一種Erk信號通路抑制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種Erk信號通路抑制劑，屬于細胞生物學領(lǐng)域。本發(fā)明首次確定了可以抑制Erk1/2信號通路的結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白Mce3E，并且發(fā)現(xiàn)Mce3E是通過空間調(diào)控Erk1/2蛋白而實現(xiàn)對Erk1/2信號通路的抑制。本發(fā)明成果可為臨床多種疾病的治療提供新的工具和思路，尤其在抗腫瘤等多種藥物的開發(fā)和臨床應用等方面將有著廣闊的前景，也可以直接應用于科研領(lǐng)域或指導開發(fā)Erk1/2的抑制劑。此外，該成果還對尋找新的藥物靶點和篩選新藥具有重要的理論意義。
【專利說明】一種Erk信號通路抑制劑

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種Erk信號通路抑制劑，是一種能抑制Erk信號通路的結(jié)核分枝桿 菌分泌蛋白，屬于細胞生物學領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核病（Tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis， Mtb)引起的一種古老疾病，它致今仍是嚴重威脅全球人類健康的傳染病之一。
[0003] 通過比較基因組學的研究，研究人員發(fā)現(xiàn)用于預防結(jié)核病的疫苗卡介苗（Bacilli CalmetteGuerin,簡稱BCG)的基因組相比人結(jié)核分枝桿菌Mtb有16段缺失，這些相應的 區(qū)域在Mtb基因組中被命名為RD1-RD16,并且研究表明這些RD區(qū)所編碼的蛋白對于Mtb 的致病性有至關(guān)重要的作用。在這些RD區(qū)中，RD15包含Mce3A-F六個基因。Mtb基因組 中共有四個mce操縱子（mcel-4)，每個操縱子編碼MceA-F六個蛋白。之前有研究發(fā)現(xiàn)在 大腸桿菌中過表達McelA蛋白使得該非致病性細菌能夠入侵巨噬細胞，并且能夠在巨噬細 胞中存活。進一步實驗發(fā)現(xiàn)包被有McelA蛋白的珠子能夠進入非吞噬性的HeLa細胞。此 外還有研究表明Mcel操縱子能夠調(diào)控小鼠巨噬細胞炎癥因子的表達，mce3操縱子缺失的 Mtb感染的小鼠有更長的存活期，其肺組織研磨后涂板有更少的菌落數(shù)，肺組織切片顯示肺 組織病變不明顯。以上這些研究結(jié)果提示：mce3操縱子對Mtb的存活、毒力以及致病性起 重要作用。但到目前為止，有關(guān)Mce3E蛋白對炎癥和免疫相關(guān)信號通路的研究還是一個空 白。而研究Mce3E蛋白是否調(diào)控Erkl/2信號通路以及Mtb的胞內(nèi)存活并從分子水平上闡 明其起作用的具體分子機制，將促進人們對Mtb致病性的理解，為診斷以及治療結(jié)核病提 供新的線索和分子靶標。
[0004]Erkl/2是由Boulton等在20世紀90年代初期先后分離鑒定出的一種蛋白激酶， 分子質(zhì)量分別為44kD和42kD，它們有90%的同源性。目前對Erkl/2信號通路的激活過程 及生物學意義已有了較深入的認識，Erkl/2信號通路的活化是將信號從細胞膜表面受體轉(zhuǎn) 導至核內(nèi)的關(guān)鍵，參與這一轉(zhuǎn)導過程的有6了? &%、1^8、1^卜1、絲/蘇氨酸激酶和1^1(1/2雙 特異性激酶等；Erkl/2信號通路是由一個小GTP蛋白連接活化的受體酪氨酸激酶和胞漿蛋 白組成的級聯(lián)反應，其活化的中心是使Ras進行鳥苷酸交換變成其活化形式Ras-GTP，并需 要Ras、Raf-l蛋白參與。PD98059和U0126是Erkl/2信號通路的特異性抑制劑，它們可以 通過抑制MEK1/2的活性阻止Erkl/2的磷酸化，從而起到阻斷Erkl/2信號通路的作用。平 時Erkl/2位于胞楽內(nèi)，一旦被激活,Erkl/2迅速穿過核膜并通過磷酸化反應調(diào)節(jié)某些轉(zhuǎn)錄 因子的活性如NF-AT、AP-I、NF-κB等，這些轉(zhuǎn)錄因子進一步調(diào)節(jié)它們各自靶基因的轉(zhuǎn)錄， 引起特定蛋白的表達或活性改變，最終調(diào)節(jié)細胞代謝和功能并影響細胞產(chǎn)生特定的生物學 效應。研究還表明，Erkl/2信號通路的激活能促進T淋巴細胞的活化、增殖并抑制其凋亡， 轉(zhuǎn)錄因子NF-AT、AP-I和NF-κB可能是Erkl/2信號通路影響T淋巴細胞生物學行為的關(guān) 鍵環(huán)節(jié)。已有大量實驗證實Erkl/2信號通路的活性與多種病理過程及重要疾病密切相關(guān)， 包括：炎癥反應、肝臟疾病、肥胖癥和糖尿病等代謝性疾病以及腫瘤等。因此，Erkl/2可作 為潛在的分子治療靶點，應用Erkl/2抑制劑進行多種疾病的治療將可能取得很好的臨床 效果。
