一種原位固化組織工程支架及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種原位固化組織工程支架，由聚丙交酯-乙交酯和生物可降解微球在極性有機(jī)溶劑的存在下原位固化形成。本發(fā)明提供的原位固化組織工程支架以生物可降解微球作為致孔劑，原位固化組織工程支架中的微球逐漸降解，其孔結(jié)構(gòu)逐漸形成，孔隙率逐漸增加，可以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)由外而內(nèi)梯度致孔，使其孔隙形成與組織長(zhǎng)入相匹配。在本發(fā)明提供的原位固化組織工程支架的原位固化初期，由于部分未降解的致孔劑的存在，使得本發(fā)明提供的原位固化組織工程支架的初始強(qiáng)度明顯提高。另外，本發(fā)明提供的原位固化組織工程支架以生物可降解微球?yàn)橹驴讋?，生物相容性好，避免了由鹽等粒子的高滲對(duì)組織細(xì)胞的損傷。
【專利說明】一種原位固化組織工程支架及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種原位固化組織工程支架及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年因疾病、創(chuàng)傷、腫瘤等造成的骨缺損病人超過100萬，且呈上升 趨勢(shì)。自體骨移植和同種異體骨移植是目前治療骨缺損的主要方法。然而，自體骨來源有 限，且對(duì)供體部位造成新的缺損，應(yīng)用受到限制。同種異體骨骨誘導(dǎo)能力較自體骨差，且存 在排斥反應(yīng)和疾病傳播的危險(xiǎn)性。近年來，越來越多的無機(jī)合成材料或有機(jī)合成高分子材 料被研究和開發(fā)作為組織工程支架或骨修復(fù)材料，并且逐步應(yīng)用于臨床。
[0003] 而可注射的組織工程生物支架可解決以上出現(xiàn)的問題。骨修復(fù)材料通過注射的途 徑到達(dá)骨缺損部位，迅速完全填充缺損部位，實(shí)現(xiàn)移植材料與宿主骨缺損的完全匹配，可有 效刺激骨組織的應(yīng)力生長(zhǎng)。這種無創(chuàng)手術(shù)還避免了周圍軟組織的再次損傷，手術(shù)時(shí)間短，成 本低，更容易為患者所接受，有利于醫(yī)用新材料的推廣和應(yīng)用。
[0004] 原位成形移植物（in situ forming implants, ISI)是一種可注射的生物醫(yī)用材 料，是將高分子聚合物溶于可與水互溶的有機(jī)溶劑中，將得到的混合物注射入組織內(nèi)后，有 機(jī)溶劑迅速被組織中的水置換，高分子聚合物原位成形固化。
[0005] 2009年凱斯西儲(chǔ)大學(xué)Krebs等將PLGA(聚丙交酯-乙交酯）溶于三縮四乙二醇中， 以鈉鹽顆粒作為致孔劑制備出多孔的可注射的骨修復(fù)材料。2012年德國(guó)科學(xué)家Schloegl 通過調(diào)整PLGA、a-TCP、有機(jī)溶劑及鈉鹽（致孔劑）的不同比例優(yōu)化支架，經(jīng)過優(yōu)化的支架 材料孔隙率可達(dá)到81· 2% -91. 5%。但是，上述技術(shù)均以鈉鹽作為致孔劑，鈉鹽隨支架注射 進(jìn)入組織后，初始機(jī)械強(qiáng)度較小，僅為〇· 285MPa，無法滿足承重部位的修復(fù)需要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種原位固化組織工程支架及其制備方法，本發(fā)明提供的 原位固化組織工程支架具有較高的初始機(jī)械強(qiáng)度，且其制備方法簡(jiǎn)單。
[0007] 本發(fā)明提供一種原位固化組織工程支架，由聚丙交酯-乙交酯和生物可降解微球 在極性有機(jī)溶劑的存在下原位固化形成。
[0008] 優(yōu)選的，所述生物可降解微球?yàn)槊髂z微球、聚丙交酯-乙交酯微球、海藻酸鹽微球 和殼聚糖微球中的一種或幾種。
[0009] 優(yōu)選的，所述生物可降解微球的粒徑為100?450 μ m。
[0010] 優(yōu)選的，所述聚丙交酯-乙交酯的數(shù)均分子量為50000?200000。
[0011] 優(yōu)選的，所述聚丙交酯-乙交酯與生物可降解微球的質(zhì)量比為（1?9) : (9?1)。
[0012] 優(yōu)選的，所述極性有機(jī)溶劑為1-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基亞砜、四甘醇和乙酸乙 酯中的一種或幾種。
[0013] 優(yōu)選的，所述原位固化組織工程支架的孔隙率為70?95%。
[0014] 優(yōu)選的，所述原位固化組織工程支架還包括羥基磷灰石。
[0015] 優(yōu)選的，所述生物可降解微球?yàn)閾?dān)載活性蛋白的生物可降解微球。
[0016] 本發(fā)明提供一種原位固化組織工程支架的制備方法，包括以下步驟：
[0017] 將聚丙交酯-乙交酯、生物可降解微球和極性有機(jī)溶劑混合，經(jīng)原位固化，得到原 位固化組織工程支架。
[0018] 本發(fā)明提供了一種原位固化組織工程支架，由聚丙交酯-乙交酯和生物可降解微 球在極性有機(jī)溶劑的存在下原位固化形成。本發(fā)明提供的原位固化組織工程支架以生物 可降解微球作為致孔劑，將所述原位固化成孔組織注射至體內(nèi)修復(fù)部位，極性有機(jī)溶劑被 體液中的水置換，于原位快速固化成型。由于所述生物可降解微球的降解速率較聚丙交 酯-乙交酯快，逐漸降解成孔，引導(dǎo)組織長(zhǎng)入，最后材料完全降解被修復(fù)組織替代，達(dá)到修 復(fù)目的。本發(fā)明提供的原位固化組織工程支架中的微球逐漸降解，其孔結(jié)構(gòu)逐漸形成，孔隙 率逐漸增加，可以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)由外而內(nèi)梯度致孔，使其孔隙形成與組織長(zhǎng)入相匹配。在本發(fā)明 提供的原位固化組織工程支架的原位固化初期，由于部分未降解的致孔劑的存在，使得本 發(fā)明提供的原位固化組織工程支架的初始強(qiáng)度明顯提高。并且，本發(fā)明所述原位固化組織 工程支架的制備方法簡(jiǎn)單。
