養(yǎng)血清腦制劑在制備治療阿爾茨海默癥的藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本申請公開了一種中藥組合物用于治療阿爾茨海默氏(老年癡呆)中應(yīng)用；具體公開了該中藥組合物可以顯著清除早中期阿爾茨海默腦內(nèi)老年斑的作用，該作用的主要機理為該中藥組合物清除腦內(nèi)Aβ蛋白、促進(jìn)APP的生理性α切割、促進(jìn)了的可溶性神經(jīng)營養(yǎng)性sAPPα蛋白的生成、促進(jìn)APP的生理性α切割、抑制致病性γ分泌酶早老素PS1。
【專利說明】養(yǎng)血清腦制劑在制備治療阿爾茨海默癥的藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種中藥組合物制劑的新用途，特別涉及養(yǎng)血清腦制劑在制備治療阿 爾茨海默癥（老年癡呆）的藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】：
[0002] 養(yǎng)血清腦顆粒是天津天士力制藥股份有限公司研制的現(xiàn)代中藥制劑，并于1996 年獲得國家新藥證書，并于1999年被列入國家基本藥物目錄，2000年被列入國家醫(yī)保藥品 目錄。養(yǎng)血清腦顆粒是由當(dāng)歸、川芎、白芍、鉤藤、雞血藤、熟地黃、決明子、夏枯草、細(xì)辛、延 胡索和珍珠母11味中藥，經(jīng)現(xiàn)代高科技手段提取后，加入適當(dāng)輔料，經(jīng)混合制粒等制劑過 程制成的一種顆粒劑。該制劑具有有效成分溶出快，生物利用度高等優(yōu)點。養(yǎng)血清腦顆粒 具有養(yǎng)血平肝，活血通絡(luò)的功效，可用于血虛肝亢所致的頭痛、眩暈眼花、心煩易怒、失眠多 夢等病癥，在臨床上具有顯著的療效。
[0003] 養(yǎng)血清腦制劑為現(xiàn)有技術(shù)，中國專利93100050. 5描述了其配方及制備方法，該專 利描述的配方還可以根據(jù)制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制備成不同的劑型，如片劑，膠囊，口服液等。
[0004] 阿爾茨海默癥（Alzheimer disease，AD)，也稱為老年癡呆癥，是一種起病隱匿的 進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。臨床上以記憶障礙、失語、失用、失認(rèn)、視空間技能損 害、執(zhí)行功能障礙以及人格和行為改變等全面性癡呆表現(xiàn)為特征，病因迄今未明。65歲以前 發(fā)病者，稱早老性癡呆；65歲以后發(fā)病者稱老年性癡呆。
[0005] 目前治療阿爾茨海默癥的藥物包括：多奈哌齊（donepezil)，利斯的 明（Rivastigmine),加蘭他敏（Galantamine),石杉堿甲（Huperzine A)，美金剛 (Memantine),司來吉蘭（Selegiline),維生素 E，褪黑素，銀杏提取物（gingko bilobi)，批 拉西坦（piracetam腦復(fù)康）、茴拉西坦（aniracetam阿尼西坦，三樂喜）、萘非西坦等。
[0006] 本發(fā)明經(jīng)過研究，意外的發(fā)現(xiàn)養(yǎng)血清腦制劑具有治療阿爾茨海默癥的作用。


【發(fā)明內(nèi)容】
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[0007] 本發(fā)明提供一種中藥組合物的新用途，特別涉及養(yǎng)血清腦制劑的新的醫(yī)藥用途。 具體的，本發(fā)明提供一種中藥組合物在制備治療阿爾茨海默癥的藥物中的應(yīng)用。所述應(yīng)用 在于中藥組合物可以用于清除阿爾茨海默腦內(nèi)老年斑。
[0008] 本發(fā)明所述中藥組合物是由如下重量百分的藥材制備而成：當(dāng)歸6. 75%、川芎 6. 75%、白芍5. 4%、鉤藤13. 5 %、雞血藤13. 5 %、熟地黃5. 4%、決明子13. 5 %、夏枯草 13. 5%、細(xì)辛1. 34%、延胡索6. 75%和珍珠母13. 5%。
[0009] 制備工藝為：藥材經(jīng)前序處理一水提一濃縮一乙醇沉淀一回收乙醇一濃縮成膏一 混合制劑。
