薯蕷皂苷在制備腎損傷保護(hù)藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了薯蕷皂苷在制備腎損傷保護(hù)藥物中的應(yīng)用，薯蕷皂苷具有腎損傷保護(hù)作用，可用于制成腎損傷保護(hù)藥物。薯蕷皂苷對腎損傷而引起的NO、TNOS、iNOS、MDA尿素氮（BUN）和尿肌酐（SCr）升高具有明顯的下調(diào)作用，對SOD、GSH、GSH-Px及CAT均較Model組的降低具有明顯上調(diào)作用，均具有劑量依賴性。經(jīng)薯蕷皂苷干預(yù)后，腎損傷導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞普遍腫脹，刷狀緣消失、部分上皮細(xì)胞變性壞死，壞死脫落的細(xì)胞碎屑充塞管腔等現(xiàn)象明顯減輕。根據(jù)臨床用藥需求，可將薯蕷皂苷作為主要有效成分制成藥物制劑。薯蕷皂苷具有安全（無毒副作用）、有效、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】薯蕷皂苷在制備腎損傷保護(hù)藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種薯蕷皂苷的具體應(yīng)用，特別是薯蕷皂苷在制備腎損傷保護(hù)藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]腎臟，是人體的重要器官，用于保證機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，使新陳代謝得以正常進(jìn)行。腎損傷是泌尿外科常見的急癥之一，對腎損傷做出適當(dāng)?shù)闹委煼桨?，對減輕患者的傷情，改善預(yù)后情況至關(guān)重要。因此，近年來腎損傷保護(hù)藥物在不斷的研究和開發(fā)之中。研究發(fā)現(xiàn)中藥對腎損傷具有明顯的保護(hù)作用，已開發(fā)的藥物有下列幾類。I)黃酮類，如水飛薊素、銀杏黃酮、三羥基查爾酮等；2)三萜皂苷類，如人參皂苷、三七總皂苷；3)多糖類；4)多酚類物質(zhì)；5)生物堿類。薯蕷皂苷(D1scin)是一種天然留體皂苷類化合物，在薯蕷科植物中含量最為豐富?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)薯蕷皂苷具有抗腫瘤作用，可以誘導(dǎo)人子宮頸癌Hela細(xì)胞的凋亡；抗肝纖維化作用，可以有效改善四氯化碳和撲熱息痛誘導(dǎo)的肝損傷；可改善心血管功能，已作為地奧心血康、維奧欣等降脂藥物的主要成分；同時(shí)還具有調(diào)節(jié)免疫、抗血小板聚集等藥理作用。但迄今為止，未見薯蕷皂苷在腎損傷保護(hù)及在制備腎保護(hù)藥物中應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述不足，提出一種薯蕷皂苷在制備腎損傷保護(hù)藥物中的應(yīng)用。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:薯蕷皂苷在制備腎損傷保護(hù)藥物中的應(yīng)用。
[0005]薯蕷皂苷在制備急性腎損傷保護(hù)藥物中的應(yīng)用。
[0006]薯蕷皂苷在制備慢性腎損傷保護(hù)藥物中的應(yīng)用。
[0007]以薯蕷皂苷為化學(xué)成分制備腎損傷保護(hù)的藥物。
[0008]薯蕷皂苷在制備由腎缺血再灌注導(dǎo)致的急性腎損傷保護(hù)藥物中的應(yīng)用。
[0009]薯蕷皂苷在制備由單側(cè)輸尿管結(jié)扎導(dǎo)致的慢性腎纖維化保護(hù)藥物中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn):
經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷對腎損傷而引起的NO、TNOS, iNOS、MDA尿素氮(BUN)和尿肌酐(SCr)升高具有明顯的下調(diào)作用，對SOD、GSH、GSH-Px及CAT均較Model組的降低具有明顯上調(diào)作用，均具有劑量依賴性。經(jīng)薯蕷皂苷干預(yù)后，腎損傷導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞普遍腫脹，刷狀緣消失、部分上皮細(xì)胞變性壞死，壞死脫落的細(xì)胞碎屑充塞管腔等現(xiàn)象明顯減輕。根據(jù)臨床用藥需求，可將薯蕷皂苷作為有效成分制成藥物制劑。以薯蕷皂苷作為主要有效成分制備腎損傷保護(hù)藥物，具有安全(無毒副作用)、有效、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1本發(fā)明實(shí)施例1薯蕷皂苷對腎缺血再灌注大鼠生化指標(biāo)的影響。