[0019] 另外，本發(fā)明提供的原位固化組織工程支架以生物可降解微球?yàn)橹驴讋?，生物?容性好，避免了由鹽等粒子的高滲對(duì)組織細(xì)胞的損傷。
[0020] 進(jìn)一步的，所述生物可降解微球作為致孔劑的同時(shí)還可以擔(dān)載生長(zhǎng)因子等活性蛋 白或其它藥物，致孔劑微球可有效保護(hù)蛋白藥物活性，避免了活性生長(zhǎng)因子與有機(jī)溶劑的 直接接觸而喪失活性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù) 提供的附圖獲得其他的附圖。
[0022] 圖1為本發(fā)明提供的原位固化組織工程支架的制備過程示意圖；
[0023] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1?9得到的原位固化組織工程支架的機(jī)械強(qiáng)度圖；
[0024]圖3為本發(fā)明實(shí)施例1得到的原位固化組織工程支架的掃描電鏡圖。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 本發(fā)明提供了一種原位固化組織工程支架，由聚丙交酯-乙交酯和生物可降解微 球在極性有機(jī)溶劑的存在下原位固化形成。
[0026] 本發(fā)明提供的原位固化組織工程支架具有較高的初始機(jī)械強(qiáng)度、較好的生物相容 性和擔(dān)載蛋白藥物的能力等優(yōu)點(diǎn)。
[0027] 本發(fā)明提供的原位固化組織工程支架由聚丙交酯-乙交酯和生物可降解微球在 極性有機(jī)溶劑的存在下原位固化形成。在本發(fā)明中，所述原位固化組織工程支架的孔隙率 優(yōu)選為70?95%，更優(yōu)選為75?90%，最優(yōu)選為80?85%。
[0028] 在本發(fā)明中，所述聚丙交酯-乙交酯（PLGA)的數(shù)均分子量?jī)?yōu)選為50000? 200000,更優(yōu)選為55000?195000,最優(yōu)選為60000?190000,本發(fā)明對(duì)所述聚丙交酯-乙 交酯的來源沒有特殊的限制，可采用所述聚丙交酯-乙交酯的市售商品，也可按照本領(lǐng)域 技術(shù)人員熟知的制備聚丙交酯-乙交酯的技術(shù)方案自行制備。
[0029] 在本發(fā)明中，所述生物可降解微球優(yōu)選為明膠微球、聚丙交酯-乙交酯微球、海藻 酸鹽微球和殼聚糖微球中的一種或幾種，更優(yōu)選為明膠微球、海藻酸鹽微球和殼聚糖微球 中的一種或幾種，最優(yōu)選為明膠微球；所述生物可降解微球的粒徑優(yōu)選為100?450μπι，更 優(yōu)選為150?400 μ m，最優(yōu)選為200?350 μ m ;所述聚丙交酯-乙交酯與生物可降解微球 的質(zhì)量比優(yōu)選為（1?9) : (9?1)，更優(yōu)選為（1.5?8. 5) :(8. 5?1.5)，最優(yōu)選為（2? 8) : (8?2)。為了使所述的原位固化組織工程支架具有一定的功能性，在本發(fā)明中，所述 生物可降解微球優(yōu)選為擔(dān)載有活性蛋白的生物可降解微球，本發(fā)明對(duì)所述活性蛋白種類和 用量沒有特殊的限制，根據(jù)實(shí)際的需求采用適當(dāng)?shù)幕钚缘鞍准纯?。如，可采用骨形態(tài)發(fā)生蛋 白、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和類胰島素生長(zhǎng)因子中的一種或幾種。
[0030] 本發(fā)明對(duì)所述生物可降解微球的來源沒有特殊的限制，在本發(fā)明中，所述生物可 降解微球優(yōu)選按照以下步驟進(jìn)行制備：
[0031] A)將生物可降解材料與水混合，得到生物可降解材料溶液；
[0032] B)將液體石蠟、山梨糖醇酐油酸酯和所述步驟A)得到的生物可降解微球溶液混 合，得到混合物；
[0033] C)將所述步驟B)得到的混合物進(jìn)行過濾，得到生物可降解微球。
[0034] 本發(fā)明將生物可降解材料與水混合，得到生物可降解材料溶液，本發(fā)明優(yōu)選將所 述生物可降解材料與去離子水混合，得到生物可降解材料溶液。在本發(fā)明中，所述生物可 降解材料優(yōu)選為明膠、聚丙交酯-乙交酯、海藻酸鹽和殼聚糖中的一種或幾種，更優(yōu)選為明 膠、海藻酸鹽和殼聚糖中的一種或幾種，最優(yōu)選為明膠；所述混合的溫度優(yōu)選為30?40°C， 更優(yōu)選為35?38°C，最優(yōu)選為37°C ;所述生物可降解材料溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為15? 25%，更優(yōu)選為18?22%，最優(yōu)選為19?20%。
[0035] 得到生物可降解材料溶液后，本發(fā)明優(yōu)選將所述生物可降解材料溶液進(jìn)行高壓滅 菌，所述高壓滅菌的壓強(qiáng)優(yōu)選為100?150kPa，更優(yōu)選為120 kPa ;所述高壓滅菌的時(shí)間優(yōu) 選為20?30分鐘，更優(yōu)選為25分鐘。