[0010] 所述制劑包括任何一種可服用的劑型，優(yōu)選口服制劑，如：顆粒劑，丸劑，片劑，膠 囊，口服液。
[0011] 本發(fā)明所述的應(yīng)用，在于該中藥組合物使記憶認(rèn)知能力顯著提高。
[0012] 本發(fā)明所述的應(yīng)用，在于該中藥組合物能夠提高大腦皮層及海馬組織中腦源性神 經(jīng)生長因子、神經(jīng)生長因子及其受體TrkA的表達(dá)，改善海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的異常。
[0013] 本發(fā)明所述的應(yīng)用，在于該中藥組合物能夠增加大腦皮層總抗氧化能力及GSH含 量，提高SOD、GSH - px活性，減少MDA含量。
[0014] 本發(fā)明所述的應(yīng)用，在于該中藥組合物能夠提高大腦皮層及海馬突觸素及突觸后 致密物95的表達(dá)，改善海馬突觸結(jié)構(gòu)的異常。
[0015] 本發(fā)明所述的應(yīng)用，在于該中藥組合物能夠提高大腦皮層及海馬組織中乙酰膽堿 的表達(dá)，提高海馬膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶及大腦皮質(zhì)Ml膽堿受體的表達(dá)。
[0016] 本發(fā)明所述的應(yīng)用，在于該中藥組合物用于清除阿爾茨海默腦內(nèi)老年斑。
[0017] 本發(fā)明所述的應(yīng)用，在于該中藥組合物能夠清除腦內(nèi)Αβ蛋白，降低腦內(nèi)Αβ蛋白 的生成。
[0018] 本發(fā)明所述的應(yīng)用，在于所述應(yīng)用在于該中藥組合物能夠抑制致病性Y分泌酶 早老素 PSl的表達(dá)水平抑制APP的病理性切割，促進(jìn)APP發(fā)生生理性α剪切的作用。
[0019] 本發(fā)明所述該中藥組合物的優(yōu)選提取方法為：
[0020] 取權(quán)利要求1中所述的中藥組合物處方量的各藥材備用：
[0021] ⑴提取物1的制備：當(dāng)歸、川；、延胡索、決明子加乙醇加熱回流提取，濾過，除 雜,回收乙醇并濃縮,備用；
[0022] (2)提取物2的制備：白芍加乙醇加熱回流提取，濾過，回收乙醇并濃縮，備用；
[0023] (3)提取物3的制備：熟地黃、鉤藤、雞血藤、夏枯草、珍珠母、細(xì)辛加水煎煮，濾過， 濃縮，加乙醇靜置，濾過，回收乙醇并濃縮，備用；
[0024] (4)制劑的制備：取以上3種提取物，加入適量輔料，制劑，即得。
[0025] 另一優(yōu)選的制備方法為：
[0026] (1)提取物1的制備：當(dāng)歸、川彎、延胡索、決明子加入3?6倍量50?80%乙醇 加熱回流提取2?3次，第一次0. 5?2. 5小時，第二、三次0. 5?2小時，濾過，除雜，回收 乙醇并濃縮至相對密度1. 250?1. 350 (70?80°C )，備用；
[0027] (2)提取物2的制備：白芍加入3?6倍量50?80%乙醇，浸漬，加熱回流提取 2?3次，第一次0. 5?2. 5小時，第二、三次0. 5?2小時，濾過，回收乙醇并濃縮至相對密 度 L 10 ?L 35 (55 ?65°C )，備用；
[0028] (3)提取物3的制備：熟地黃、鉤藤、雞血藤、夏枯草、珍珠母、細(xì)辛加入4?10倍量 水煎煮2?3次，第一次0. 5?3小時，第二、三次1?3小時，濾過，濃縮至相對密度1. 06? 1. 10(75?85°C )，加乙醇使含醇量為60?85%，靜置12?24小時，濾過，回收乙醇，濃縮 至相對密度L 270?L 350 (75?85°C )，備用；
[0029] (4)制劑的制備：取以上提取物，加入適量輔料，制劑，即得。
[0030] 最優(yōu)選的制備方法為：
[0031] (1)提取物1的制備：當(dāng)歸、川；、延胡索、決明子加入4倍量70%乙醇加熱回流 提取2次，第一次2小時，第二次1小時，濾過，除雜，回收乙醇并濃縮至相對密度1. 300? 1.310(74?76°〇，備用；
[0032] (2)提取物2的制備：白芍加入4倍量60%乙醇，浸漬，加熱回流提取2次，第一次 2小時，第二次1小時，濾過，回收乙醇并濃縮至相對密度1. 23?1. 33 (65°C )，備用；
