哈爾明堿的新應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了哈爾明堿的新應(yīng)用，該藥物無論在體內(nèi)和體外都能促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐色化，并能抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖以及葡萄糖不耐受和胰島素不敏感。
【專利說明】哈爾明堿的新應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種哈爾明堿的新應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 長期W來，一直被認(rèn)為脂肪細(xì)胞的主要功能是儲(chǔ)存能量。但隨著對脂肪細(xì)胞的深 入研究，脂肪細(xì)胞其它方面的功能也逐漸顯露出來。研究表明脂肪細(xì)胞在免疫反應(yīng)、高血 壓、服胖、膜島素抵抗等代謝疾病中都起著重要的作用。
[0003] 最初，脂肪細(xì)胞被分為兩類；白色脂肪細(xì)胞與褐色脂肪細(xì)胞。白色脂肪細(xì)胞內(nèi)含有 一個(gè)巨大的圓形脂滴，細(xì)胞核呈扁平狀且位于細(xì)胞邊緣。脂滴幾乎占據(jù)了細(xì)胞的99%的空 間。白色脂肪細(xì)胞主要是通過甘油H醋和膽固醇的形式，將能量儲(chǔ)存于脂滴當(dāng)中。但是白 色脂肪細(xì)胞不僅可W儲(chǔ)存能量，它還可W分泌脂肪細(xì)胞因子如；脂聯(lián)素、瘦素、抵抗素、腫瘤 壞死因子a等等。該些脂肪細(xì)胞因子在能量代謝調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)等多種生理現(xiàn)象中發(fā)揮著 重要作用。
[0004] 褐色脂肪細(xì)胞的外形呈多邊形，細(xì)胞核為圓形，且細(xì)胞內(nèi)的脂滴呈多室分布于整 個(gè)細(xì)胞中。褐色脂肪細(xì)胞含有大量的細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)，并且細(xì)胞內(nèi)的線粒體含量很高。因?yàn)榫€粒 體內(nèi)的細(xì)胞色素含有鐵原子，所W含有大量線粒體的褐色脂肪細(xì)胞的顏色為褐色。褐色脂 肪細(xì)胞不同于白色脂肪細(xì)胞的主要特征是：線粒體內(nèi)膜上的解偶聯(lián)蛋白1的表達(dá)量很高。 所W，褐色脂肪細(xì)胞的主要功能就是通過UCPl (解偶聯(lián)蛋白1)來產(chǎn)熱從而消耗能量而不產(chǎn) 生ATP ;即褐色脂肪細(xì)胞可W通過UCPl，將線粒體內(nèi)的電子傳遞鏈與ATP合成解偶聯(lián)，進(jìn)而 通過氧化磯酸化解偶聯(lián)呼吸，將脂肪酸目氧化產(chǎn)生的能量W熱量的形式散失掉。褐色脂肪 細(xì)胞的非顫栗性產(chǎn)熱功能，可W維持體溫恒定，也可W W熱能的方式消耗機(jī)體攝入的能量， 從而降低服胖發(fā)生。近年的研究表明，移植了褐色脂肪組織的小鼠能夠有效的抵抗高脂飲 食誘導(dǎo)的服胖和膜島素抵抗。
[0005] 隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)曬齒動(dòng)物腹股溝部位的白色脂肪組織內(nèi)也存 在高表達(dá)UCPl的和線粒體較多的類似于褐色脂肪細(xì)胞的細(xì)胞，該類細(xì)胞被稱之為 beige化rown-in-white，brite)細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)。褐色脂肪細(xì)胞又可W被細(xì)分為兩類；經(jīng)典的 褐色脂肪細(xì)胞與brite/beige脂肪細(xì)胞，兩種褐色脂肪細(xì)胞的分布是不同的，經(jīng)典的褐色 脂肪細(xì)胞主要分布于曬齒動(dòng)物的肩腫骨區(qū)域，而Beige脂肪細(xì)胞主要分布于腹股溝區(qū)域的 皮下脂肪組織中。對于人類來說，褐色脂肪細(xì)胞主要存在于嬰兒體內(nèi)，但是目前研究發(fā)現(xiàn)， 成年人的頸部、鎖骨上也含有相當(dāng)量的褐色脂肪細(xì)胞，且它們與曬齒動(dòng)物的beige脂肪細(xì) 胞相似。除了分布差異外，兩種褐色脂肪細(xì)胞的來源也不同。經(jīng)典的褐色脂肪細(xì)胞與肌肉 細(xì)胞同源。但是beige脂肪細(xì)胞存于白色脂肪組織中。研究證明該類型細(xì)胞可由白色脂肪 細(xì)胞轉(zhuǎn)分化而來，此過程被稱為白色脂肪細(xì)胞褐色化。促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐色化的細(xì)胞因 子FGF21等可W有效的抵抗服胖等疾病的發(fā)生。
