丹皮酚在制備治療急性腎損傷藥物方面的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及丹皮酚在制備治療急性腎損傷藥物方面的應(yīng)用。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)丹皮酚能夠應(yīng)用于制備治療急性腎損傷的藥物。
【專利說(shuō)明】丹皮酚在制備治療急性腎損傷藥物方面的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供中藥有效成分丹皮酚的新用途，具體涉及丹皮酚在制備治療急性腎損 傷藥物方面的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 丹皮酚（Paeonol, P ae)又稱牡丹酚，是毛莫科植物牡丹Paeonia Suffruticosa Andr.根皮和蘿蘑科植物徐長(zhǎng)卿Pycnostelma Paniculatum (Bunge) K. Schum干燥根或全 草的主要有效成分。丹皮酚是一種小分子的酚類化合物，為白色或者微黃色有光澤的針狀 結(jié)晶，其分子量為166. 18,分子式為C9H1003,化學(xué)名稱為2-羥基-4-甲氧基苯乙酮。
[0003] 丹皮酚具有廣泛的生物活性，如抗菌消炎、鎮(zhèn)痛、解熱、鎮(zhèn)靜、催眠、抗腫瘤、抗過(guò) 敏和預(yù)防心血管系統(tǒng)疾病等【H. S. Chung, M. Kang, C. Cho et al·，"Inhibition of nitric oxide and tumor necrosis factor-alpha by moutan cortex in activatedmouse peritoneal macrophages，，' Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2007vol. 30， no. 5，pp. 912 - 916. He D. Y. , Dai S. M. Anti-inflammatory and immunomodulatory effects of paeonia lactiflora pall, a traditional Chinese herbal medicine. Front. Pharmacol. (2011) 2 10.】。研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚可通過(guò)抑制增殖、誘導(dǎo)分化和凋亡、 影響基因表達(dá)等機(jī)制對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷、誘導(dǎo)分化和凋亡、抑制侵襲和轉(zhuǎn)移等作用【Sun， Guo-Ping, Wang, Hua, Xu，Shu-Ping， Shen，Yu-Xian，Wu, Qiang. Anti-tumor effects of paeonol in a HepA-hepatoma bearing mouse model via induction to tumor cell apoptosis and stimulation of IL_2 and TNF_a production. European Journal of Pharmacology，2008, 584, 246 - 252.】。臨床上主要?jiǎng)┬蜑榈てし幼⑸鋭?，在治療痛癥和皮 膚科臨床方面應(yīng)用廣泛。目前對(duì)丹皮酚的藥理研究主要集中在對(duì)心腦血管的保護(hù)、抗腫瘤 活性及機(jī)制以及提高免疫功能等方面。對(duì)于丹皮酚治療急性腎損傷的作用至今未見(jiàn)任何報(bào) 道。
[0004] 急性腎損傷是一種臨床常見(jiàn)的危重癥疾病，其起病急，病程進(jìn)展快，死亡率及病 死率高，且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)【W(wǎng)aikar SS，Curhan GC，Wald R，et al. Declining mortality in patients with acute renal failure [J]. J Am Soe Nephrol,2006,17 ： 1143 - 1150.】。急性腎損傷可由感染染、燒傷、創(chuàng)傷、腎動(dòng)脈狹窄及休克等各種原因引起， 其中膿毒血癥是臨床發(fā)生急性腎損傷的最重要原因之一。一般來(lái)說(shuō)，急性腎損傷的病死率 為45%，而合并膿毒癥后病死率可驟升至70%，成為危重癥急救醫(yī)學(xué)中的重大難題之一 【Angus DC, Linde-Zwirble WT, Lidicker J, et al, Epidemiology of severe sepsis in the United States ：analysis of incidence,outcome,and associated costs of care .Crit Care Med,2001,29 (7) :1303-1310.]〇