[0033] (3)提取物3的制備：熟地黃、鉤藤、雞血藤、夏枯草、珍珠母、細(xì)辛加入5倍量水 煎煮2次，第一次2小時，第二次1小時，濾過，濃縮至相對密度1. 06?1. 10 (80°C )，加乙 醇使含醇量為65?70%，靜置12?24小時，濾過，回收乙醇，濃縮至相對密度1. 320? 1. 325(79 ?81°C )，備用；
[0034] (4)制劑的制備：取以上提取物，加入適量輔料，制劑，即得。
[0035] 本發(fā)明所述應(yīng)用是經(jīng)過實驗觀察獲得的，其使用了該中藥組合物制劑中的一種， 即天士力制藥股份有限公司生產(chǎn)的"養(yǎng)血清腦顆粒"作為實驗藥品，任何與養(yǎng)血清腦顆粒具 有相同處方經(jīng)提取得到的提取物均具有與養(yǎng)血清腦顆粒相同的用途。
[0036] 實驗結(jié)果如下：
[0037] 實驗一、養(yǎng)血清腦顆粒對輕中度阿爾茨海默癥模型鼠腦內(nèi)β -淀粉樣斑塊的清除 作用和記憶認(rèn)知能力改善作用研究
[0038] 摘要APPswe/PSldE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠是國際公認(rèn)的阿爾茨海默癥（Alzheimer，s Disease，AD)模型鼠，6月齡APPswe/PSldE9轉(zhuǎn)基因腦內(nèi)開始出現(xiàn)了老年斑，模擬人類中輕 度阿爾茨海默癥。4月齡APPswe/PSIdE9雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默癥模型小鼠連續(xù)60天，口服養(yǎng) 血清腦顆粒48g生藥/kg (高劑量）和16g生藥/kg (低劑量），或?qū)φ账幬锇怖砩闕. 03mg/ kg至小鼠6月齡，發(fā)現(xiàn)口服養(yǎng)血清腦顆粒一個月和二個月后，小鼠記憶認(rèn)知能力顯著提高， 且作用效果優(yōu)于陽性藥物安理申組。通過腦組織切片的剛果紅染色和免疫組織化學(xué)染色實 驗證明養(yǎng)血清腦顆粒清除早中期阿爾茨海默癥模型鼠大腦β-淀粉樣斑塊（老年斑）的顯 著作用，從小鼠大腦海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)β_淀粉樣斑塊（老年斑）的個數(shù)、覆蓋面積和著色程 度方面，養(yǎng)血清腦顆粒對腦內(nèi)老年斑的清除率達(dá)60-90%，顯著高于陽性藥物安理申組。人 淀粉樣蛋白前體APP(β-amyloid precursor protein)的異常剪切是阿爾茨海默癥發(fā)病的 關(guān)鍵，進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)APP的關(guān)鍵剪切酶和剪切產(chǎn)物的檢測，證明養(yǎng)血清腦顆 粒通過提高腦內(nèi)APP的生理性切割途徑并抑制APP病理性切割途徑，從而降低了 β -淀粉 樣斑塊在腦內(nèi)的形成和沉積。本研究充分證明養(yǎng)血清腦顆粒對輕中度阿爾茨海默癥有很好 的治療效果。
[0039] 1實驗?zāi)康?br> [0040] 養(yǎng)血清腦顆粒是天士力集團(tuán)有限公司生產(chǎn)的中藥復(fù)方制劑，臨床上主要用于治療 頭痛，改善慢性腦缺血。在長期臨床觀察中，發(fā)現(xiàn)該藥還有一定的改善阿爾茨海默癥的作 用。本實驗室進(jìn)行了該藥對早中期APPsWe/PSldE9雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默癥模型小鼠記憶、 認(rèn)知能力影響，特別是針對阿爾茨海默癥特征性病變-β淀粉樣蛋白Αβ在腦內(nèi)的沉積， 利用不溶性Αβ的特異染色、淀粉蛋白識別的剛果紅染色等手段，研究了養(yǎng)血清腦顆粒對 早中期APPs We/PSldE9雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默癥模型小鼠腦內(nèi)Αβ老年斑的清除作用，并通 過蛋白剪切途徑的研究揭示其作用靶點和機制，為養(yǎng)血清腦顆粒用于治療輕中度阿爾茨海 默癥提供實驗依據(jù)。
[0041] 2實驗材料
[0042] 2. 1受試藥品及配制