[0005] 本發(fā)明提供了一種能抑制Erk信號通路的結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白Mce3E。我們還 發(fā)現(xiàn)Mce3E蛋白是通過與Erkl/2信號通路中的Erkl/2蛋白直接互作而實現(xiàn)對該通路的抑 制。進一步的研究結(jié)果還表明Mce3E定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，通過空間調(diào)控實現(xiàn)對Erkl/2信號通路 的抑制。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種Erkl/2信號通路抑制劑，尤其是一種 Erkl/2蛋白磷酸化和/或p-Erkl/2蛋白進入細胞核的抑制劑。所述抑制劑定位在內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)，通過空間調(diào)控抑制Erkl/2信號通路；所述抑制劑與Erkl/2蛋白直接互作，使Erkl/2蛋 白與抑制劑共定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中而無法被磷酸化；所述抑制劑與p-Erkl/2蛋白直接互作，使 p-Erkl/2蛋白與抑制劑共定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中而無法進入細胞核。
[0007] 所述抑制劑是結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白Mce3E，其氨基酸序列如（a)或（b)或（C): [0008](a)SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；
[0009] (b)在（a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個氨基酸或幾個氨基酸且具 有結(jié)合Erkl/2活性的由（a)衍生的多肽或其類似物；
[0010] (c)與（a)、（b)中氨基酸序列整體相似度在85%以上的由（a)衍生的多肽或其類 似物。
[0011] 本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供所述抑制劑的制備方法，包括以下步驟：
[0012] (1)構(gòu)建含有編碼Mce3E蛋白的基因的重組質(zhì)粒pGEX-6P-l-Mce3E，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 到大腸桿菌BL21中，以IPTG誘導蛋白表達；
[0013] (2)超聲破菌，高速離心后收取上清液，將上清液流過填充好的 Glutathione-Sepharose beads中，然后加入柱洗漆緩沖液充分洗漆柱子，最后加入含有谷 胱甘肽的洗脫液洗脫蛋白，將收集的洗脫液加入到IOkD的蛋白濃縮管中，離心濃縮；
[0014] (3)在蛋白濃縮管中加入PBS混勻后離心、分裝蛋白，-80°c保存待用。
[0015] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌分泌性效應蛋白Mce3E可以抑制Erkl/2信號通路并抑 制Erkl/2的磷酸化。進一步研究發(fā)現(xiàn)Mce3E定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并通過與Erkl/2和p-Erkl/2 直接互作將其隔離到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而一方面阻止Erkl/2的磷酸化，一方面阻止已活化的 p-Erkl/2入核。本發(fā)明不但找到了可以抑制Erkl/2信號通路的結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白 Mce3E，更重要的是我們發(fā)現(xiàn)其活性調(diào)控機制。由于臨床上多種疾病的發(fā)生都與高水平的 p-Erkl/2相關(guān)，因此抑制這種蛋白的磷酸化水平對于很多疾病都有控制作用。本發(fā)明成果 將來可為臨床多種疾病的治療提供新的工具和思路，尤其在抗腫瘤等多種藥物的開發(fā)和臨 床應用等方面將有著廣闊的前景，也可以直接應用于科研領(lǐng)域或指導開發(fā)Erkl/2通路的 抑制劑。此外，該成果還對尋找新的藥物靶點和篩選新藥具有重要的理論意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖I: (A)Mce3E能抑制Erkl/2信號通路；（B)Mce3E抑制Erkl/2磷酸化。
