一種抑制白色念珠菌的藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種抑制白色念珠菌的藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用。具體提供了一種白鮮皮水提物及其用途，還提供了一種藥物組合物及其制備方法和用途，所述的藥物組合物是由白鮮皮水提物、苦參水提物、苦參醇提物按照以下體積比組成：（2-3）:（2-3）:（2-3）。本發(fā)明證實(shí)了白鮮皮水提物對(duì)白色念珠菌具有抑制作用，由白鮮皮水提物、苦參水提物以及苦參醇提物組成的藥物組合物當(dāng)三種成分在特定配比下時(shí)，可顯著抑制白色念珠菌生長，以上研究結(jié)果為制備純中藥來源、無毒副作用的抑制白色念珠菌藥物奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】-種抑制白色念珠菌的藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種藥物組合物，具體地說，涉及一種抑制白色念珠菌的水提物及其 應(yīng)用，還涉及一種藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 白色念珠菌（Monilia a化ican或Canidia A化icans),是一種常見的條件致病菌， 通常存在于正常人口腔、上呼吸道、腸道及陰道，一般在正常機(jī)體中數(shù)量少，不引起疾病，當(dāng) 機(jī)體免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制約作用失調(diào)，則本菌大量繁殖并改變生 長形式(芽生菌絲相）侵入細(xì)胞引起疾病。
[0003] 口腔念珠菌病是真菌一念珠菌屬感染所引起的口腔黏膜疾病。據(jù)報(bào)道，此種菌 屬于隱球菌科的念珠菌、高里念珠菌、假熱帶念珠菌，其中白色念珠菌是最主要的病原菌。 中醫(yī)上，口腔念珠菌病稱為唇風(fēng)，W唇紅部黏膜紅腫、糜爛、結(jié)麻、脫屑、瘦癢、疼痛為特征， 嚴(yán)重影響患者日常生活和工作，甚至還有癌變的潛在危險(xiǎn)。目前西醫(yī)對(duì)唇風(fēng)的治療方法甚 少，治療W局部注射和內(nèi)服皮質(zhì)激素為主。雖有一定療效，但局部注射時(shí)極為疼痛，反復(fù)注 射易引起藥物沉積和局部組織變硬，尤其是會(huì)造成育齡期婦女月經(jīng)失調(diào)等不良反應(yīng)，使患 者的依從性大大下降。開展口腔念珠菌病的中醫(yī)治療可顯著降低毒副作用。
[0004] 白鮮皮為蕓香科植物白鮮（Dictamnus dasyca巧US "TurcZ)和狹葉白鮮 (Dictamnus angustifolius G. Don)的干燥根皮，具有清熱燥濕、巧風(fēng)解毒的功效，主治 皮膚瘦癢，風(fēng)疹，濕疹，巧癖，黃痘，風(fēng)濕瘍痛，筋骨瘦弱，小兒梅厥?？鄥槎箍浦参锟鄥?(So地ora flavescens Ait.)的根，具有清熱燥濕，利水退黃，巧風(fēng)殺蟲的功效，主治濕熱發(fā) 狂，熱毒結(jié)胸，消渴，濕熱瀉癡，腸風(fēng)便血，帶下陰癢，黃痘，小便赤澀，風(fēng)疹瘦癢，巧癖，麻風(fēng)， 濕毒瘡瘍。
[0005] 目前關(guān)于白鮮皮、苦參的提取物在抑制白色念珠菌方面的作用還未見報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種抑制白色念珠菌的白鮮皮水提 物。
[0007] 本發(fā)明的再一的目的是，提供所述的白鮮皮水提物的用途。
[0008] 本發(fā)明的另一的目的是，提供一種抑制白色念珠菌的藥物組合物。
[0009] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是，提供所述的藥物組合物的用途。
[0010] 本發(fā)明的第五個(gè)目的是，提供所述的藥物組合物的制備方法。
[0011] 為實(shí)現(xiàn)上述第一個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是： 一種白鮮皮水提物，所述的白鮮皮水提物的制備方法包括W下步驟：取白鮮皮加蒸觸 水浸泡20-40min，回流提取1-3次，每次20-40min，合并濾液。
[0012] 優(yōu)選地，所述的白鮮皮與蒸觸水的比例為；1: (1-10) g/mL。
[0013] 優(yōu)選地，所述的浸泡時(shí)間為30min ;回流提取2次，每次30min。