[0005] 革蘭陰性（G_)菌感染是引起膿毒癥的重要原因之一，G-菌外膜的活性成分一內(nèi) 毒素（endotoxin)即脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS)與巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞 膜上相應(yīng)受體作用后，啟動(dòng)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，最終激活核轉(zhuǎn)錄因子-κ B(nuclear factor κ B，NF-K B)，引起多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)（TNF、IL-1 β、IL-6等）的表達(dá)和釋放，導(dǎo) 致血管通透性增加、體液滲出和淋巴細(xì)胞移行到炎癥部位引發(fā)"炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)"或伴有免 疫功能的嚴(yán)重抑制，即表現(xiàn)為膿毒癥，危重者可發(fā)展為多器官功能障礙綜合征，甚至出現(xiàn)多 器官功能衰竭。其中腎臟是最容易受累的器官之一。北京中醫(yī)醫(yī)院通過(guò)采用腎衰灌腸液 加連續(xù)性血液凈化治療膿毒血癥致早期急性腎損傷，并對(duì)32例膿毒血癥急性腎損傷患者 進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重感染患者早期血漿中炎癥介質(zhì)急劇升高，通過(guò)治療可顯著降低患者血 漿IL-6、IL-8、TNF-a水平，促進(jìn)臟器功能恢復(fù)，提高存活率【劉寶利，劉清泉，郭玉紅.腎 衰灌腸液加連續(xù)性血液凈化對(duì)膿毒血癥致早期急性腎損傷微炎癥指標(biāo)的影響.世界中醫(yī) 藥，2014，9 (3) :285-287】。抑制炎性細(xì)胞因子的釋放為研究治療膿毒血癥急性腎損傷 藥物提供了新靶點(diǎn)，研究表明，在LPS誘導(dǎo)的急性腎損傷大鼠中，使用可溶性TNF受體中和 炎癥因子可抑制腎功能不全【Knotek M, Rogachev B, Wang W, et al，Endotoxemic renal failure in mice: role of tumor necrosis factor independent of inducible nitric oxide synthase. Kidney Int 2001,59: 2243-2249·】。Cunnigham 等通過(guò) TNF 基因缺陷 型小鼠證實(shí)了 TNF在腎損傷中的作用【Cunnigham PN, Dyanov HM, Park P, et al，Acute renal failure in endotoxemia is caused by TNF acting directly on TNF receptor-1 in kidney. J Immunol 2002,168: 5817-5823.】。目前臨床上對(duì)膿毒血癥急性腎損傷尚缺 乏特異性的治療藥物。因此，開(kāi)發(fā)能改善腎臟功能，抑制炎性細(xì)胞因子釋放的治療急性損傷 的天然藥物具有重要的意義。
[0006] 現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丹皮酚能夠通過(guò)ERK，p38和NF-κΒ信號(hào)通路途徑，抑制 破骨細(xì)胞的生成和單核細(xì)胞粘附，調(diào)節(jié)炎癥因子的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用【Nizamutdinova IT, Oh HM, Min YN, et al. "Paeonol suppresses intercellular adhesion molecule-1 expression in tumor necrosis factor-a-stimulated human umbilical vein endothelial cells by blocking p38, ERK and nuclear factor-κ B signaling pathways," International Immunopharmacology, 2007 Mar;7(3):343-50 ；Chae HS, Kang OH, Lee YS, et al. "Inhibition of LPS induced iNOS, C0X-2 and inflammatory mediator expression by paeonol through the MAPKs inactivation in RAW 264. 7 cells, American Journal of Chinese Medicine, 2009; 37 (1) : 181-94]〇


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明旨在提供丹皮酚在制備治療急性腎損傷藥物方面的應(yīng)用。