[0012]圖2本發(fā)明實(shí)施例1薯蕷皂苷對腎缺血再灌注大鼠保護(hù)作用的腎臟BrdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，TUNEL染色:熒光素標(biāo)記(200 X)和組織病理學(xué)H&E染色圖(100X)。
[0013]圖3本發(fā)明實(shí)施例1薯蕷皂苷對腎缺血再灌注大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)的影響。
[0014]圖4本發(fā)明實(shí)施例1薯蕷皂苷對缺血再灌注大鼠腎臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響。
[0015]圖5本發(fā)明實(shí)施例1薯蕷皂苷對缺血再灌注大鼠炎癥因子的影響。
[0016]圖6本發(fā)明實(shí)施例2薯蕷皂苷對單側(cè)輸尿管結(jié)扎導(dǎo)致的腎纖維化大鼠腎重的影響。
[0017]圖7本發(fā)明實(shí)施例2薯蕷皂苷對單側(cè)輸尿管結(jié)扎導(dǎo)致的腎纖維化大鼠生化指標(biāo)的影響。
[0018]圖8本發(fā)明實(shí)施例2薯蕷皂苷對單側(cè)輸尿管結(jié)扎導(dǎo)致的腎纖維化大鼠腎組織病理學(xué)考察結(jié)果。
[0019]圖9本發(fā)明實(shí)施例3薯蕷皂苷對腎小管上皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型的治療作用的MTT分析結(jié)果。
[0020]圖10本發(fā)明實(shí)施例3薯蕷皂苷對腎小管上皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型的治療作用的細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0021 ] 下面將說明本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】。
[0022]實(shí)施例1薯蕷皂苷對腎缺血再灌注大鼠急性腎損傷的預(yù)防作用研究
1.實(shí)驗(yàn)方法
1.1動(dòng)物模型建立及分組
8-10周健康成年SD雄性大鼠50只，隨機(jī)分成5組:假手術(shù)組(Sham)，缺血再灌注組(Model),高劑量給藥組(薯菌阜苷60 mg/kg),中劑量給藥組(薯菌阜苷40 mg/kg),低劑量給藥組(薯蕷皂苷20 mg/kg)。給藥組給藥7天后進(jìn)行手術(shù)。
[0023]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前12 h禁食，自由進(jìn)水，術(shù)前以10%水合氯醛溶液(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，固定于操作臺上。沿腹部正中線在中腹部正中切口，逐層切開分離皮膚、肌肉、腹白線進(jìn)入腹腔后，用止血鉗拉開兩側(cè)皮膚及腹部肌肉，用無菌紗布包裹腹腔內(nèi)胃腸等臟器并拉向左側(cè)，術(shù)中注意保護(hù)大血管，暴露右側(cè)腎臟，可見右側(cè)腎臟位于腹膜后，小心分離右側(cè)腎蒂后結(jié)扎，切除右側(cè)腎臟，于結(jié)腸脾曲外側(cè)切開后腹膜，暴露左側(cè)腎臟，游離左輸尿管和腎上腺避免損傷，再游離左腎蒂。假手術(shù)組(Sham)分離腎蒂但不夾閉左腎動(dòng)脈；Model組及高、中、低劑量給藥組持續(xù)夾閉左、右腎動(dòng)脈45 min再灌注24 h后處死。大鼠處死前再次用10%水合氯醛溶液(3.5 mL/kg)將大鼠麻醉，心臟采血，放入_20°C冰箱中保存，摘除左、右腎，放入-80°C冰箱中保存。
[0024]1.2生化指標(biāo)檢測
用試劑盒測定各組大鼠血尿毒氮(BUN)和血肌酐(Cr )。
[0025]1.3 BrdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