[0043] 2. L 1受試藥物：養(yǎng)血清腦顆粒浸膏（簡稱養(yǎng)血清腦），黑褐色浸膏，由天士力藥業(yè) 集團(tuán)提供，批號=20120514,出膏率13%，相當(dāng)于每克浸膏含7. 7g生藥，用生理鹽水配制成 2. 4g、0. Sg生藥/ml濃度的溶液，供小鼠灌胃給藥用（文中劑量按生藥量計），給藥體積為 20ml/kg。小鼠用藥劑量為高濃度48g生藥/kg，低濃度16g生藥/kg。
[0044] 陽性對照安理申，市售，每片5mg，衛(wèi)材（中國）有限公司，批號：111030A，臨用時 用生理鹽水按0. 〇515mg/ml制成混懸液，供小鼠灌胃給藥用，給藥體積為20ml/kg。小鼠用 藥劑量為安理申l.〇3mg/kg。
[0045] 2. 2實驗動物與基因型鑒定
[0046] 實驗動物APPSWe/PSldE9雙轉(zhuǎn)基因 AD小鼠購自南京大學(xué)模式動物研究所。 APPsWe/PSldE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠是國際公認(rèn)的阿爾茨海默癥模型鼠。如圖1所示，APPswe/ PSldE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠轉(zhuǎn)入了人的瑞典型突變APPswe和第9外顯子缺失突變的PSldE92個 基因，可表達(dá)人的突變型APP分子，異常剪切產(chǎn)生過量的A β 42多肽，在腦內(nèi)形成A β斑塊 及其他AD病變過程中的組織病理變化，出現(xiàn)AD相應(yīng)的行為學(xué)異常改變。據(jù)報道該品系4-5 月齡小鼠時開始在杏仁體和海馬出現(xiàn)一些嗜剛果紅的斑塊（老年斑初期），6月齡開始在大 腦皮質(zhì)、海馬和杏仁體形成大量淀粉樣斑塊，模擬人類中輕度阿爾茨海默癥。
[0047] 我們對用于藥物測試的APPswe/PSldE9雙轉(zhuǎn)基因 AD小鼠進(jìn)行了基因型鑒 定。取鼠尾尾尖，加入裂解液和蛋白激酶K10mg/ml，56°C隔夜消化鼠尾。加入酚氯仿 去除蛋白，異丙醇沉淀DNA，70 %冰乙醇洗滌干燥獲得鼠尾DNA。采用APPswe引物： 5' -GACTGACCACTCGACCAGGTTCTG-3' 和 5' -CTGACTGGTGAGCTGGTCCAAGAC-3' 進(jìn)行鑒定 APPswe 基因的PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：94°C 30sec，69°C 60sec，72°C 60sec，30循環(huán)。經(jīng)PCR擴增，轉(zhuǎn) 基因鼠中出現(xiàn)APP基因特異條帶，大小為350bp，而背景鼠無條帶產(chǎn)生。利用PCR方法對所 有實驗鼠進(jìn)行了基因型鑒定，保證了所有實驗鼠為陽性純合子的轉(zhuǎn)基因鼠，如圖1-1所示。
[0048] 圖l-lAPPswe/PSldE9轉(zhuǎn)基因鼠的基因型鑒定
[0049] 2. 3實驗試劑及配制
[0050] 2. 3. 1 試劑
[0051] 多聚甲醒（Sigma)、戊巴比妥鈉（Genview)、剛果紅、蘇木精、氧化萊（Sigma)、DAB 顯色試劑盒（北京鼎國）、鼠兔通用型免疫二抗（Proteintech)，濃氨水、無水乙醇、濃鹽 酸、甘油、甲醇、檸檬酸、檸檬酸三鈉、二甲苯（北京化工）。TEMED、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰 胺、Tris、Gly、考馬斯亮藍(lán) R250、BSA(Sigma)、Triton X-100 (Genview)、蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量 (北京全式金）、Tween-20 (BBI)，兔抗鼠 β-Actin抗體（武漢博士德）、HRP標(biāo)記山羊抗兔 IgG (北京全式金）、ECL光化學(xué)試劑盒（碧云天）。
[0052] 剛果紅染色液與蘇木精染色液：取0. 5g剛果紅粉末和20ml甘油加至80ml甲醇 中，配制成0.2%剛果紅染色液。取20g硫酸鋁鉀溶于200ml蒸餾水，KKTC溶解。取蘇木精 Ig溶于IOml無水乙醇，加至硫酸鋁鉀水溶液中煮沸，加入0. 5g氧化汞，繼續(xù)加熱并攪拌至 溶液為深紫色，立即冷卻過濾，配制成蘇木精染色液。