[0017]圖2 :Mce3E與Erkl/2相互作用。
[0018] 圖3 :Mce3E定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。
[0019] 圖4:(A)Mce3E將Erkl/2隔離到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，阻止MEKl激活Erkl/2;(B)同時將 p-Erkl/2隔離到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而阻止p-Erkl/2入核；（C)Mce3E蛋白在體外不能阻止Erk2蛋 白的磷酸化。

【具體實施方式】
[0020] 以下實施例用作對本發(fā)明的進一步解釋，不作為限制。如無特殊說明，采用的出發(fā) 質(zhì)粒、細胞、抗體、探針等為商業(yè)化廣品。
[0021] 實施例1結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白Mce3E
[0022] 可以阻止宿主Erkl/2蛋白磷酸化的結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白Mce3E，其氨基酸序列 如SEQ ID NO: 1所示。Mce3E及其結(jié)構(gòu)類似物可用于Erkl/2活性抑制劑的開發(fā)。Erk2基 因序列如GeneID:5594所示，MEKl基因的序列如GeneID:5604所示。
[0023] 實施例2Mce3E能夠抑制Erkl/2通路的活化，并且可以阻止Erkl/2蛋白的磷酸化
[0024]㈧采用雙熒光報告基因技術(shù)檢測Mce3E對Erkl/2通路活化的影響
[0025] 1)構(gòu)建含有編碼Mce3E基因的重組質(zhì)粒p3XFlag-CMV14_Mce3E;
[0026] 2)構(gòu)建含有編碼MEKl-ED基因（SEQIDNO. 2)的重組質(zhì)粒pCS2HA-MEKl-ED，采用 重疊延伸PCR法將MEKl蛋白中的218位絲氨酸以及222位絲氨酸分別突變?yōu)楣劝彼岷吞?冬氨酸后獲得MEKl-ED基因片段；
[0027] 3)采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒p3XFlag-CMV14-Mce3E和檢測Erkl/2通路活化 情況的質(zhì)粒pGal4-Elk、pGal4-luc、pRL_TK(購買自Promega公司）以及表達Erkl/2通路 組成型激活劑HA-MEKl-ED的質(zhì)粒pCS2HA-MEKl-ED轉(zhuǎn)染進293T細胞；
[0028]4)轉(zhuǎn)染6h后換新鮮培養(yǎng)基，24h后用promega公司的試劑盒以及熒光測量儀檢測 Mce3E對Erkl/2通路活化的影響。
[0029](B)檢測Mce3E對Erkl/2蛋白磷酸化的影響
[0030] 將上述檢測熒光后的細胞裂解液用BCA法定量后用于WesternBlot實驗，用 p-Erkl/2抗體和Erkl/2抗體分別檢測Erkl/2的磷酸化水平和總Erkl/2蛋白量。
[0031](C)實驗結(jié)果分析
[0032] 雙熒光報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果表明Mce3E可以顯著抑制由MEKl-ED激活的Erkl/2通 路（見圖1中A);而對應的western實驗證明Mce3E可以下調(diào)p-Erkl/2水平（見圖1中 B);因此Mce3E是通過抑制Erkl/2的磷酸化而阻礙Erkl/2通路的活化。
[0033] 實施例3Mce3E蛋白能夠與Erk蛋白直接互作
[0034] (A)Mce3E蛋白的制備
[0035] 1)構(gòu)建含有編碼Mce3E基因的重組質(zhì)粒pGEX-6P-l_Mce3E，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸 桿囷BL21中；