取Sham組，Model組，高、中、低劑量組動(dòng)物腎臟空白切片，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞增殖情況(棕色斑)。
[0026]1.4 TUNEL法檢測腎細(xì)胞凋亡取Sham組，Model組，高、中、低劑量組動(dòng)物腎臟空白切片，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。熒光顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞數(shù)(綠色斑)。
[0027]1.5腎組織病理學(xué)考察
處死動(dòng)物后，將一部分組織包埋進(jìn)石蠟中制成蠟塊，石蠟包埋組織標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片(厚度5 ym)，37°C烘干12 h后進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察各組腎臟損傷的形態(tài)學(xué)變化。形態(tài)學(xué)損害表現(xiàn):小管上皮細(xì)胞刷狀緣丟失、小管內(nèi)管型形成、小管擴(kuò)張、紅細(xì)胞溢出、炎癥和腎小管萎縮。
[0028]1.6透射電子顯微鏡檢查
取Sham組，Model組,高、中、低劑量組動(dòng)物腎臟樣品(3 mm X 3 mm),放入2%戍二醒中固定，包埋，用超薄切片術(shù)切片，染色。在透射電子顯微鏡觀察病理變化。
[0029]1.7分子機(jī)制的初步研究
用試劑盒測定各組大鼠腎臟組織超氧化物岐化酶(S0D)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO),一氧化氮合酶(iNOS、TNOS)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)。
[0030]1.7 Real-time PCR 分析
動(dòng)物肝臟中的RNA按照RNAiso Plus試劑盒操作步驟提取，計(jì)算提取的RNA樣本的純度和含量，分裝保存于-8(TC,以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。按照PrimeScript? RT reagent Kit withgDNA Eraser試劑盒說明書上的比例配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液,加入相應(yīng)的RNA樣本,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。按照SYBR>re?辦位Taqw II (Tli RNaseH Plus)試劑盒說明，進(jìn)行mRNA水平的測定。
[0031]1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean ±S.Ε.Μ.)表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。兩組間的均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；多組間均數(shù)樣本比較采用One-Way ANOVA方差分析；兩兩比較采用P檢驗(yàn)，當(dāng)/7〈0.05，認(rèn)為有顯著性差異。
[0032]2.結(jié)果
2.1各組大鼠腎功能的變化
通過測定腎損傷特征性生化指標(biāo)血尿毒氮(BUN)和血肌酐(Cr)考察薯蕷皂苷對腎損傷的預(yù)防作用。結(jié)果見圖1，Model組的SCr和BUN均明顯高于Sham組(P <0.05)，提示Model組大鼠由腎缺血再灌注誘導(dǎo)的腎損傷嚴(yán)重，而各給藥組的SCr及BUN均較Model組的SCr和BUN有明顯下降(P < 0.05)，且不同濃度給藥組的SCr和BUN均呈濃度依賴性降低，薯蕷皂苷濃度越大，SCr和BUN降低越大。說明薯蕷皂苷對腎缺血再灌注導(dǎo)致的肝損傷具有明顯的預(yù)防作用。
[0033]2.2 BrdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
BrdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見圖2。結(jié)果表明,Model組的細(xì)胞增殖數(shù)明顯低于Sham組和給藥組，且不同濃度給藥組的細(xì)胞增殖數(shù)具有劑量依賴性，隨著給藥劑量的增大，細(xì)胞增殖數(shù)增加。說明薯蕷皂苷可以促進(jìn)腎細(xì)胞的增殖。
[0034]2.3 TUNEL 測定結(jié)果
TUNEL測定結(jié)果見圖2所示，經(jīng)熒光素標(biāo)記后，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核發(fā)出綠色熒光。與Model組相比，給藥組中顯綠色熒光的陽性細(xì)胞數(shù)少于Model組。結(jié)果表明，薯蕷皂苷可以顯著減少缺血再灌注凋亡導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。
[0035]2.4各組大鼠腎組織HE染色結(jié)果
腎組織HE染色結(jié)果見附圖2，Sham組未見明顯的病理改變。Model組受損腎小管上皮細(xì)胞普遍腫脹，可見小管擴(kuò)張、刷狀緣消失、部分上皮細(xì)胞變性壞死，壞死脫落的細(xì)胞碎屑充塞管腔。經(jīng)薯蕷皂苷干預(yù)后，小管受損狀況明顯減輕，其中高劑量組改善最明顯，組織基本恢復(fù)正常。
[0036]2.5透射電子顯微鏡檢測結(jié)果
透射電鏡檢測結(jié)果見圖3。由結(jié)果可知，腎組織細(xì)胞中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的數(shù)量下降，大多數(shù)線粒體腫脹或畸形的，線粒體電子密度不均勻，線粒體嵴不清晰或消失，而薯蕷皂苷能明顯改善腎臟線粒體的受損情況。
[0037]2.6薯蕷皂苷對大鼠腎臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響
腎缺血再灌注可誘發(fā)腎臟的氧化應(yīng)激，造成腎損傷。如圖4所示，與Sham組相比，Model組中腎臟的 N0、TN0S、iNOS 及 MDA 均明顯高于 Sham 組(P < 0.05) ; SOD、GSH、GSH-Px 及 CAT均明顯低于sham組(P < 0.05)。而各給藥組的N0、TN0S、iN0S及MDA均較Model組有明顯下降(P < 0.05)，不同濃度給藥組的N0、TN0S、iN0S及MDA均呈濃度依賴性降低；S0D、GSH、GSH-Px及CAT均較I/R組有明顯升高(P < 0.05)，且不同濃度給藥組的SOD、GSH、GSH-Px及CAT均呈濃度依賴性升高。結(jié)果表明，薯蕷皂苷可以提高機(jī)體的抗氧化能力，有效減輕大鼠腎臟的脂質(zhì)過氧化和自由基損傷，改善腎功能。
[0038]2.7薯蕷皂苷對炎癥因子的影響
薯蕷皂苷對炎癥因子的作用結(jié)果如圖5所示。給藥組與模型組相比有顯著性差異(p <
0.01)，11^1，幾-6和了即-0的表達(dá)水平明顯下調(diào)，且呈薯蕷皂苷劑量依賴性。說明薯蕷皂苷可以通過抑制炎癥因子的表達(dá)而抵抗缺血再灌注誘導(dǎo)的腎損傷。
[0039]實(shí)施例2薯蕷皂苷對單側(cè)輸尿管結(jié)扎導(dǎo)致的大鼠腎纖維化的治療作用的研究
1.實(shí)驗(yàn)方法
1.1動(dòng)物模型建立及分組
雄性SD大鼠隨機(jī)分成5組，每組10只:假手術(shù)組(Sham組)，單側(cè)輸尿管結(jié)扎組(Model組)，高劑量給藥組(薯菌阜苷60 mg/kg),中劑量給藥組(薯菌阜苷40 mg/kg),低劑量給藥組(薯蕷皂苷20 mg/kg)。
[0040]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前12 h禁食，自由進(jìn)水，術(shù)前均用10%水合氯醛溶液(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉。Model組和給藥組:左側(cè)腹部切口打開腹腔，鈍性分離左側(cè)輸尿管，于中上1/3處以4-0線雙重結(jié)扎，分層縫合關(guān)閉腹腔。Sham組:左側(cè)輸尿管不予結(jié)扎，麻醉及其余手術(shù)步驟與模型組相同。術(shù)后第一天給藥組開始給藥，給藥四周后處死大鼠，處死前再次用10%水合氯醛溶液(3.5 mL/kg)將大鼠麻醉，心臟采血，放入_20°C冰箱中保存，摘除左腎，稱量，放入_80°C冰箱中保存。
[0041 ] 1.2腎組織生化指標(biāo)檢測
用試劑盒測定各組大鼠血尿毒氮(BUN)和血肌酐(Cr)。