[0036]為了使所述生物可降解微球具有一定的功能性，本發(fā)明優(yōu)選將得到的生物可降解 材料溶液與活性蛋白混合，得到擔(dān)載有活性蛋白的生物可降解材料溶液。在本發(fā)明中，所述 活性蛋白的種類和用量與上述技術(shù)方案中活性蛋白的種類和用量一致，在此不再贅述。本 發(fā)明對(duì)所述生物可降解材料溶液與活性蛋白的混合方法沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù) 人員熟知的混合方法即可。
[0037]得到生物可降解材料溶液后，本發(fā)明將液體石蠟、山梨糖醇酐油酸酯（Span-80) 和所述生物可降解材料溶液混合，得到混合物。本發(fā)明優(yōu)選將所述液體石蠟和Span-80 混合，然后再與所述生物可降解材料溶液混合，得到混合物。本發(fā)明對(duì)所述液體石蠟和 Span_8〇的來源沒有特殊的限制，采用所述液體石蠟和Span-80的市售商品即可。在本發(fā) 明中，所述液體石蠟和Span-80的體積比優(yōu)選為（350?500) :1，更優(yōu)選為（400?450): 1，本發(fā)明優(yōu)選在水浴條件下，進(jìn)行所述液體石蠟和Span-80的混合，所述水浴的溫度優(yōu)選 為30?40?，更優(yōu)選為 35?38°C，最優(yōu)選為37Γ，本發(fā)明對(duì)所述水浴的時(shí)間沒有特殊的限 制，能夠使所述液體石蠟和Span-80混合均勻即可。
[0038] 完成所述液體石蠟和Span-80的混合后，本發(fā)明優(yōu)選將所述生物可降解材料溶液 加入得到的液體石蠟和Span-80的混合物中，進(jìn)行攪拌，得到混合物。本發(fā)明更優(yōu)選將所述 生物可降解材料溶液加入得到的液體石蠟和Span-80的混合物中，進(jìn)行第一攪拌，完成所 述第一攪拌后,將第一攪拌的產(chǎn)物在冰浴的條件下進(jìn)行第二攪拌，得到混合物。在本發(fā)明 中，所述生物可降解材料溶液與液體石蠟的體積比優(yōu)選為1 : (1?3)，更優(yōu)選為1: (1. 5? 2. 5)，最優(yōu)選為1 :2 ;所述第一攪拌的時(shí)間優(yōu)選為3?lOmin，更優(yōu)選為4?9min ;所述第 一攪拌的速度優(yōu)選為100?300rpm，更優(yōu)選為200rpm ;所述第一攪拌的溫度優(yōu)選為30? 40°C，更優(yōu)選為35?38°C,最優(yōu)選為37°C ;所述第二攪拌的溫度優(yōu)選為0?4°C，更優(yōu)選為 2°C ;所述第二攪拌的時(shí)間優(yōu)選為50?80min，更優(yōu)選為60?70min ;所述第二攪拌的速度 優(yōu)選為100?300rpm，更優(yōu)選為200rpm。
[0039] 得到混合物后，本發(fā)明將所述混合物進(jìn)行過濾，得到生物可降解微球。本發(fā)明優(yōu)選 采用濾網(wǎng)進(jìn)行過濾，所述濾網(wǎng)的孔徑優(yōu)選為100?450 μ m，更優(yōu)選為200?400 μ m，最優(yōu)選 為3〇0 μ m。本發(fā)明對(duì)所述過濾的方法沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的過濾的 技術(shù)方案即可。
[0040] 完成所述過濾后，本發(fā)明優(yōu)選將過濾得到的生物可降解微球進(jìn)行干燥，得到千 燥的生物可降解微球。本發(fā)明優(yōu)選將過濾得到的生物可降解微球進(jìn)行冷凍干燥，得到干 燥的生物可降解微球。在本發(fā)明中，所述冷凍干燥的溫度優(yōu)選為-80?-20°C，更優(yōu)選 為-50?_30°C，最優(yōu)選為-45?-35°C;所述冷凍干燥的時(shí)間優(yōu)選為18?30小時(shí)，更優(yōu)選 為20?26小時(shí)。
[0041] 完成所述干燥后，本發(fā)明優(yōu)選將干燥的生物可降解微球進(jìn)行清洗，得到清洗后的 生物可降解微球。本發(fā)明優(yōu)選采用無水酒精對(duì)所述干燥的生物可降解微球進(jìn)行清洗，得到 清洗后的生物可降解微球。本發(fā)明對(duì)所述無水酒精的來源和用量沒有特殊的限制，能夠?qū)?所述千燥的生物可降解微球清洗干凈即可。本發(fā)明對(duì)所述清洗的次數(shù)沒有特殊的限制，能 夠?qū)⑺龈稍锏纳锟山到馕⑶蚯逑锤蓛艏纯伞?br> [0042] 在本發(fā)明中，所述極性有機(jī)溶劑優(yōu)選為1-甲基-2-吡咯烷酮（NMP)、二甲基亞砜 (DMS0)、四甘醇和乙酸乙酯中的一種或幾種，更優(yōu)選為1-甲基-2-吡咯烷酮和/或二甲基 亞砜、最優(yōu)選為1-甲基-2-吡咯烷酮，所述聚丙交酯-乙交酯與極性有機(jī)溶劑的質(zhì)量比優(yōu) 選為1 : (2. 5?5)，更優(yōu)選為1 : (2. 8?4. 5)，最優(yōu)選為1 : (3?4)。
[0043] 在本發(fā)明中，為了使本發(fā)明提供的原位固化組織工程支架在骨組織修復(fù)中有更好 的應(yīng)用，所述原位固化組織工程支架優(yōu)選還包括羥基磷灰石（HA)，羥基磷灰石是人體骨骼 的主要成分，將羥基磷灰石植入體內(nèi)可誘導(dǎo)骨組織的生長(zhǎng)。在本發(fā)明中，所述HA與PLGA的 質(zhì)量比優(yōu)選為1 : (10?1.5)，更優(yōu)選為1 : (9?2)，最優(yōu)選為1 : (8?3)。本發(fā)明對(duì)所述HA 的來源沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的HA即可。