[0053] 2. 4實驗主要儀器
[0054] Y型迷宮系統(tǒng)（RD1102-YM)，垂直電泳儀和電源系統(tǒng)（北京六一廠），半干轉(zhuǎn)膜 儀（BIO-RAD)。DP70正置顯微鏡和攝影系統(tǒng)（OLYMPUS)，應(yīng)用顯微鏡圖像處理軟件DP Controller米集圖片。
[0055] 3實驗方法
[0056] 3. 1實驗分組及給藥
[0057] 實驗動物APPswe/PSldE9雙轉(zhuǎn)基因 AD小鼠隨機分為生理鹽水對照組、養(yǎng)血低濃度 組、養(yǎng)血高濃度組和安理申組，雌雄各半，各組16只，在實驗過程中，生理鹽水組和安理申 組各有2只死亡，每組14-16只，體重20-40g。常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水，4月齡APPswe/PSldE9 轉(zhuǎn)基因鼠連續(xù)灌胃給藥，給藥容積每25g體重灌胃0. 5ml。灌胃給藥至6月齡。
[0058] 表1試驗分組及給藥量
[0059]

【權(quán)利要求】
1. 一種中藥組合物在制備治療阿爾茨海默癥的藥物中的應(yīng)用，其中所述中藥組合物由 如下重量配比的藥物制備而成：當(dāng)歸6. 75%、川芎6. 75%、白芍5. 4%、鉤藤13. 5%、雞血藤 13. 5%、熟地黃5. 4%、決明子13. 5%、夏枯草13. 5%、細(xì)辛1. 34%、延胡索6. 75%和珍珠母 13. 5%。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用在于該組合物用于清除阿爾茨海默 腦內(nèi)老年斑。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用在于該組合物能夠清除腦內(nèi)AP蛋 白，降低腦內(nèi)A0蛋白的生成。
4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用在于該組合物能夠抑制致病性Y分 泌酶早老素 PS1的表達(dá)水平抑制APP的病理性切割，促進(jìn)APP發(fā)生生理性a剪切的作用。
5. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用在于該組合物使記憶認(rèn)知能力顯著 提1?。
6. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用在于該組合物能夠提高大腦皮層及 海馬組織中腦源性神經(jīng)生長因子、神經(jīng)生長因子及其受體TrkA的表達(dá)，改善海馬神經(jīng)元超 微結(jié)構(gòu)的異常。
7. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用在于該組合物能夠提高大腦皮層及 海馬突觸素及突觸后致密物95的表達(dá)，改善海馬突觸結(jié)構(gòu)的異常。
8. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用在于該組合物能夠增加大腦皮層總 抗氧化能力及GSH含量，提高SOD、GSH-px活性，減少MDA含量。
9. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用在于該組合物能夠提高大腦皮層及 海馬組織中乙酰膽堿的表達(dá)，提高海馬膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶及大腦皮質(zhì)Ml膽堿受體的表達(dá)。
10. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述該組合物選自：顆粒劑，丸劑，片劑，膠 囊，口服液。
【文檔編號】A61P25/28GK104435306SQ201410483630
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年9月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月22日
【發(fā)明者】吳迺峰 申請人:天士力制藥集團(tuán)股份有限公司