[0008] 技術(shù)方案：丹皮酚在制備治療急性腎損傷藥物方面的應(yīng)用。
[0009] 發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)丹皮酚可改善脂多糖誘導(dǎo)急性腎損傷，減輕腎組織病理?yè)p傷，降 低組織病理?yè)p傷評(píng)分，下調(diào)血清中BUN和SCr及炎癥介質(zhì)TNF- α的含量，通過(guò)降低組織中 NF- κ Β ρ65，I κ Β α和IKK β的磷酸化，抑制NF- κ Β信號(hào)通路的活化，對(duì)膿毒素血癥急性 腎損傷具有明顯保護(hù)作用。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1為丹皮酚預(yù)處理對(duì)脂多糖所致腎臟組織病理的影響顯微觀察組織細(xì)胞圖。 [0011] 圖2為丹皮酚預(yù)處理對(duì)脂多糖所致腎臟組織病理的影響觀察結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖。
[0012] 圖3為丹皮酚預(yù)處理對(duì)NF-K B信號(hào)通路活性的影響顯微觀察組織細(xì)胞圖。
[0013] 圖4為丹皮酚預(yù)處理對(duì)NF- κ B信號(hào)通路活性的影響觀察結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖。
[0014] 圖5為免疫印跡法檢測(cè)NF- κ B信號(hào)通路中p65的表達(dá)水平和磷酸化程度結(jié)果統(tǒng) 計(jì)圖。
[0015] 圖6為免疫印跡法檢測(cè)NF- κ B信號(hào)通路中IKK β的表達(dá)水平和磷酸化程度結(jié)果 統(tǒng)計(jì)圖。
[0016] 圖7為免疫印跡法檢測(cè)NF- κ Β信號(hào)通路中I κ Β α的表達(dá)水平和磷酸化程度結(jié)果 統(tǒng)計(jì)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0017] 為了更好地理解和實(shí)施本發(fā)明，下面結(jié)合具體藥理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明本發(fā)明： 1、建立模型及給藥 昆明小鼠，雄性，體重18-22g，按體重隨機(jī)分為：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、丹皮酚低劑 量組（20mg/kg)、丹皮酚高劑量組（40mg/kg)，每組10只。正常對(duì)照組、模型對(duì)照組均分別 灌胃給予相應(yīng)體積的生理鹽水；大黃酸組灌胃給藥相應(yīng)劑量的藥物，每天一次，時(shí)間固定， 連續(xù)給藥7天。末次給藥后，除正常對(duì)照組外，其余各組按50mg/kg腹腔注射內(nèi)毒素建立內(nèi) 毒素急性腎損傷模型，正常對(duì)照組按相同劑量注射生理鹽水。
[0018] 2、觀察項(xiàng)目及方法 1)組織形態(tài)學(xué)觀察 小鼠自腹腔注射內(nèi)毒素脂多糖LPS( E. coil 055: B5 )后觀察小鼠飲食、飲水、活動(dòng)、 大便等一般狀況并做記錄。12小時(shí)后，脫頸椎處死小鼠解剖收集雙側(cè)腎臟標(biāo)本大體觀察： 肉眼觀察腎臟形態(tài)、色澤、包膜等的改變。取腎臟經(jīng)10%甲醛中固定，石蠟包埋，切片5μπι 厚，HE染色后觀察，并根據(jù)腎小管病變程度進(jìn)行Paller評(píng)分【Paller MS，Hoidal JR， Fen' is TF. Oxygen free radicals in ischemie acute renal failure in the rat. J Clin Invest，1984,74⑷：1156-1164.】，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：腎小管明顯擴(kuò)張、上皮細(xì)胞扁平為1 分，腎小管管腔內(nèi)有脫落壞死的上皮細(xì)胞、但未成管型或細(xì)胞碎片為1分，腎小管管腔內(nèi)出 現(xiàn)管型為2分，上皮細(xì)胞顆粒變性為1分，上皮細(xì)胞空泡變性為1分，上皮細(xì)胞核固縮為1 分。在400倍光鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野選擇10個(gè)腎小管進(jìn)行計(jì)分。
[0019] 2)血清中BUN、SCr及TNF-α的含量檢測(cè) 眼內(nèi)眥取血液放入小試管中，靜置，血液凝固后，3000轉(zhuǎn)離心lOmin，吸取血清，按血尿 素氮（blood tireanitrogen，BUN)和血肌肝（serum ereatinine，SCr)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作， 采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血漿BUN和SCr含量。采用ELISA法測(cè)定血清中TNF- α含量。