[0006] 因此尋找能夠促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐色化的藥物成為了研究熱點(diǎn)，此類研究對于人 類服胖相關(guān)代謝疾病的治療具有重大意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 基于此，有必要針對上述問題，提供一種哈爾明堿化armine，Cas號：442-51-3,分 子式C13H12N2O,分子量212. 25,用途為中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑）的新應(yīng)用，其可W促進(jìn)白色脂 肪細(xì)胞褐色化，從而用于治療服胖等相關(guān)疾病。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)W上目的，技術(shù)方案如下：
[0009] 哈爾明堿在制備促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐色化的藥物中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明還公開了哈爾明堿在制備治療服胖的藥物中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明還公開了哈爾明堿在制備抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的葡萄糖不耐受的藥物中的 應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明還公開了哈爾明堿在制備抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的膜島素不敏感的藥物中的 應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)和有益效果為：
[0014] 本發(fā)明探索出了哈爾明堿在制備促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐色化的藥物中的應(yīng)用，該藥 物無論在體內(nèi)和體外都能促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐色化，在體外能夠促進(jìn)原代的白色脂肪細(xì)胞 褐色化，增強(qiáng)褐色脂肪細(xì)胞標(biāo)志基因解偶聯(lián)蛋白1的表達(dá)，在體內(nèi)能夠促進(jìn)腹股溝的白色 脂肪組織中的beige脂肪細(xì)胞的增多和解偶聯(lián)蛋白1的表達(dá)；并能抵抗高脂飼料誘導(dǎo)的服 胖W及葡萄糖不耐受和膜島素不敏感。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1是哈爾明堿在體外劑量依賴性的促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞的解偶聯(lián)蛋白1的表達(dá)， 顯示不同濃度的哈爾明堿對UCPl表達(dá)的影響；
[0016] 圖2是哈爾明堿在小鼠體內(nèi)促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞的解偶聯(lián)蛋白1的表達(dá)，顯示哈爾 明堿促進(jìn)白色脂肪組織中的UCPl表達(dá)；
[0017] 圖3是哈爾明堿在小鼠體內(nèi)抵抗高脂飼料誘導(dǎo)的服胖，顯示哈爾明堿能抵抗高脂 飼料誘導(dǎo)的小鼠的服胖；
[0018] 圖4是哈爾明堿在小鼠體內(nèi)抵抗高脂飼料誘導(dǎo)的葡萄糖不耐受，顯示哈爾明堿處 理的小鼠表現(xiàn)出更好的葡萄糖耐受；
[0019] 圖5是哈爾明堿在小鼠體內(nèi)抵抗高脂飼料誘導(dǎo)的膜島素抵抗，顯示哈爾明堿處理 的小鼠表現(xiàn)出更好的膜島素敏感。

【具體實(shí)施方式】
[0020] W下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0021] 如無特殊說明，W下實(shí)施例中所使用的試劑均來源于市售，操作方法均為現(xiàn)有常 規(guī)操作方法。
[0022] 實(shí)施例1哈爾明堿在體外呈劑量依賴性促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐色化
[0023] 腹股溝的白色脂肪的原代脂肪間充質(zhì)細(xì)胞的分離
[0024] 1)取一只巧7BL/6小鼠（購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司），斷頸處死， 在75%的酒精中浸泡5分鐘，然后轉(zhuǎn)移到操作臺(tái)中，取出腹股溝的白色脂肪；
[00巧]2)用PBS清洗3次，用剪刀將脂肪組織剪碎，Ig脂肪組織加入IOml膠原酶I溶液 (用D-Hanks溶液配制，IOOml加入0. Ig膠原酶I)，放置37C消化40分鐘；