[0044]本發(fā)明還提供了一種原位固化組織工程支架的制備方法，包括以下步驟：
[0045] 將聚丙交酯-乙交酯、生物可降解微球和極性有機(jī)溶劑混合，經(jīng)原位固化，得到原 位固化組織工程支架。
[0046] 本發(fā)明優(yōu)選將聚丙交酯-乙交酯（PLGA)與極性有機(jī)溶劑混合，得到PLGA溶液，將 生物可降解微球與所述的PLGA溶液混合，經(jīng)原位固化，得到原位固化組織工程支架。為了 使得到的原位固化組織工程支架能夠應(yīng)用于骨組織修復(fù)，本發(fā)明優(yōu)選將PLGA、極性有機(jī)溶 劑和羥基磷灰石（HA)混合，得到PLGA溶液，將生物可降解微球與所述的PLGA溶液混合，經(jīng) 原位固化，得到原位固化組織工程支架。在本發(fā)明中，所述PLGA、極性有機(jī)溶劑和HA的來源 和用量與上述技術(shù)方案中PLGA、極性有機(jī)溶劑和HA的來源和用量一致，在此不再贅述。在 本發(fā)明中，所述PLGA、極性有機(jī)溶劑和HA的混合的溫度優(yōu)選為60?80?，更優(yōu)選為65? 75°C。本發(fā)明對(duì)所述PLGA、極性有機(jī)溶劑和HA的混合沒有特殊的限制，本發(fā)明優(yōu)選對(duì)其進(jìn) 行第三攪拌，完成所述PLGA、極性有機(jī)溶劑和HA的混合，本發(fā)明對(duì)所述第三攪拌的方法沒 有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的攪拌的技術(shù)方案即可。
[0047] 得到PLGA溶液后，本發(fā)明將所述生物可降解微球與所述PLGA溶液混合，得到可 注射的原位固化組織工程支架，所述可注射的原位固化組織工程支架經(jīng)原位固化，得到原 位固化組織工程支架。在本發(fā)明中，所述生物可降解微球的來源和用量與上述技術(shù)方案中 生物可降解微球的來源和用量一致，在此不再贅述。本發(fā)明對(duì)所述生物可降解微球與所述 PLGA溶液的混合方法沒有特殊的限制，本發(fā)明優(yōu)選對(duì)其進(jìn)行第四攪拌，完成所述生物可降 解微球與所述PLGA溶液的混合。本發(fā)明對(duì)所述第四攪拌的方法沒有特殊的限制，采用本領(lǐng) 域技術(shù)人員常用的攪拌技術(shù)方案將所述生物可降解微球與所述PLGA溶液攪拌均勻即可。
[0048] 得到可注射的原位固化組織工程支架后，本發(fā)明優(yōu)選將所述可注射原位固化組織 工程支架注射至水溶液中，進(jìn)行原位固化，得到原位固化組織工程支架。本發(fā)明對(duì)所述注射 的方法沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的注射的技術(shù)方案即可。本發(fā)明對(duì)所述 可注射的原位固化組織工程支架的用量沒有特殊的限制，根據(jù)實(shí)際需求采用適當(dāng)?shù)挠昧考?可。
[0049] 參見圖1，圖1為本發(fā)明提供的原位固化組織工程支架的制備過程示意圖。1為將 生物可降解微球加入PLGA溶液中，2為得到的可注射的原位固化組織工程支架，3為將可注 射的原位固化組織工程支架注射至水溶液中進(jìn)行原位固化。由圖1可以看出，本發(fā)明提供 的原位固化組織工程支架制備方法簡(jiǎn)單，易于操作。
[0050] 本發(fā)明按照GT/T 1041-92標(biāo)準(zhǔn)，采用直接加壓的方法測(cè)定了得到的原位固化 組織工程支架在固化l〇min的機(jī)械強(qiáng)度。結(jié)果表明，本發(fā)明提供的原位固化組織工程支 架的初始機(jī)械強(qiáng)度能夠達(dá)到2. 8MPa，較現(xiàn)有的原位固化組織工程支架的初始機(jī)械強(qiáng)度 0. 285MPa 提高了 10 倍。
[0051] 本發(fā)明按照液體置換法（liquid displacement)測(cè)定了得到的原位固化組織工程 支架的孔隙率，結(jié)果表明，本發(fā)明提供的原位固化組織工程支架的孔隙率可達(dá)92%，得到的 支架孔隙率較高，有利于骨組織的原位生長(zhǎng)。
[0052] 本發(fā)明提供了一種原位固化組織工程支架，由聚丙交酯-乙交酯和生物可降解微 球在極性有機(jī)溶劑的存在下原位固化形成。本發(fā)明提供的原位固化組織工程支架以生物 可降解微球作為致孔劑，將所述原位固化成孔組織注射至體內(nèi)修復(fù)部位，極性有機(jī)溶劑被 體液中的水置換，于原位快速固化成型。由于所述生物可降解微球的降解速率較聚丙交 酯-乙交酯快，逐漸降解成孔，引導(dǎo)組織長(zhǎng)入，最后材料完全降解被修復(fù)組織替代，達(dá)到修 復(fù)目的。本發(fā)明提供的原位固化組織工程支架中的微球逐漸降解，其孔結(jié)構(gòu)逐漸形成，孔隙 率逐漸增加，可以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)由外而內(nèi)梯度致孔，使其孔隙形成與組織長(zhǎng)入相匹配。在本發(fā)明 提供的原位固化組織工程支架的原位固化初期，由于部分未降解的致孔劑的存在，使得本 發(fā)明提供的原位固化組織工程支架的初始強(qiáng)度明顯提高。另外，本發(fā)明提供的原位固化組 織工程支架以生物可降解微球?yàn)橹驴讋?，生物相容性好，避免了由鹽等粒子的高滲對(duì)組織 細(xì)胞的損傷。
[0053]進(jìn)一步的，所述生物可降解微球作為致孔劑的同時(shí)還可以擔(dān)載生長(zhǎng)因子等活性蛋 白或其它藥物，致孔劑微球可有效保護(hù)蛋白藥物活性，避免了活性生長(zhǎng)因子與有機(jī)溶劑的 直接接觸而喪失活性。