[0036] 2)將攜帶質(zhì)粒的大腸桿菌BL21在30°C條件下加入IPTG誘導蛋白表達，誘導時間 為4h ;
[0037] 3)超聲破菌，高速離心后收取上清液；
[0038] 4)將上清液緩緩流過填充好Glutathione-Sepharose beads (GE公司，GST柱材 料）中，然后加入柱洗滌緩沖液充分洗滌柱子，最后加入2-3ml洗脫液洗脫蛋白；
[0039] 5)將收集的洗脫液加入到IOkD的蛋白濃縮管（millipore)中，3500rpm離心濃縮 20min；
[0040] 6)在蛋白濃縮管中加入2ml磷酸鹽緩沖液（PBS)混勻后同步驟5)重復離心；
[0041] 7)分裝蛋白，-80°c保存待用。
[0042] (B)Erk蛋白的制備
[0043] 1)構(gòu)建含有編碼Erk2基因（GeneID: 5594)的重組質(zhì)粒pMAL-c2x-Erk2,并將該質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中；
[0044] 2)將攜帶質(zhì)粒的大腸桿菌BL21在16°C條件下加入IPTG誘導蛋白表達，誘導時間 為 12h;
[0045] 3)超聲破菌，高速離心后收取上清液；
[0046] 4)將上清液緩緩流過填充好Amyloseresin(NewEnglandBioLabs公司）中，然 后加入柱洗滌緩沖液充分洗滌柱子，最后加入2-3ml洗脫液洗脫蛋白；
[0047] 5)將收集的洗脫液加入到IOkD的蛋白濃縮管（millipore)中，3500rpm離心濃縮 20min；
[0048] 6)在蛋白濃縮管中加入2ml磷酸鹽緩沖液（PBS)混勻后同步驟5)重復離心；
[0049] 7)分裝蛋白，_80°C保存待用。
[0050] (C)體外pull-down實驗
[0051] 1)將攜帶MBP_Erk2 蛋白的Amyloseresin(NewEnglandBioLabs公司）與 GST-Mce3E于4攝氏度共同孵育2h。
[0052] 2)WesternBlot檢測GST-Mce3E與MBP-Erk2 的結(jié)合情況。
[0053](D)實驗結(jié)果分析
[0054] 從圖2中可以看出，MBP標簽蛋白本身不能結(jié)合GST_Mce3E，而MBP_Erk2融合蛋白 可以有效地結(jié)合GST-Mce3E，這就說明Mce3E能夠與Erk直接互作。
[0055] 實施例4Mce3E蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并且通過空間調(diào)控Erkl/2蛋白實現(xiàn)對Erkl/2 信號通路的抑制
[0056] (A)Mce3E蛋白定位
[0057] 1)構(gòu)建含有Mce3E基因的重組質(zhì)粒pEGFP-Cl_Mce3E;
[0058] 2)通過Lipofectamine2000 (Invitrogen,Carlsbad,CA)轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 到鋪在蓋玻片上的HeLa細胞中；
[0059] 3)轉(zhuǎn)染6h后，更換新鮮含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；
[0060] 4) 24h后棄掉培養(yǎng)基，PBS洗滌細胞兩遍，然后依次用4%多聚甲醛固定細胞 10min、PBS洗滌細胞三遍、0. 5%TritonX-IOO穿透細胞10min、PBS洗滌細胞三遍、1 %BSA 封閉細胞30min;
[0061] 5)封閉完以后的細胞用Calnexin(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)探針）或Golgi-58K(高爾基探針）室 溫孵育Ih;
[0062] 6)PBS洗滌細胞三遍后用Alexa594紅色熒光二抗室溫孵育lh，之后PBS洗滌細胞 三遍并用含有DAPI(即4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）的封片劑封片并用于激光共聚焦顯微 鏡鏡檢；
[0063]7)實驗結(jié)果分析：如圖3所示，在HeLa細胞中Mce3E能夠很好的與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)探針 Calnexin共定位，而不與高爾基體探針Golgi-58K共定位，這表明Mce3E定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。