[0026] 3)用250 ym濾膜過濾，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，然后轉(zhuǎn)移到離也管中，10(K)rpm離也3分 鐘；
[0027] 4)第一次離也后的底部細(xì)胞為脂肪間充質(zhì)細(xì)胞，棄除上清后，用新鮮的培養(yǎng)液息 起，鋪到培養(yǎng)板中，第二天換液；
[002引 W獲得的脂肪間充質(zhì)細(xì)胞在添加10%胎牛血清曲clone)高糖的DMEM曲clone) 的培養(yǎng)液生長至滿；
[0029] 6)更換培養(yǎng)液為添加了 MDIR(0. 5mM異下基黃嘿嶺，1 U M地塞米松，87nM膜島素和 0.5111羅格列麗：111^(+06義+1]13111；[]1+1'〇31肖1；[1320]16)的誘導(dǎo)培養(yǎng)液（添加10%胎牛血清 高糖的DMEM的培養(yǎng)液），培養(yǎng)2天；
[0030] 7) 2天后，培養(yǎng)液更換為只添加IR(87nM膜島素和0. 5 y M羅格列麗： Insulin+rosiglitazone)的誘導(dǎo)培養(yǎng)液（添加10%胎牛血清高糖的DMEM的培養(yǎng)液），每兩 天更換一次，直到細(xì)胞完全分化為脂肪細(xì)胞；
[0031] 8)將培養(yǎng)基更換為正常的培養(yǎng)基（添加10%胎牛血清高糖的DMEM的培養(yǎng)液），同 時(shí)添加不同濃度的哈爾明堿化1,0. 5，l，5，10yM)刺激兩天。兩天后，裂解細(xì)胞，實(shí)時(shí)英光 定量PCR檢測UCPl的mRNA表達(dá)。
[0032] 脂肪細(xì)胞的基因表達(dá)鑒定
[003引 RNA提??；利用Trizol法提取，具體操作如下：
[0034] 1)將分化后的細(xì)胞取出，移除培養(yǎng)基，用PBS洗涂一次，然后加入Iml Trizol,裂 解30分鐘，然后轉(zhuǎn)移到EP管中；
[00對。加入200 ill氯仿/ml Trizol,用力振蕩混勻15砂，室溫放置3分鐘，4。 12, OOOg離也15分鐘；
[0036] 3)溶液分成H層：無色的上清水相、中間的白色層及粉紅色的下層有機(jī)相，小也 吸取上清至新的離也管；
[0037] 4)加入500 ill異丙醇，輕輕混勻，室溫放置10分鐘，4°C，12, OOOg離也10分鐘；
[0038] 5)小也去除上清，加入lml75%己醇值EPC水配制），輕輕混勻，息浮沉淀，4C， 7500g離也5分鐘；
[003引 6)去除上清，自然烘干5分鐘左右，加入40 y 1 DEPC水溶解RNA沉淀；
[0040] 7)取5 y 1進(jìn)行電泳檢測提取RNA的質(zhì)量，28S條帶亮度是18S條帶兩倍的RNA是 質(zhì)量較好的RNA，凝膠與電泳緩沖液需新鮮配制；
[00 川 8)取 2 ill 測定 RNA 濃度，RNA 的濃度=ODseoX 稀釋倍數(shù) XO. 04 y g/ y L，00260?/ 0028。"在1. 8?2. 0視為抽提的RNA的純度很高。
[0042] RNA逆轉(zhuǎn)錄：利用SuperScriptTM II RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA ;
[0043] 英光實(shí)時(shí)定量 PCR ;采用 Takara 公司 SYBR飯 RT-PCR KiUPerfect Real Time) 定量PCR試劑盒，根據(jù)說明進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。
[0044] 反應(yīng)條件：
[004引 預(yù)變性；95 °C 20砂；
[0046]變性；95°C，10 砂；
[0047]退火；6(TC，20 砂；
[004引賠育；70 C 1砂；
[0049] 根據(jù)基因的表達(dá)量重復(fù)38?45個(gè)循環(huán)，65?95C做溶解曲線，每0. 5C讀一次 板，時(shí)間為1砂。
[0050] 由圖1可知，UCPl的實(shí)時(shí)定量qPCR結(jié)果顯示隨著哈爾明堿藥物濃度的提高，白色 脂肪細(xì)胞中的UCPl的表達(dá)量也隨之上升，說明UCPl的表達(dá)對藥物呈劑量依賴性。
[00川 實(shí)施例2
[0052] 8周齡的小鼠分為兩組，每組9只，對照組和給藥組。對照組為高脂飼料（60%化t， D12492, Research Diets)喂養(yǎng)并灌胃生理鹽水（每天灌胃一次），給藥組在與對照組同樣 的高脂飼料喂養(yǎng)下并灌胃哈爾明堿巧Omg/kg，每天灌胃一次，生理鹽水作為溶劑）。給藥8 周后，檢測體內(nèi)腹股溝和附睪的白色脂肪組織褐色化和體重稱量。
[0053] 脂肪組織的基因表達(dá)鑒定
[0054] RNA提??；利用Trizol法提取，具體操作如下：
[005引將小鼠分離的脂肪組織稱取lOOmg，然后加入Iml的Trizol,用研磨棒研磨30分 鐘，然后轉(zhuǎn)移到EP管中；其余步驟與實(shí)施例1中RNA提取的步驟2?8相同。脂肪細(xì)胞的 UCPl基因表達(dá)鑒定方法也與實(shí)施例1相同。