[0054] 為了進(jìn)一步說明本發(fā)明，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的一種原位固化組織工程 支架及其制備方法進(jìn)行詳細(xì)描述，但不能將其理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。
[0055] 實(shí)施例1
[0056]將明膠溶解于3TC的去離子水中配制得到質(zhì)量濃度為25%的明膠溶液，然后在 120kPa下高壓滅菌后，將骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2)加入到明膠溶液中，得到BMp_2的濃度為 500ng/mL的明膠溶液。
[0057] 將20mL液體石蠟和50 μ L的Span_8〇加入到燒杯中，37°C水浴條件下攪拌均勻， 取10mL明膠溶液加入其中，在2〇〇rpm轉(zhuǎn)速下攪拌i〇min，然后保持轉(zhuǎn)速不變，轉(zhuǎn)入到4Γ的 冰浴條件下，持續(xù)攪拌lh，得到混合物。
[0058] 使用孔徑為300 μ m的濾網(wǎng)過濾，將過濾得到的微球在-5(TC下冷凍千燥24h。
[0059]用無水酒精快速反復(fù)清洗干燥后的明膠微球，即得到明膠微球。
[0060] 在80°c下，將3gPLGA溶于lOgNMP中，加入lgHA，攬拌均勻，得到PLGA溶液。 [0061] 將5gPLGA溶液與5g明膠微球混合，攪拌至均質(zhì)，得到可注射的原位固化組織工程 支架。所述可注射的原位固化組織工程支架中含10. 3%的PLGA，3. 7%的HA、50%的明膠微 球和36%的NMP。
[0062]將可注射的原位固化組織工程支架注射至水溶液中，進(jìn)行原位固化，得到原位固 化組織工程支架。
[0063]本發(fā)明測(cè)試了本實(shí)施例得到的原位固化組織工程支架在固化i〇min的機(jī)械強(qiáng)度， 結(jié)果如圖2所示，圖2為本發(fā)明實(shí)施例1?9得到的原位固化組織工程支架的機(jī)械強(qiáng)度圖。 [0064]本發(fā)明測(cè)試了本實(shí)施例得到的原位固化組織工程支架的孔隙率，結(jié)果表明，本實(shí) 施例得到的原位固化組織工程支架的孔隙率為92%。
[0065]本發(fā)明對(duì)本實(shí)施例得到的原位固化組織工程支架進(jìn)行了掃描電鏡測(cè)試，結(jié)果如圖 3所示，圖3為本發(fā)明實(shí)施例1得到的原位固化組織工程支架的掃描電鏡圖。在圖3中，i 和2為本實(shí)施例得到的原位固化組織工程支架斷面的掃描電鏡圖；3為本實(shí)施例得到的原 位固化組織工程支架表面的掃描電鏡圖。由圖3可以看出，本實(shí)施例得到的原位固化組織 工程支架的孔隙率較高，且孔隙分布均勻。
[0066] 實(shí)施例2
[0067]將明膠溶解于3rc的去離子水中配制得到質(zhì)量濃度為25%的明膠溶液，然后在 123kPa下高壓滅菌后，將骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2)加入到明膠溶液中，得到bmp-2的濃度為 500ng/mL的明膠溶液。
[0068] 將20mL液體石錯(cuò)和5〇 μ L的Span-80加入到燒杯中，37°C水浴條件下攪拌均勻， 取10mL明膠溶液加入其中，在200rpm轉(zhuǎn)速下攪拌l〇min，然后保持轉(zhuǎn)速不變，轉(zhuǎn)入到4°C的 冰浴條件下，持續(xù)攪拌lh，得到混合物。
[0069]使用孔徑為3〇〇 μ m的濾網(wǎng)過濾，將過濾得到的微球在-4(TC下冷凍千燥24h。
[0070]用無水酒精快速反復(fù)清洗干燥后的明膠微球，即得到明膠微球。
[0071] 在8〇°C下，將3gPLGA溶于lOgNMP中，加入igHA,攪拌均勻，得到PLGA溶液。 [0072]將6gPLGA溶液與4g明膠微球混合，攪拌至均質(zhì)，得到可注射的原位固化組織工程 支架。所述可注射的原位固化組織工程支架中含13%的PLGA，4%的HA、40%的明膠微球和 43%的陋卩。
[0073]將可注射的原位固化組織工程支架注射至水溶液中，進(jìn)行原位固化，得到原位固 化組織工程支架。
[0074]本發(fā)明測(cè)試了本實(shí)施例得到的原位固化組織工程支架在固化lOmin的機(jī)械強(qiáng)度， 結(jié)果如圖2所示，圖2為本發(fā)明實(shí)施例1?9得到的原位固化組織工程支架的機(jī)械強(qiáng)度圖。 [0075]本發(fā)明測(cè)試了本實(shí)施例得到的原位固化組織工程支架的孔隙率，結(jié)果表明，本實(shí) 施例得到的原位固化組織工程支架的孔隙率為86 %。
[0076] 實(shí)施例3
[0077]將明膠溶解于37°C的去離子水中配制得到質(zhì)量濃度為25%的明膠溶液，然后在 l23kPa下高壓滅菌后，將骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2)加入到明膠溶液中，得到BMP-2的濃度為 500ng/mL的明膠溶液。
[0078] 將2〇mL液體石蠟和5〇 μ L的Span_8〇加入到燒杯中，37°C水浴條件下攪拌均勻， 取10mL明膠溶液加入其中，在200rpm轉(zhuǎn)速下攪拌lOmin，然后保持轉(zhuǎn)速不變，轉(zhuǎn)入到4°C的 冰浴條件下，持續(xù)攪拌lh，得到混合物。
[0079] 使用孔徑為300 μ m的濾網(wǎng)過濾，將過濾得到的微球在-5(TC下冷凍千燥24h。
[0080]用無水酒精快速反復(fù)清洗干燥后的明膠微球，即得到明膠微球。