[0014] 為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是： 如上任一所述的白鮮皮水提物在制備抑制白色念珠菌的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 為實(shí)現(xiàn)上述第H個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是： 一種抑制白色念珠菌的藥物組合物，所述的藥物組合物是由白鮮皮水提物、苦參水提 物、苦參醇提物按照W下體積比組成：（2-3): (2-3): (2-3)，其中所述的鮮皮水提物、苦參 水提物、苦參醇提物的生藥濃度相同； 所述的白鮮皮水提物的制備方法包括W下步驟：取白鮮皮加蒸觸水浸泡20-40min，回 流提取1-3次，每次20-40min，合并濾液； 所述的苦參水提物的制備方法包括W下步驟；取苦參加蒸觸水浸泡20-40min，回流提 取1-3次，每次20-40min，合并濾液； 所述的苦參醇提物的制備方法包括W下步驟；取苦參加蒸觸水浸泡20-40min，煎 煮1-3次，每次0.5-1. 5小時(shí)，合并煎液，濃縮，冷卻至室溫，加己醇使己醇體積分?jǐn)?shù)達(dá) 60% -80%，靜置18-30小時(shí)后濾過，濾液回收己醇。
[0016] 優(yōu)選地，所述的白鮮皮水提物、苦參水提物、苦參醇提物體積比為：（2.4-2.6): (2. 4-2. 6) : (2. 4-2. 6)。
[0017] 更優(yōu)選地，所述的白鮮皮水提物、苦參水提物、苦參醇提物體積比為；1:1:1。
[0018] 優(yōu)選地，所述的白鮮皮水提物的制備方法中，所述的浸泡時(shí)間為30min，回流提取 2次，每次30min ;所述的苦參水提物的制備方法中，所述的浸泡時(shí)間為30min，回流提取2 次，每次30min ;所述的苦參醇提物的制備方法中，所述的浸泡時(shí)間為30min，煎煮2次，每次 1小時(shí)，靜置時(shí)間為24小時(shí)。
[0019] 為實(shí)現(xiàn)上述第四個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是： 如上任一所述的藥物組合物在制備抑制白色念珠菌的藥物中的應(yīng)用。
[0020] 為實(shí)現(xiàn)上述第五個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是： 如上所述的藥物組合物的制備方法，它包括W下步驟： a) 提取白鮮皮水提物；取白鮮皮加蒸觸水浸泡20-40min，回流提取1-3次，每次 20-40min，合并濾液； b) 提取苦參水提物；取苦參加蒸觸水浸泡20-40min，回流提取1-3次，每次20-40min， 合并濾液； C)提取苦參醇提物；取苦參加蒸觸水浸泡20-40min，煎煮1-3次，每次0. 5-1. 5小時(shí)， 合并煎液，濃縮，冷卻至室溫，加己醇使己醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)60% -80%，靜置18-30小時(shí)后濾 過，濾液回收己醇； d)將所述的白鮮皮水提物、提取苦參水提物和苦參醇提物按W下體積比混合： (2. 4-2. 6) : (2. 4-2. 6) : (2. 4-2. 6)，其中所述的白鮮皮水提物、提取苦參水提物和苦參醇 提物的生藥濃度相同。
[0021] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于： 本發(fā)明采用煎煮法W及水提醇沉淀法制備了中草藥的水提物和醇提物，分別檢測了白 鮮皮、僵蠶、白花藤、苦參水提物W及白鮮皮、僵蠶、白花藤、苦參、白立、白及醇提物對(duì)白色 念珠菌的體外抑制作用，結(jié)果顯示白鮮皮水提物、苦參水提物W及苦參醇提物對(duì)白色念珠 菌均有抑制作用。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種由白鮮皮水提物、苦參水提物W及苦參醇提物組成的藥物組 合物，H種成分在特定配比下，可獲得顯著的抑制白色念珠菌生長的效果。
[0023] 本發(fā)明為制備純中藥來源、無毒副作用的抑制白色念珠菌的藥物奠定了基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 附圖1是96孔微量藥敏板。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0026] 實(shí)施例1白鮮皮、僵蠶、白花藤、苦參水提物的制備(一） 分別取白鮮皮、僵蠶、白花藤、苦參各50g，加250ml蒸觸水浸泡30分鐘，回流提取二次， 每次30min，合并兩次濾液，濃縮至25ml，高壓滅菌，置4°C冰箱保存，生藥濃度為2g/ml。