[0042]1.3腎組織病理學(xué)考察
1.3.1腎臟HE染色
按照組織病理學(xué)常規(guī)方法，將固定于10%甲醛溶液中的腎臟組織包埋入石蠟中，切成5μ m的組織薄片，制成切片，經(jīng)蘇木精和伊紅染色(HE染色)后于100倍鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。
[0043]1.3.2天狼星紅苦味酸染色法(Sirius Red)
中性甲醛液固定組織，石蠟包埋組織標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片(厚度5 ym)，37°C烘干12 h后進(jìn)行染色:人天青石藍(lán)液染5?10 min,蒸懼水洗3次,天狼星紅飽和苦味酸染15?30 min,無水酒精直接分化和脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。光鏡下觀察各組腎臟損傷的形態(tài)學(xué)變化及組織纖維化程度。以lmage-Pix) Plus圖像分析軟件進(jìn)行自動(dòng)測量分析，計(jì)算腎間質(zhì)纖維組織相對面積(腎間質(zhì)綠染區(qū)面積/視野總面積X 100%)。
[0044]1.3.3 Masoon 染色
按照組織病理學(xué)常規(guī)方法，將固定于10%甲醛溶液中的肝臟組織包埋入石蠟中，切成5μ m的組織薄片,制成切片。組織固定于bouin氏液或zenker氏液,流水沖洗過夜,常規(guī)脫水包埋。切片脫臘至水，weigert鐵蘇木素(weigert鐵蘇木素A、B液等比例混和)染5?10min，流水稍洗，1%鹽酸酒精分化，流水沖洗數(shù)分，麗春紅酸性品紅染液染5-10 min，流水稍沖洗。磷鑰酸溶液處理約5分鐘，不用水洗，直接用苯胺藍(lán)人染液復(fù)染5 min。1%冰醋酸處理I min，95%酒精脫水多次。無水酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封固。
[0045]1.3.4 腎臟的 a-SMA 染色
按照組織病理學(xué)常規(guī)方法，將固定于10%甲醛溶液中的肝臟組織包埋入石蠟中，切成5μπι的組織薄片，制成切片。使用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行染色，所用一抗為α-SMA。二抗為IgGF。無水酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封固。
[0046]2.結(jié)果
2.1單側(cè)輸尿管結(jié)扎對大鼠腎臟的影響
摘下的腎臟的形態(tài)、大小見圖6，根據(jù)左腎的稱量結(jié)果計(jì)算腎重/體重比，結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，當(dāng)對大鼠進(jìn)行單側(cè)輸尿管結(jié)扎后，大鼠的腎臟明顯腫大，當(dāng)采用薯蕷皂苷進(jìn)行干預(yù)后，腎臟大小得到一定的控制。
[0047]2.2各組大鼠腎功能的變化
對大鼠單側(cè)輸尿管結(jié)扎可導(dǎo)致的腎纖維化，結(jié)果見圖7。Model組的SCr和BUN均明顯高于Sham組(P < 0.05)，而各給藥組的SCr及BUN均較Model組有明顯下降(P < 0.05)。不同濃度給藥組的SCr和BUN均呈濃度依賴性降低。
[0048]2.3各組大鼠腎組織病理學(xué)考察結(jié)果
光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠HE染色切片，結(jié)果見圖8,HE染色顯示Sham大鼠腎臟病理未見明顯改變。Model組腎小球硬化，腎小管高度擴(kuò)張，小管基底膜變薄，間質(zhì)區(qū)細(xì)胞大量增生，間質(zhì)纖維化；薯蕷皂苷給藥組部分腎小球部分硬化，腎小管輕度擴(kuò)張，局灶性間質(zhì)區(qū)細(xì)胞增生，給藥組較Model組腎損傷程度有明顯改善。
[0049]膠原纖維是細(xì)胞外基質(zhì)成分之一，定量測定腎臟皮質(zhì)膠原含量，可以用來判斷腎臟間質(zhì)纖維化的程度。Masson染色法和Sirius Red都具有顯示大鼠腎臟膠原纖維的效果。附圖8中Sirius Red染色結(jié)果膠原呈紅色，胞核呈綠色，其他呈黃色。Masson染色結(jié)果膠原呈藍(lán)色，胞質(zhì)、肌纖維和紅細(xì)胞呈紅色，胞核呈藍(lán)褐色。兩種方法染色后測定的膠原面積無顯著差異。結(jié)果顯示，Sham組中的膠原纖維明顯少于Model，且給藥組中膠原纖維也明顯少于Model。因此，給藥組較Model組纖維化程度有明顯改善(P < 0.05)，不同濃度給藥組的纖維化程度均呈濃度依賴性降低。