[0081] 在8〇°C下，將3gPLGA溶于lOgNMP中，加入igHA,攪拌均勻，得到PLGA溶液。 [0082] 將7gPLGA溶液與3g明膠微球混合，攪拌至均質(zhì)，得到可注射的原位固化組織工程 支架。所述可注射的原位固化組織工程支架中含15%的PLGA，5%的HA、30%的明膠微球和 50%的匪卩。
[0083]將可注射的原位固化組織工程支架注射至水溶液中，進(jìn)行原位固化，得到原位固 化組織工程支架。
[0084] 本發(fā)明測(cè)試了本實(shí)施例得到的原位固化組織工程支架在固化l〇min的機(jī)械強(qiáng)度， 結(jié)果如圖2所示，圖2為本發(fā)明實(shí)施例1?9得到的原位固化組織工程支架的機(jī)械強(qiáng)度圖。 [0085]本發(fā)明測(cè)試了本實(shí)施例得到的原位固化組織工程支架的孔隙率，結(jié)果表明，本實(shí) 施例得到的原位固化組織工程支架的孔隙率為83%。
[0086] 實(shí)施例4
[0087]將明膠溶解于37°C的去離子水中配制得到質(zhì)量濃度為25%的明膠溶液，然后在 12：3kPa下高壓滅菌后，將骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2)加入到明膠溶液中，得到BMP-2的濃度為 500ng/mL的明膠溶液。
[0088] 將20mL液體石賭和50 μ L的Span-80加入到燒杯中，37°C水浴條件下攪拌均勻， 取10mL明膠溶液加入其中，在200rpm轉(zhuǎn)速下攪拌lOmin，然后保持轉(zhuǎn)速不變，轉(zhuǎn)入到4°C的 冰浴條件下，持續(xù)攪拌lh，得到混合物。
[0089] 使用孔徑為300 μ m的濾網(wǎng)過濾，將過濾得到的微球在-50°C下冷凍千燥24h。 [0090]用無水酒精快速反復(fù)清洗干燥后的明膠微球，即得到明膠微球。
[0091] 在80°c下，將3gPLGA溶于lOgNMP中，加入2gHA，攪拌均勻，得到PLGA溶液。 [0092] 將5gPLGA溶液與5g明膠微球混合，攪拌至均質(zhì)，得到可注射的原位固化組織工程 支架。所述可注射的原位固化組織工程支架中含10%的PLGA，7%的HA、50%的明膠微球和 33%的麗卩。
[0093]將可注射的原位固化組織工程支架注射至水溶液中，進(jìn)行原位固化，得到原位固 化組織工程支架。
[0094]本發(fā)明測(cè)試了本實(shí)施例得到的原位固化組織工程支架在固化lOmin的機(jī)械強(qiáng)度， 結(jié)果如圖2所示，圖2為本發(fā)明實(shí)施例1?9得到的原位固化組織工程支架的機(jī)械強(qiáng)度圖。 [0095]本發(fā)明測(cè)試了本實(shí)施例得到的原位固化組織工程支架的孔隙率，結(jié)果表明，本實(shí) 施例得到的原位固化組織工程支架的孔隙率為87%。
[0096] 實(shí)施例5
[0097]將明膠溶解于37°C的去離子水中配制得到質(zhì)量濃度為25%的明膠溶液，然后在 123kPa下髙壓滅菌后，將骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2)加入到明膠溶液中，得到BMP-2的濃度為 500ng/mL的明膠溶液。
[0098] 將20mL液體石蠟和5〇 μ L的Span-80加入到燒杯中，37Γ水浴條件下攪拌均勻， 取10mL明膠溶液加入其中，在2〇Orpm轉(zhuǎn)速下攬拌l〇min，然后保持轉(zhuǎn)速不變，轉(zhuǎn)入到4。(：的 冰浴條件下，持續(xù)攪拌lh，得到混合物。
[0099]使用孔徑為300 μ m的濾網(wǎng)過濾，將過濾得到的微球在-5(TC下冷凍干燥24h。 [0100]用無水酒精快速反復(fù)清洗干燥后的明膠微球，即得到明膠微球。 在8〇°C下，將3gPLGA溶于lOgNMP中，加入2gHA，攪拌均勻，得到PLGA溶液。 [0102] 將6gPLGA溶液與4g明膠微球混合，攪拌至均質(zhì)，得到可注射的原位固化組織工程 支架。所述可注射的原位固化組織工程支架中含12 %的PLGA，8%的HA、40%的明膠微球和 40%的麗卩。
[0103] 將可注射的原位固化組織工程支架注射至水溶液中，進(jìn)行原位固化，得到原位固 化組織工程支架。
[0104] 本發(fā)明測(cè)試了本實(shí)施例得到的原位固化組織工程支架在固化lOmin的機(jī)械強(qiáng)度， 結(jié)果如圖2所示，圖 2為本發(fā)明實(shí)施例1?9得到的原位固化組織工程支架的機(jī)械強(qiáng)度圖。 [0105]本發(fā)明測(cè)試了本實(shí)施例得到的原位固化組織工程支架的孔隙率，結(jié)果表明，本實(shí) 施例得到的原位固化組織工程支架的孔隙率為81 %。
[0106] 實(shí)施例6
[0107]將明膠溶解于37°c的去離子水中配制得到質(zhì)量濃度為25%的明膠溶液，然后在 123kPa下高壓滅菌后，將骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2)加入到明膠溶液中，得到BMP-2的濃度為 500ng/mL的明膠溶液。
[0108] 將20mL液體石蠟和50 μ L的Span_8〇加入到燒杯中，37°C水浴條件下攪拌均勻， 取10mL明膠溶液加入其中，在200rpm轉(zhuǎn)速下攪拌l〇 min，然后保持轉(zhuǎn)速不變，轉(zhuǎn)入到4°C的 冰浴條件下，持續(xù)攪拌lh，得到混合物。
[0109] 使用孔徑為3〇〇 μ m的濾網(wǎng)過濾，將過濾得到的微球在-5(TC下冷凍干燥24h。
[0110] 用無水酒精快速反復(fù)清洗干燥后的明膠微球，即得到明膠微球。