[0027] 實(shí)施例2白鮮皮、僵蠶、白花藤、苦參水提物的制備(二） 分別取白鮮皮、僵蠶、白花藤、苦參各50g，加300ml蒸觸水浸泡20分鐘，回流提取H次， 每次20min，合并H次濾液，濃縮至25ml，高壓滅菌，置4°C冰箱保存，生藥濃度為2g/ml。
[0028] 實(shí)施例3白鮮皮、僵蠶、白花藤、苦參水提物的制備(H) 分別取白鮮皮、僵蠶、白花藤、苦參各50g，加200ml蒸觸水浸泡40分鐘，回流提取一次， 回流時(shí)間為40min，濾液濃縮至25ml，高壓滅菌，置4°C冰箱保存，生藥濃度為2g/ml。
[0029] 實(shí)施例4白鮮皮、苦參、僵蠶、白花藤、白立、白及醇提物的制備(一） 分別取白鮮皮、苦參、僵蠶、白花藤、白立、白及各50g，加250ml蒸觸水浸泡30分鐘，煎 煮2次，每次1小時(shí)，合并煎液，濃縮至含藥量約2g/ml，冷卻至室溫，加無水己醇，使含己醇 體積分?jǐn)?shù)達(dá)70%，4C冰箱保存，靜置24小時(shí)后濾過，濾液回收己醇，加蒸觸水至25ml，高壓 滅菌，置4C冰箱保存，生藥濃度為2g/ml。
[0030] 實(shí)施例5白鮮皮、苦參、僵蠶、白花藤、白立、白及醇提物的制備(二） 分別取白鮮皮、苦參、僵蠶、白花藤、白立、白及各50g，加200ml蒸觸水浸泡40分鐘，煎 煮3次，每次0. 5小時(shí)，合并煎液，濃縮至含藥量約2g/ml，冷卻至室溫，加無水己醇，使含己 醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)60%，4°C冰箱保存，靜置30小時(shí)后濾過，濾液回收己醇，加蒸觸水至25ml，高 壓滅菌，置4C冰箱保存，生藥濃度為2g/ml。
[0031] 實(shí)施例6白鮮皮、苦參、僵蠶、白花藤、白立、白及醇提物的制備(H) 分別取白鮮皮、苦參、僵蠶、白花藤、白立、白及各50g，加300ml蒸觸水浸泡20分鐘，煎 煮1次，時(shí)間為1. 5小時(shí)，合并煎液，濃縮至含藥量約2g/ml，冷卻至室溫，加無水己醇，使含 己醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)80%，4C冰箱保存，靜置18小時(shí)后濾過，濾液回收己醇，加蒸觸水至25ml， 高壓滅菌，置4°C冰箱保存，生藥濃度為2g/ml。
[0032] 實(shí)施例7各提取物對(duì)白色念珠菌的體外抑制作用 1材料與方法 1.1材料 1.1.1藥物及試劑 白鮮皮、苦參、僵蠶、白花藤、白立、白及中草藥原料均由上海萬仕誠國藥制品有限公 司提供，產(chǎn)地及批號(hào)如下：白鮮皮（黑龍江080625)、僵蠶(浙江081101)、白花藤(湖北 080918)、苦參（山西081016)、白立(安徽080929)、白及（四川081119)。
[0033] 氣康哇購自中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)100314-200503。
[0034] 1. 1. 2試驗(yàn)菌株 國際標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC76615,由上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所口腔微生物實(shí)驗(yàn)室提供，經(jīng)酵母菌 生化卡（Vitek, E23K)鑒定為白色念珠菌（Bionumber 555017411)。
[00；35] 1. 1. 3 培養(yǎng)基 ①沙保勞氏瓊脂(上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司，20080303) 63g，加氯霉素50mg，蒸觸水 IOOOml,高壓滅菌。
[0036] ②RPMI1640液體培養(yǎng)基；RPMI1640粉劑（GIBC0 1381654)(含谷氨醜胺，不含碳 酸氨軸）10. 4g，H氮嗎啡晰丙賴酸 34. 53g (SIGMA 018K0724)，蒸觸水 900ml，W lmol/1 的 化OH調(diào)節(jié)抑至7. 0,加蒸觸水定容至1000ml，用Millipore濾過滅菌（濾膜0. 22 y m)，置 4 C冰箱備用。
[0037] 1. 1. 4主要儀器 超凈工作臺(tái)（蘇州YJ-875DA)、麥?zhǔn)媳葷峁埽╞iomerieux 806814701)、無菌96孔板 (Greiner 08230135)、Millipore (MILLEX R8BM7645)。