[0064] (B)Mce3E蛋白與Erkl/2、p-Erkl/2 蛋白共定位
[0065] 1)構(gòu)建含有Erk2基因的重組質(zhì)粒p3XFlag-CMV14-Erk2和含有 MEKl(GeneID:5604)基因的重組質(zhì)粒pcDNA3-MEKl ;
[0066] 2)通過Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒 p3XFlag-CMV14-Erk2和pEGFP-Cl-Mce3E或pcDNA3-MEKl共轉(zhuǎn)染到鋪在蓋玻片的HeLa細胞 中；
[0067] 3)轉(zhuǎn)染6h后，更換新鮮去血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；
[0068] 4) 24h后用于Erkl/2染色的細胞不用EGF(上皮生長因子）刺激，直接固定、透化 和封閉（如A中所述）；用于p-Erkl/2染色的細胞用EGF刺激15min后再固定、透化和封 閉；
[0069] 5)封閉完以后的細胞用Erkl/2抗體（Cell Signaling Technology)或 p-Erkl/2 (Cell Signaling Technology)抗體室溫孵育Ih ;
[0070] 6)PBS洗滌細胞三遍后用Alexa594紅色熒光二抗室溫孵育lh，之后PBS洗滌細胞 三遍并用含有DAPI的封片劑封片并用于激光共聚焦顯微鏡鏡檢；
[0071] 7)對于MEKl的染色分別用小鼠抗Myc -抗（Santa Cruz Biotecnology)和FITC 綠色熒光二抗；
[0072] 8)實驗結(jié)果分析：如圖4,在非活化的HeLa細胞中，Erk蛋白與MEKl蛋白均勻 地共定位在細胞質(zhì)中，而共轉(zhuǎn)染pEGFP-Cl-Mce3E質(zhì)粒后，Erk蛋白由細胞質(zhì)定位改為同 GFP-Mce3E蛋白共定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（圖4中A)，從而阻止了Erk蛋白與MEKl蛋白的結(jié)合；同 時EGF刺激后p-Erkl/2主要定位在細胞核中，而GFP-Mce3E可以與p-Erkl/2共定位在內(nèi) 質(zhì)網(wǎng)從而阻止p-Erkl/2的入核（圖4中B)。
[0073](C)體外去磷酸化實驗
[0074]DHis-MEKl-ED蛋白純化
[0075] ①構(gòu)建含有MEKl-ED基因（SEQIDNO. 2)的重組質(zhì)粒pET28a-MEKl-ED，并將該質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中；
[0076] ②將攜帶質(zhì)粒的大腸桿菌BL21在30°C條件下加入IPTG誘導蛋白表達，誘導時間 為6h;
[0077] ③超聲破菌，高速離心后收取上清液；
[0078] ④將上清液緩緩流過填充好Ni2+-NTA柱子中，然后加入柱洗滌緩沖液充分洗滌柱 子，最后加入2_3ml洗脫液洗脫蛋白；
[0079] ⑤將收集的洗脫液加入到IOkD的蛋白濃縮管（millipore)中，3500rpm離心濃縮 20min；
[0080] ⑥在蛋白濃縮管中加入2ml磷酸鹽緩沖液（PBS)混勻后同步驟⑤重復離心；
[0081] ⑦分裝蛋白，_80°C保存待用。
[0082] 2)GST-Erk2蛋白純化：構(gòu)建含有Erk2基因（GeneID:5594)的重組質(zhì)粒 pGEX-6P-l-Erk2,蛋白純化方法同GST-Mce3E蛋白的純化。
[0083] 3)將50ng His-MEKl-ED、200ng GST-Erk2以及1 μ g GST-Mce3E加入30 μ 1反應 緩沖液中，在30°C孵育30min，孵育緩沖液含IOmM HEPES，IOmM MgCl2, ImM MnCl2，pH7. 4;之 后用WesternBlot檢測p-Erk。
[0084] 4)實驗結(jié)果分析：盡管Mce3E蛋白在體外能夠結(jié)合Erk2蛋白（見圖2)，但純化的 Mce3E蛋白本身在體外不能阻止Erk2蛋白的磷酸化（如圖4中C)，這就說明Mce3E蛋白阻 止Erk蛋白磷酸化依賴于其定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，進而通過空間調(diào)控阻止Erk蛋白與其上游激 酶MEKl蛋白的互作，最終阻止Erk蛋白的磷酸化。