[0111] 在8〇°C下，將3gPLGA溶于lOgNMP中，加入2gHA，攪拌均勻，得到PLGA溶液。
[0112] 將7gPLGA溶液與3g明膠微球混合，攪拌至均質(zhì)，得到可注射的原位固化組織工程 支架。所述可注射的原位固化組織工程支架中含14%的PLGA，9%的HA、30%的明膠微球和 47%的匪卩。
[0113] 將可注射的原位固化組織工程支架注射至水溶液中，進(jìn)行原位固化，得到原位固 化組織工程支架。
[0114] 本發(fā)明測(cè)試了本實(shí)施例得到的原位固化組織工程支架在固化lOmin的機(jī)械強(qiáng)度， 結(jié)果如圖2所示，圖2為本發(fā)明實(shí)施例1?9得到的原位固化組織工程支架的機(jī)械強(qiáng)度圖。
[0115] 本發(fā)明測(cè)試了本實(shí)施例得到的原位固化組織工程支架的孔隙率，結(jié)果表明，本實(shí) 施例得到的原位固化組織工程支架的孔隙率為77%。
[0116] 實(shí)施例7
[0117]將明膠溶解于37°C的去離子水中配制得到質(zhì)量濃度為25%的明膠溶液，然后在 l23kPa下高壓滅菌后，將骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2)加入到明膠溶液中，得到BMP-2的濃度為 500ng/mL的明膠溶液。
[0118] 將2〇mL液體石蠟和5〇μ L的Span_8〇加入到燒杯中，37。(：水浴條件下攪拌均勻， 取10mL明膠溶液加入其中，在 2〇〇rpm轉(zhuǎn)速下攪拌l〇min，然后保持轉(zhuǎn)速不變，轉(zhuǎn)入到4°C的 冰浴條件下，持續(xù)攪拌lh，得到混合物。
[0119] 使用孔徑為300 μ m的濾網(wǎng)過濾，將過濾得到的微球在-5〇°C下冷凍千燥24h。
[0120] 用無水酒精快速反復(fù)清洗干燥后的明膠微球，即得到明膠微球。
[0121] 在8〇°C下，將3gPLGA溶于lOgNMP中，加入3gHA，攪拌均勻，得到PLGA溶液。
[0122] 將5gPLGA溶液與5g明膠微球混合，攪拌至均質(zhì)，得到可注射的原位固化組織工程 支架。所述可注射的原位固化組織工程支架中含9. 5 %的PLGA，9. 5%的HA、50%的明膠微 球和31%的NMP。
[0123] 將可注射的原位固化組織工程支架注射至水溶液中，進(jìn)行原位固化，得到原位固 化組織工程支架。
[0124] 本發(fā)明測(cè)試了本實(shí)施例得到的原位固化組織工程支架在固化ΙΟη?η的機(jī)械強(qiáng)度， 結(jié)果如圖2所示，圖2為本發(fā)明實(shí)施例1?9得到的原位固化組織工程支架的機(jī)械強(qiáng)度圖。
[0125] 本發(fā)明測(cè)試了本實(shí)施例得到的原位固化組織工程支架的孔隙率，結(jié)果表明，本實(shí) 施例得到的原位固化組織工程支架的孔隙率為85%。
[0126] 實(shí)施例8
[0127]將明膠溶解于3TC的去離子水中配制得到質(zhì)量濃度為25 %的明膠溶液，然后在 123kPa下高壓滅菌后，將骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2)加入到明膠溶液中，得到BMP-2的濃度為 500ng/mL的明膠溶液。
[0128] 將20mL液體石蠟和50 μ L的Span-8〇加入到燒杯中，37Γ水浴條件下攪拌均勻， 取10mL明膠溶液加入其中，在2〇〇rpm轉(zhuǎn)速下攪拌l〇 min，然后保持轉(zhuǎn)速不變，轉(zhuǎn)入到4°C的 冰浴條件下，持續(xù)攪拌lh，得到混合物。
[0129] 使用孔徑為3〇〇 U m的濾網(wǎng)過濾，將過濾得到的微球在-5(rC下冷凍千燥24h。
[0130] 用無水酒精快速反復(fù)清洗干燥后的明膠微球，即得到明膠微球。
[0131] 在80?下，將3gPLGA溶于lOgNMP中，加入3gHA，攪拌均勻，得到PLGA溶液。 [0132]將6gPLGA溶液與4g明膠微球混合，攪拌至均質(zhì)，得到可注射的原位固化組織工程 支架。所述可注射的原位固化組織工程支架中含11%的PLGA，11%的HA、40%的明膠微球 和 38%的 NMP。
[0133]將可注射的原位固化組織工程支架注射至水溶液中，進(jìn)行原位固化，得到原位固 化組織工程支架。
[0134]本發(fā)明測(cè)試了本實(shí)施例得到的原位固化組織工程支架在固化10min的機(jī)械強(qiáng)度， 結(jié)果如圖2所示，圖2為本發(fā)明實(shí)施例1?9得到的原位固化組織工程支架的機(jī)械強(qiáng)度圖。 [0135]本發(fā)明測(cè)試了本實(shí)施例得到的原位固化組織工程支架的孔隙率，結(jié)果表明，本實(shí) 施例得到的原位固化組織工程支架的孔隙率為79%。
[0136] 實(shí)施例9
[0137]將明膠溶解于37°C的去離子水中配制得到質(zhì)量濃度為25%的明膠溶液，然后在 123kPa下高壓滅菌后，將骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2)加入到明膠溶液中，得到bmp-2的濃度為 500ng/mL的明膠溶液。
[0138] 將20mL液體石蠟和5〇 μ L的Span-80加入到燒杯中，37Γ水浴條件下攪拌均勻， 取10mL明膠溶液加入其中，在200rpm轉(zhuǎn)速下攪拌lOmin，然后保持轉(zhuǎn)速不變，轉(zhuǎn)入到4Γ的 冰浴條件下，持續(xù)攪拌lh，得到混合物。
[0139] 使用孔徑為300 μ m的濾網(wǎng)過濾，將過濾得到的微球在-5〇°C下冷凍千燥24h。
[0140] 用無水酒精快速反復(fù)清洗干燥后的明膠微球，即得到明膠微球。