[0050]腎臟的a -SMA染色結(jié)果(圖8)顯示，Model組的a -SMA陽性表達(dá)面積明顯多于Sham組，但給藥組較Model組有顯著的改善，且呈劑量依賴性。
[0051]本研究通過對腎功能生化指標(biāo)的檢測和組織病理學(xué)檢查，證明了薯蕷皂苷可以顯著減輕單側(cè)輸尿管結(jié)扎導(dǎo)致的腎纖維化，對腎損傷具有顯著的保護(hù)作用。
[0052]實(shí)施例3薯蕷皂苷對腎小管上皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型的治療作用的研究
1.實(shí)驗(yàn)方法
1.1 NRK-52E細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代及實(shí)驗(yàn)分組
從液氮罐中取出凍存的NRK-5 2E細(xì)胞，3 7 °C水浴解凍。吸出細(xì)胞懸液加入DMEM/F12(10%FBS)培養(yǎng)液，1000 r/min離心5 min,棄上清液后再重復(fù)洗滌I次。用DMEM/F12(10%FBS)培養(yǎng)液稀釋混勻，接種于50 ml培養(yǎng)瓶中，37°C下置于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置12 h，換液除去未貼壁細(xì)胞后至細(xì)胞長滿成片80%以上，用0.25%的胰酶消化傳代。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為5大組，分別為空白組、模型組、三個(gè)劑量給藥組，各大組又分為3小組，分別培養(yǎng)不同的時(shí)間3 h,6 h和9 ho
[0053]1.2 NRK-52E細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型的建立和MTT分析
將已匯合約80%的細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中消化成單個(gè)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至IXlO5個(gè)細(xì)胞，并接種于96孔板中，5%C02，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組中用PBS沖洗，再加入實(shí)驗(yàn)前預(yù)沖高純氮?dú)?0 min的缺氧液，再置入已調(diào)整為94%氮?dú)猓?%C02，1%02的37°C飽和濕度三氣培養(yǎng)箱。實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)時(shí)間按預(yù)先設(shè)計(jì)分別為3，6，9 h，在缺氧相應(yīng)時(shí)間后，用PBS洗滌，加入DMEM/F12 (10%FBS)培養(yǎng)液，給藥組給予200，100和50 ng/ml的薯蕷皂苷，置入5%C02，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。以未缺氧/復(fù)氧的細(xì)胞作為空白組，另設(shè)置空白調(diào)零孔，每個(gè)實(shí)驗(yàn)小組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。在各個(gè)時(shí)間段的前4個(gè)小時(shí)加入10 μ I MTT (5 mg/ml)，4小時(shí)后加入100 μ I三聯(lián)液，于孵箱中培養(yǎng)過夜，酶標(biāo)儀測定吸光度A57tl,計(jì)算缺氧復(fù)氧后的存活率。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0054]1.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