[0020] 3)腎臟組織中NF- Κ Β信號(hào)通路活性檢測(cè) 免疫組化法檢測(cè)NF-κ Β在腎臟組織中的定位與表達(dá)。采用免疫印跡法分別檢測(cè)總 NF-κ Β ρ65、磷酸化的NF-κ Β ρ65,總ΙΚΚβ、磷酸化的ΙΚΚβ及總I κ Βα和磷酸化的 I κ Β α?；瘜W(xué)發(fā)光法顯影后，采用DigDoclOO軟件系統(tǒng)分析光密度值，結(jié)果用總蛋白條帶與 相應(yīng)的磷酸化蛋白條帶光密度值比值表示蛋白磷酸化程度。
[0021] 3、結(jié)果 1)丹皮酚預(yù)處理對(duì)脂多糖所致小鼠一般情況的影響 實(shí)驗(yàn)中，觀察正常對(duì)照組小鼠，均活動(dòng)自如，進(jìn)食正常，無(wú)病態(tài)。給予脂多糖后小鼠出現(xiàn) 煩燥不安，蜷縮萎糜，拒絕食水，懶于活動(dòng)，抓取時(shí)逃避無(wú)力，毛發(fā)失去光澤并且凌亂，糞便 呈稀水樣；上述癥狀可隨著時(shí)間的進(jìn)展而加重。但在給予丹皮酚預(yù)處理后，小鼠的上述癥狀 可減輕，小鼠能夠進(jìn)食、飲水與活動(dòng)，毛發(fā)也較為整潔且有光澤，各組均無(wú)小鼠死亡。
[0022] 2)丹皮酚預(yù)處理對(duì)脂多糖所致腎臟組織病理的影響 與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組腎損害嚴(yán)重，腎小管顯著混濁、腫脹、變性，充滿蛋白管 型。腎小管上皮細(xì)胞扁平，出現(xiàn)大量濁腫現(xiàn)象，細(xì)胞核淡染，部分核出現(xiàn)濃縮、破碎甚至溶 解，腎問(wèn)質(zhì)水腫，有散在淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及漿細(xì)胞浸潤(rùn)，并有纖維素滲出；丹皮酚低劑量組腎 損害和模型組比較明顯減輕，可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)濃染，胞漿疏松化，腎間質(zhì)水腫減輕，腎小 囊腔略擴(kuò)張；丹皮酚高劑量組病變輕微，腎小管上皮細(xì)胞水腫明顯減輕，僅見(jiàn)少量腎小管上 皮細(xì)胞空泡化，未見(jiàn)腔內(nèi)管型，無(wú)腎間質(zhì)水腫，腎小囊大致正常。通過(guò)組織病理評(píng)分，可明顯 看出，模型組小鼠組織病理評(píng)分較高。丹皮酚預(yù)處理后，能明顯降低評(píng)分指數(shù)，其中高劑量 組組織病理評(píng)分與模型組比較有顯著差異（P〈〇. 01)。顯微觀察圖請(qǐng)見(jiàn)圖1，統(tǒng)計(jì)圖表請(qǐng)見(jiàn) 圖2。
[0023] 圖2中丹皮酚對(duì)小鼠組織病理變化的影響與正常組比較，###P〈0. 001 ;與模型組 比較，*Ρ〈〇·〇5，**Ρ〈0·01。
[0024] 3)血清中BUN、SCr及TNF- α含量的變化 腎損傷后，血清中的尿素氮和血肌酐含量的變化與腎損傷密切相關(guān)，常作為腎損傷嚴(yán) 重程度的重要指標(biāo)用于對(duì)腎功能的進(jìn)行評(píng)估。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型對(duì)照組與正常對(duì)照組相 t匕，小鼠血清中BUN和SCr含量顯著升高（Ρ〈0. 01)，給予丹皮酚預(yù)治療后，能顯著降低BUN 和SCr含量（P〈0. 05)。在脂多糖的誘導(dǎo)下，體內(nèi)產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)，其中認(rèn)為腫瘤壞死因 子（TNFa )是介導(dǎo)膿毒血癥的關(guān)鍵性細(xì)胞因子之一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腹腔注射脂多糖后，血 清中TNF-α含量顯著升高（P〈0. 05)，給予丹皮酚預(yù)治療后，與模型組比較，各劑量組均能 降低血清中TNF-α含量，其中高劑量組與模型組比較有顯著差異（P〈〇. 01)。（見(jiàn)表1) 表1丹皮酚對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠血清中BUN、SCr及TNF- a含量的影響（

【權(quán)利要求】
1.丹皮酚在制備治療急性腎損傷藥物方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P13/12GK104188944SQ201410473941
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月17日
【發(fā)明者】齊棟, 范華英, 于晨, 趙烽, 陳大全 申請(qǐng)人:齊棟