[0056] 分別取給藥8周后的對照組和給藥組的小鼠的白色脂肪組織附睪脂肪和腹股溝 皮下脂肪，實(shí)時(shí)定量qPCR檢測UCPl的mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)給藥組的UCPl的表達(dá)量上升， 結(jié)果見圖2。
[0057] 在給藥期間，每周進(jìn)行小鼠的體重稱量，從給藥第四周后，給藥組的小鼠體重低于 對照組。結(jié)果見圖3。
[00則 實(shí)施例3
[005引 8周齡的小鼠分為兩組，每組9化對照組和給藥組。對照組為高脂飼料（60%化t， D12492, Research Diets)喂養(yǎng)并灌胃生理鹽水（每天灌胃一次），給藥組用與對照組同樣 的高脂飼料喂養(yǎng)并灌胃哈爾明堿巧Omg/kg，每天灌胃一次，生理鹽水作為溶劑）。給藥8周 后，進(jìn)行葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)或膜島素耐受實(shí)驗(yàn)。
[0060] 葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)
[0061] 實(shí)驗(yàn)方法：用生理鹽水配制20%的葡萄糖溶液，然后按照2g葡萄糖Ag體重的劑 量注射小鼠，腹腔注射經(jīng)12小時(shí)禁食（晚上9點(diǎn)?次日早上9點(diǎn)）的小鼠。W血糖儀監(jiān)測 注射前（0分鐘）W及注射后小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的血糖濃度（15分鐘、30分鐘、60分鐘、120 分鐘），時(shí)間誤差控制在5砂W內(nèi)。
[0062] 用上述實(shí)驗(yàn)方法對給藥8周后的對照組和給藥組小鼠進(jìn)行葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)，給藥 組小鼠在實(shí)驗(yàn)中的30分鐘，60分鐘和120分鐘的血糖濃度明顯低于對照組小鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果 證明給藥組小鼠對葡萄糖表現(xiàn)出更加明顯的耐受，結(jié)果見圖4。
[0063] 膜島素耐受實(shí)驗(yàn)
[0064] 實(shí)驗(yàn)方法：用生理鹽水配制0. 05單位每毫升的膜島素溶液，然后按照0. 5單位膜 島素Ag體重的劑量注射小鼠，腹腔注射經(jīng)6小時(shí)禁食（早上9點(diǎn)?下午3點(diǎn)）的小鼠，W 血糖儀監(jiān)測注射前（0分鐘）W及注射后小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的血糖濃度（15分鐘、30分鐘、 60分鐘、120分鐘），時(shí)間誤差控制在5砂W內(nèi)。
[0065] 用上述實(shí)驗(yàn)方法對給藥8周后的對照組和給藥組小鼠進(jìn)行膜島素耐受實(shí)驗(yàn)，給藥 組小鼠的血糖在實(shí)驗(yàn)中的15分鐘，30分鐘，60分鐘和120分鐘明顯低于對照小鼠。實(shí)驗(yàn)結(jié) 果證明給藥組小鼠對膜島素表現(xiàn)出更加明顯的敏感性，結(jié)果見圖5。
[0066] W上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并 不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可W做出若干變形和改進(jìn)，該些都屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)W所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1. 哈爾明堿在制備促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐色化的藥物中的應(yīng)用。
2. 哈爾明堿在制備治療肥胖的藥物中的應(yīng)用。
3. 哈爾明堿在制備抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的葡萄糖不耐受的藥物中的應(yīng)用。
4. 哈爾明堿在制備抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素不敏感的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P5/50GK104224780SQ201410523222
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月30日
【發(fā)明者】吳東海, 聶濤, 毛劉鋒, 惠曉艷, 聶寶明, 李鵬, 徐愛民 申請人:中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院