將已匯合約80%的細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中消化成單個(gè)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至IXlO5個(gè)細(xì)胞，并接種于6孔板中，5%C02，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組中用PBS沖洗，再加入實(shí)驗(yàn)前預(yù)沖高純氮?dú)?0 min的缺氧液，再置入已調(diào)整為94%氮?dú)猓?% CO2,1%02的37°C飽和濕度三氣培養(yǎng)箱。實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)時(shí)間為6 h，在缺氧相應(yīng)時(shí)間后，用PBS洗滌，加入DMEM/F12 (10%FBS)培養(yǎng)液，給藥組給予200，100和50 ng/ml的薯蕷皂苷，置入5%C02，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,在倒置光學(xué)顯微鏡下拍照。
[0055]2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
MTT測定結(jié)果見圖9，當(dāng)缺氧6 h/復(fù)氧12 h時(shí)細(xì)胞存活率在55%左右。細(xì)胞缺氧6h/復(fù)氧12 h后，薯蕷皂苷作用9 h后，50、100、200、400 ng/mL薯蕷皂苷細(xì)胞存活率分別是63.77%、76.17%、83.23%、78.28%。不同劑量(50,100,200 ng/mL)和不同處理時(shí)間(3、6 和9 h)的薯蕷皂苷對細(xì)胞存活率的影響情況見圖。由圖可見，在相同作用時(shí)間下，隨著給藥劑量的加大，薯蕷皂苷使缺氧/復(fù)氧后的細(xì)胞存活率均逐漸增大，但6 h與9 h時(shí)，不同給藥劑量細(xì)胞存活率很接近；在相同給藥劑量時(shí)，隨著給藥時(shí)間的延長，薯蕷皂苷使缺氧/復(fù)氧后的細(xì)胞存活率也有所增大，但當(dāng)藥物作用時(shí)間9 h，給藥濃度在200 ng/mL時(shí)細(xì)胞存活率最大，達(dá)到84%。
[0056] NRK-52E細(xì)胞缺氧6 h/復(fù)氧12 h模型和給藥后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)圖譜見圖10。結(jié)果表明薯蕷皂苷對缺氧6 h/復(fù)氧12 h導(dǎo)致的NRK-52E細(xì)胞損傷具有治療作用。
【權(quán)利要求】
1.薯蕷皂苷在制備腎損傷保護(hù)藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的薯蕷皂苷在制備腎損傷保護(hù)藥物中的應(yīng)用，其特征在于:薯蕷皂苷在制備急性腎損傷保護(hù)藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的薯蕷皂苷在制備腎損傷保護(hù)藥物中的應(yīng)用，其特征在于:薯蕷皂苷在制備慢性腎損傷保護(hù)藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的薯蕷皂苷在制備腎損傷保護(hù)藥物中的應(yīng)用，其特征在于:以薯蕷皂苷為化學(xué)成分制備腎損傷保護(hù)的藥物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的薯蕷皂苷在制備腎損傷保護(hù)藥物中的應(yīng)用，其特征在于:薯蕷皂苷在制備由腎缺血再灌注導(dǎo)致的腎損傷保護(hù)藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的薯蕷皂苷在制備腎損傷保護(hù)藥物中的應(yīng)用，其特征在于--薯蕷皂苷在制備由單側(cè)輸尿管結(jié)扎導(dǎo)致的腎纖維化保護(hù)藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P13/12GK104352508SQ201410511379
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月29日
【發(fā)明者】彭金詠, 尹連紅, 鄭玲俐, 齊蒙, 許麗娜, 齊艷, 許有威, 韓旭, 趙艷艷 申請人:大連醫(yī)科大學(xué)