[0038] 1. 2 方法 參照 N(XLS M27-A2 (N(XLS, Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts ；Approved standard. NCCLS document M27-A2. N(XLS，Wayne[S].化nnsylvania. 2002,17(9) :1-29.)推薦的肉湯微量稀釋法酵母菌藥敏 性試驗(yàn)進(jìn)行。
[0039] 1.2. 1藥物及標(biāo)準(zhǔn)品的制備 參照實(shí)施例1和4的方法，分別制備各中草藥原料藥的水提物W及醇提物。
[0040] 氣康哇用無菌蒸觸水配制成1280 y g/ml的膽存液，用Millipore濾過滅菌(濾膜 0. 22 y m)，分裝后置-80°C冰箱膽存?zhèn)溆谩?br> [0041] 1.2. 2微量藥敏板制備 配制好的藥液4C冰箱靜置24小時(shí)W上，取上清液進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。將藥液及標(biāo)準(zhǔn)品膽 存液用RPMI1640液體培養(yǎng)基為稀釋液進(jìn)行倍比稀釋，使前述四味中草藥水提物及六味中 草藥醇提物的起始質(zhì)量濃度為500mg/ml，終末質(zhì)量濃度為0. 976563mg/ml，使氣康哇的起 始質(zhì)量濃度為128 y g/ml，終末質(zhì)量濃度為0. 25 y g/ml，W上各藥物及標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度均 為2倍應(yīng)測試藥物質(zhì)量濃度。將稀釋好的藥液對(duì)應(yīng)加在無菌96孔板中，從第1孔至第10 孔濃度由高到低，每孔IOOy 1。第11、12孔加不含藥液的RPMI1640液體培養(yǎng)基，其中第11 孔為生長對(duì)照，第12孔為空白對(duì)照。加畢，藥敏板用鉛鉛紙密封后放置-8(TC保藏備用。
[0042] 1. 2. 3菌息液制備及接種 將白色念珠菌接種在沙堡氏瓊脂培養(yǎng)基上，置35C，傳代培養(yǎng)。挑取生長24小時(shí)的菌 落，用0. 85 %的無菌氯化軸水溶液制成菌息液，經(jīng)麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)整其濁度達(dá)到0. 5麥?zhǔn)蠘?biāo) 準(zhǔn)，相當(dāng)于每毫升含1?5Xl〇6菌落形成單位（CFU/ml)，用RPMI1640液體培養(yǎng)基1:50稀 釋后再1:20稀釋(共稀釋1000倍）至菌含量為1?5X 1〇3 CFU/ml (2倍于終濃度)。將冷 藏的藥敏板按-2(TC、4°C、室溫各Ih的融化程序融化后置超凈工作臺(tái)上。用微量移液器W 從第11孔至第1孔的順序每孔加100 U L菌息液(此時(shí)各孔藥液和菌息液均分別達(dá)到應(yīng)測 試的濃度)，第12孔不加，見圖1。
[0043] 1. 2. 4培養(yǎng)及結(jié)果判定 接種后96孔藥敏板置35C培養(yǎng)48小時(shí)，觀察受試菌生長情況，讀取結(jié)果。結(jié)果判斷 的前提是生長對(duì)照良好，空白對(duì)照無菌生長清晰，其它孔隨藥物濃度梯度升高而菌的生長 受到抑制。判讀標(biāo)準(zhǔn)如下；與生長對(duì)照孔比較，將測試孔菌株生長抑制情況進(jìn)行對(duì)比，0分 為肉眼觀察清晰；1分為輕度模糊；2分為濁度顯著降低(約抑制50%受試菌生長);3分為濁 度輕度降低；4分為濁度不減低。氣康哇組W濁度顯著降低(約抑制50%受試菌生長）孔（2 分）為MIC判斷終點(diǎn)。每次試驗(yàn)W氣康哇作為陽性對(duì)照藥物，其MIC值位于M27-A2規(guī)定的 范圍，則認(rèn)為該次試驗(yàn)結(jié)果有效。將每孔內(nèi)生長情況與生長對(duì)照孔內(nèi)情況比較，參照氣康哇 的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)臨界點(diǎn)，W生長被抑制50%判定為MIC值，并規(guī)定受試藥物的MIC值低于 或等于62. 5mg/ml為具有抗白色念珠菌活性。每種藥物每次實(shí)驗(yàn)同時(shí)做4排，每種藥物重 復(fù)3次試驗(yàn)，取平均值作為該藥物的MIC值。
[0044] 2 結(jié)果 生長對(duì)照孔均生長良好，空白對(duì)照孔無菌落生長清晰，且陽性對(duì)照藥物氣康哇MIC值 位于M27-A2規(guī)定的范圍。對(duì)4種中藥水提物（白鮮皮、僵蠶、白花藤、苦參）W及6種中藥 醇提物（白鮮皮、僵蠶、白花藤、苦參、白立、白及）藥敏測定的MIC值表明，白鮮皮水提物、苦 參水提物、苦參醇提物具有抗白色念珠菌活性，其MIC值見表1，分別為；62.5、15. 625 W及 62. 5mg/ml。