[0085]Mce3E抑制Erk的磷酸化依賴于Mce3E與Erk的互作，而它們之間的互作是通過 Mce3E蛋白中的一個Motif實現(xiàn)的，而這個Motif既可以用來結(jié)合Erk2,也可以用來結(jié)合 Erkl,因此本結(jié)論也適用于Erkl。
[0086] 雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應該以權(quán)利要求書所界定的為準。
【權(quán)利要求】
1. 一種Erkl/2蛋白磷酸化抑制齊[|，其特征在于，與Erkl/2蛋白直接互作，使Erkl/2蛋 白與抑制劑共定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中無法被磷酸化。
2. -種p-Erkl/2蛋白進入細胞核的抑制劑，其特征在于，與p-Erkl/2蛋白直接互作， 使p-Erkl/2蛋白與抑制劑共定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中無法進入細胞核。
3. -種Erkl/2信號通路抑制劑，其特征在于，通過與Erkl/2蛋白直接互作，使Erkl/2 蛋白與抑制劑共定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中無法被磷酸化；和/或與P-Erkl/2蛋白直接互作，使 p-Erkl/2蛋白與抑制劑共定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中無法進入細胞核，從而抑制Erkl/2信號通路。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的抑制劑，其特征在于，所述抑制劑是結(jié)核分枝桿菌分 泌蛋白Mce3E，其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。
5. 權(quán)利要求1-3任一所述的抑制劑在抑制Erkl/2信號轉(zhuǎn)導通路中的應用。
6. 權(quán)利要求1-3任一所述的抑制劑在制備治療與Erkl/2信號通路相關(guān)的疾病的藥物 中的應用。
7. -種制備要求4所述的抑制劑的方法，其特征在于， (1)構(gòu)建含有編碼Mce3E蛋白的基因的重組質(zhì)粒pGEX-6P-l-Mce3E，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大 腸桿菌BL21中，以IPTG誘導蛋白表達； ⑵超聲破菌，高速離心后收取上清液，將上清液流過填充好的 Glutathione-Sepharose beads中，然后加入柱洗漆緩沖液充分洗漆柱子，最后加入含有谷 胱甘肽的洗脫液洗脫蛋白，將收集的洗脫液加入到10kD的蛋白濃縮管中，離心濃縮； (3)在蛋白濃縮管中加入PBS混勻后離心、分裝蛋白，-80°C保存待用。
8. -種抑制Erkl/2蛋白磷酸化的方法，其特征在于，是通過氨基酸序列如SEQ ID NO: 1的蛋白Mce3E與Erkl/2蛋白進行結(jié)合，并共定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，以阻止Erkl/2與其上游激酶 MEK1的互作，從而阻止Erkl/2的磷酸化。
9. 一種阻止p-Erkl/2蛋白進入細胞核的方法，其特征在于，是通過氨基酸序列如SEQ ID NO :1的蛋白Mce3E與p-Erkl/2蛋白進行結(jié)合，并共定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)從而阻止p-Erkl/2蛋 白進入細胞核。
10. -種抑制Erkl/2信號轉(zhuǎn)導通路的方法，其特征在于，通過Mce3E與Erkl/2蛋白進 行結(jié)合，并共定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，以阻止Erkl/2與其上游激酶MEK1的互作，從而阻止Erkl/2的 磷酸化和Erkl/2信號通路的激活；和/或通過Mce3E與p-Erkl/2蛋白進行結(jié)合，并共定位 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)從而阻止P-Erkl/2蛋白進入細胞核，抑制Erkl/2信號通路的激活。
【文檔編號】A61K38/16GK104327172SQ201410523217
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月30日
【發(fā)明者】劉翠華, 李 杰, 汪靜 申請人:中國科學院微生物研究所