[0141] 在8〇°C下，將3gPLGA溶于lOgNMP中，加入3gHA，攪拌均勻，得到PLGA溶液。
[0142] 將7gPLGA溶液與3g明膠微球混合，攪拌至均質(zhì)，得到可注射的原位固化組織工程 支架。所述可注射的原位固化組織工程支架中含13%的PLGA, 13%的HA、30%的明膠微球 和 44%的 NMP。
[0143] 將可注射的原位固化組織工程支架注射至水溶液中，進(jìn)行原位固化，得到原位固 化組織工程支架。
[0144] 本發(fā)明測(cè)試了本實(shí)施例得到的原位固化組織工程支架在固化lOmin的機(jī)械強(qiáng)度， 結(jié)果如圖2所示，圖2為本發(fā)明實(shí)施例1?9得到的原位固化組織工程支架的機(jī)械強(qiáng)度圖。
[0145] 在圖2中，1為本發(fā)明實(shí)施例1得到的原位固化組織工程支架的初始機(jī)械強(qiáng)度；2 為本發(fā)明實(shí)施例2得到的原位固化組織工程支架的初始機(jī)械強(qiáng)度；3為本發(fā)明實(shí)施例3得 到的原位固化組織工程支架的初始機(jī)械強(qiáng)度；4為本發(fā)明實(shí)施例4得到的原位固化組織工 程支架的初始機(jī)械強(qiáng)度；5為本發(fā)明實(shí)施例5得到的原位固化組織工程支架的初始機(jī)械強(qiáng) 度；6為本發(fā)明實(shí)施例6得到的原位固化組織工程支架的初始機(jī)械強(qiáng)度；7為本發(fā)明實(shí)施例 7得到的原位固化組織工程支架的初始機(jī)械強(qiáng)度；8為本發(fā)明實(shí)施例8得到的原位固化組織 工程支架的初始機(jī)械強(qiáng)度；9為本發(fā)明實(shí)施例9得到的原位固化組織工程支架的初始機(jī)械 強(qiáng)度。由圖2可以看出，本發(fā)明提供的原位固化組織工程支架在固化lOmin內(nèi)機(jī)械強(qiáng)度最 高可達(dá)2. 8MPa，大大提高了支架的初始機(jī)械強(qiáng)度。
[0146] 本發(fā)明測(cè)試了本實(shí)施例得到的原位固化組織工程支架的孔隙率，結(jié)果表明，本實(shí) 施例得到的原位固化組織工程支架的孔隙率為71%。
[0147] 由以上實(shí)施例可以看出，本發(fā)明提供的原位固化組織工程支架以生物可降解微球 為致孔劑，得到的原位固化組織工程支架中孔結(jié)構(gòu)均勻，孔隙率大，還提高了原位固化組織 工程支架的初始機(jī)械強(qiáng)度，并且，本發(fā)明提供的原位固化組織工程支架的制備方法簡(jiǎn)單、易 操作。
[0148] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1· 一種原位固化組織工程支架，由聚丙交酯-乙交酯和生物可降解微球在極性有機(jī)溶 劑的存在下原位固化形成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的原位固化組織工程支架，其特征在于，所述生物可降解微球 為明膠微球、聚丙交酯-乙交酯微球、海藻酸鹽微球和殼聚糖微球中的一種或幾種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的原位固化組織工程支架，其特征在于，所述生物可降解微球 的粒徑為100?450 μ m。
4·根據(jù)權(quán)利要求1所述的原位固化組織工程支架，其特征在于，所述聚丙交酯-乙交酯 的數(shù)均分子量為50000?200000。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的原位固化組織工程支架，其特征在于，所述聚丙交酯-乙交酯 與生物可降解微球的質(zhì)量比為（1?9) : (9?1)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的原位固化組織工程支架，其特征在于，所述極性有機(jī)溶劑為 1-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基亞砜、四甘醇和乙酸乙酯中的一種或幾種。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的原位固化組織工程支架，其特征在于，所述原位固化組織工 程支架的孔隙率為70?95%。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1?7任意一項(xiàng)所述的原位固化組織工程支架，其特征在于，所述原位 固化組織工程支架還包括羥基磷灰石。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1?7任意一項(xiàng)所述的原位固化組織工程支架，其特征在于，所述生物 可降解微球?yàn)閾?dān)載活性蛋白的生物可降解微球。
10. -種原位固化組織工程支架的制備方法，包括以下步驟： 將聚丙交酯-乙交酯、生物可降解微球和極性有機(jī)溶劑混合，經(jīng)原位固化，得到原位固 化組織工程支架。
【文檔編號(hào)】A61L27/12GK104189954SQ201410483564
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年9月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月19日
【發(fā)明者】章培標(biāo), 張寧, 陳學(xué)思, 王宗良, 王宇, 黃晶, 高田林 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所