物與試劑：綠原酸，由四川九章生物科技有限公司提供；谷氨酸購于浙江天瑞 化學(xué)有限公司；四甲基偶氮唑鹽（ΜΤΤ)、0. 25%胰蛋白酶、RPMI1640培養(yǎng)液及胎牛血清均購 自美國Sigma公司。
[0032] 2.方法
[0033] 2. 1人腦少突膠質(zhì)瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng)
[0034] (1)原代培養(yǎng)
[0035] 手術(shù)中切除的無菌新鮮腫瘤標(biāo)本（人腦少突膠質(zhì)瘤），立即放入培養(yǎng)液中，送實驗 室。用含有青霉素、鏈霉素和慶大霉素的無血清RPMI1640沖洗2?3次，洗去標(biāo)本上的血 液。在顯微鏡下選擇較為單純的腫瘤組織移入無菌青霉素小瓶中，剔除壞死組織和血管等 結(jié)構(gòu)，取腫瘤組織塊，用眼科剪刀剪成〇. 5?1mm3的小塊后，加入1?2mL細(xì)胞培養(yǎng)液，用 吸管輕輕吹打，使組織塊懸浮。用吸管分次吸取組織塊懸液，使其均勻排在培養(yǎng)瓶底壁上， 翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，加入2?3mL培養(yǎng)液，放入37°C恒溫C02培養(yǎng)箱內(nèi)2?3h后，觀察組織塊牢固 貼于平壁上后，再緩慢將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)液浸泡組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)。
[0036] (2)原代細(xì)胞的傳代
[0037] 待細(xì)胞長滿瓶底后，倒去舊培養(yǎng)液，用無血清的RPMI1640培養(yǎng)液洗1遍。加入 0. 25%的胰酶消化約5min，用含血清培養(yǎng)液終止消化。反復(fù)吹打，收集細(xì)胞，計數(shù)，按5 X 104 個/cm2的密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)。
[0038] (3)人腦少突膠質(zhì)瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察
[0039] 原代培養(yǎng)的細(xì)胞在倒置相差顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。向培養(yǎng)細(xì)胞中加入含有 5ymol/L Fluo-3/AM 突光探針和 5ymol/L Pluronic F-127 的 lmL Hank' s 液，37°C 負(fù)載 40min。用不含熒光探針的Hank's液洗滌3次。負(fù)載好的細(xì)胞液在激光共聚焦掃描顯微鏡 觀察細(xì)胞的狀態(tài)，與原手術(shù)病理檢查結(jié)果進(jìn)行對照，確認(rèn)生長細(xì)胞為人腦少突膠質(zhì)瘤細(xì)胞。 培養(yǎng)細(xì)胞再經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白免疫組化檢測確認(rèn)。
[0040] (4)MTT法檢測綠原酸對原代培養(yǎng)人腦少突膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用
[0041] 細(xì)胞接種：取對數(shù)生長期細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌離心 (lOOOrpm 5min兩次），用完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為6X104/ml，接種細(xì)胞于 96孔板內(nèi)，每孔50 μ 1 (細(xì)胞數(shù)量6 X 103/孔），每個藥物濃度接種3個復(fù)孔，并設(shè)正常對照 組（腫瘤細(xì)胞+完全培養(yǎng)基）和空白對照組（完全培養(yǎng)基），每組3個復(fù)孔。
[0042] 加藥：接種后次日細(xì)胞貼壁后按以下分組加藥，綠原酸組，用完全培養(yǎng)基將 6. 4mg/ml綠原酸儲存溶液配制成256 μ g/ml的溶液，然后用完全培養(yǎng)基按對倍稀釋法逐步 稀釋，得含綠原酸256、128、64 μ g/ml的完全培養(yǎng)基，備用；取50 μ 1上述含不同濃度綠原酸 的完全培養(yǎng)基到已接種細(xì)胞的96孔板中，使綠原酸終濃度分別為128、64、32 μ g/ml，每個 濃度3復(fù)孔。靜置培養(yǎng)48小時；空白對照組，每孔不接種細(xì)胞，只加等量（ΙΟΟμΙ)完全培 養(yǎng)基，設(shè)3個復(fù)孔作為空白對照。
[0043] 測定：加藥后細(xì)胞培養(yǎng)48小時，在上述3個實驗組和空白對照組孔內(nèi)加入 10 μ 1WST-1溶液，置37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4小時后，在μ -Quant微孔板測定儀上測定 不同藥物組、正常對照組和空白對照組440nm波長處的吸收值。
[0044] 數(shù)據(jù)處理：腫瘤細(xì)胞生長抑制率的計算：抑制率=(對照組A值-實驗組A值）/ 對照組A值X 100%。實驗重復(fù)3次。
[0045] 3.實驗結(jié)果
[0046] 3. 1綠原酸對人腦少突膠質(zhì)瘤的體外抑瘤作用
[0047] (1)細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果
[0048] 各組加藥處理48小時后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，與正常對照組比較，綠 原酸（32?128 μ g/ml)低濃度時即有細(xì)胞數(shù)量較正常細(xì)胞明顯減少；有細(xì)胞碎片，產(chǎn)生凋 亡。
[0049] (2)綠原酸對人腦少突膠質(zhì)瘤的抑制率和劑量效應(yīng)曲線
[0050] 綠原酸對人腦少突膠質(zhì)瘤的抑制率見表1，劑量效應(yīng)曲線見圖1。
[0051] 表1綠原酸對人腦少突膠質(zhì)瘤的抑制率
[0052]

【權(quán)利要求】
1. 綠原酸在制備治療少突膠質(zhì)瘤的藥物中的用途。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于：所述的藥物是對移植性腦膠質(zhì)瘤抑制作 用的藥物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于：所述的藥物是對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞有生長抑 制作用的藥物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于：所述的藥物是對C6膠質(zhì)瘤干細(xì)胞有生長 抑制作用的藥物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項所述的用途，其特征在于：所述的藥物是以有效量的綠 原酸為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或者輔助性成分制備而成的制劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于：所述的藥物制劑中每制劑單位含有綠原 酸 1 ?3000mg。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于：所述的藥物制劑中綠原酸的使用劑量為 10_40mg/kg。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于：所述的藥物制劑中綠原酸的使用劑量為 20mg/kg。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6-9任意一項所述的用途，其特征在于：所述的藥劑是口服制劑或者 注射劑。
【文檔編號】A61K31/216GK104188949SQ201410468312
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月15日
【發(fā)明者】張潔, 黃英, 朱麗娜 申請人:四川九章生物科技有限公司