[0045] 表1各中草藥提取物對(duì)白色念珠菌的MIC值

【權(quán)利要求】
1. 一種白鮮皮水提物，其特征在于，所述的白鮮皮水提物的制備方法包括以下步驟： 取白鮮皮加蒸餾水浸泡20-40min，回流提取1-3次，每次20-40min，合并濾液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白鮮皮水提物，其特征在于，所述的白鮮皮與蒸餾水的比例 為：1: (1-10) g/mL。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白鮮皮水提物，其特征在于，所述的浸泡時(shí)間為30min ;回流 提取2次，每次30min。
4. 權(quán)利要求1-3任一所述的白鮮皮水提物在制備抑制白色念珠菌的藥物中的應(yīng)用。
5. -種抑制白色念珠菌的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物是由白鮮皮水 提物、苦參水提物、苦參醇提物按照以下體積比組成：（2-3): (2-3): (2-3)，其中所述的鮮 皮水提物、苦參水提物、苦參醇提物的生藥濃度相同； 所述的白鮮皮水提物的制備方法包括以下步驟：取白鮮皮加蒸餾水浸泡20-40min，回 流提取1-3次，每次20-40min，合并濾液； 所述的苦參水提物的制備方法包括以下步驟：取苦參加蒸餾水浸泡20-40min，回流提 取1-3次，每次20-40min，合并濾液； 所述的苦參醇提物的制備方法包括以下步驟：取苦參加蒸餾水浸泡20-40min，煎 煮1-3次，每次0. 5-1. 5小時(shí)，合并煎液，濃縮，冷卻至室溫，加乙醇使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá) 60% -80%，靜置18-30小時(shí)后濾過，濾液回收乙醇。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述的白鮮皮水提物、苦參水提 物、苦參醇提物體積比為：（2. 4-2. 6) : (2. 4-2. 6) : (2. 4-2. 6)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述的白鮮皮水提物、苦參水提 物、苦參醇提物體積比為：1:1:1。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述的白鮮皮水提物的制備方法 中，所述的浸泡時(shí)間為30min，回流提取2次，每次30min ;所述的苦參水提物的制備方法中， 所述的浸泡時(shí)間為30min，回流提取2次，每次30min ;所述的苦參醇提物的制備方法中，所 述的浸泡時(shí)間為30min，煎煮2次，每次1小時(shí)，靜置時(shí)間為24小時(shí)。
9. 權(quán)利要求5-9任一所述的藥物組合物在制備抑制白色念珠菌的藥物中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求5所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于，它包括以下步驟： a) 提取白鮮皮水提物：取白鮮皮加蒸餾水浸泡20-40min，回流提取1-3次，每次 20-40min，合并濾液； b) 提取苦參水提物：取苦參加蒸餾水浸泡20-40min，回流提取1-3次，每次20-40min， 合并濾液； c) 提取苦參醇提物：取苦參加蒸餾水浸泡20-40min，煎煮1-3次，每次0. 5-1. 5小時(shí)， 合并煎液，濃縮，冷卻至室溫，加乙醇使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)60% -80%，靜置18-30小時(shí)后濾 過，濾液回收乙醇； d) 將所述的白鮮皮水提物、提取苦參水提物和苦參醇提物按以下體積比混合： (2. 4-2. 6) : (2. 4-2. 6) : (2. 4-2. 6)，其中所述的白鮮皮水提物、提取苦參水提物和苦參醇 提物的生藥濃度相同。
【文檔編號(hào)】A61K36/75GK104224996SQ201410489534
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月23日
【發(fā)明者】周曾同, 沈雪敏 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院