突觸核蛋白病的治療的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及突觸核蛋白病的治療。本發(fā)明一般地涉及在臨床上未診斷為溶酶體貯積病的受試者中治療突觸核蛋白病，以及相關(guān)的制造藥物的方法和篩選方法。
【專利說(shuō)明】突觸核蛋白病的治療
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2008年5月16日的中國(guó)專利申請(qǐng)200880025136. 0"突觸核蛋 白病的治療"的分案申請(qǐng)。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明一般地涉及治療受試者中不是溶酶體貯積病的突觸核蛋白病 (synucleinopathy),以及相關(guān)的篩選方法。

【背景技術(shù)】
[0003] 遺傳學(xué)的、神經(jīng)病理的和生物化學(xué)的證據(jù)已經(jīng)暗示了在幾種神經(jīng)變性病癥，包括 帕金森?。≒D)、Lewy體癡呆（DLB)等的發(fā)展中a-突觸核蛋白（aS)的提高的穩(wěn)態(tài)豐 度以及異常的加工 Oawson 等，（2003)Science 302,819-22 ;Vila 等，（2004)Nat Med.， lOSuppl :S58-62)。
[0004] 遺傳學(xué)的證據(jù)展現(xiàn)了，在a-突觸核蛋白編碼基因中的點(diǎn)突變與伴有早期發(fā)作 的的嚴(yán)重的、主要遺傳的形式有聯(lián)系（Krueger等，（1997)Nat. Genet.，18,106-108 ; Zarranz 等，（2004)Ann.Neurol，55(2) :164-73;Polymeropoulos 等，（1997)Science，276: 2045-7)，暗示了"功能的毒性增益"發(fā)病機(jī)理。這些突變引起了以下的氨基酸變化：丙氨酸 30-脯氨酸（A30P)、谷氨酰胺46-賴氨酸（E46K)和丙氨酸53-蘇氨酸（A53T)。此外，雙份 和三份的編碼a-突觸核蛋白的突觸核蛋白a (淀粉樣前體的非A4成分）基因（SNCA)已 經(jīng)與具有組合的H)/DLB表型的家族性帕金森氏綜合征有聯(lián)系，其展現(xiàn)了即使野生型（wt) 基因的提高的表達(dá)率也可能引起疾病（Chartier-Harlin等，（2004)Lancet, 364,1167-9; Singleton等，（2003)Science，302,841)。引起興趣地，SNCA基因的啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的某些 多態(tài)性還與散發(fā)性、晚期發(fā)作的的提高的風(fēng)險(xiǎn)相聯(lián)系（Pals等，（2004)Ann. Neurol，56， 591-5 ;Maraganore 等，（2006) JAMA，296,661-70)。
[0005] 神經(jīng)病理學(xué)證據(jù)表明，代表了在尸檢中所見的和DLB的病理學(xué)標(biāo)志物之一 的、稱為L(zhǎng)ewy體和Lewy軸突的神經(jīng)元內(nèi)包含物，含有高水平的聚集的a -突觸核蛋白 蛋白質(zhì)（Spillantini 等，（1998)Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.，95,6469_73;Baba 等， (1998) Am. J. Pathol，152,879-884)。這些聚集物一般被視為細(xì)胞錯(cuò)誤處理a-突觸核蛋 白蛋白質(zhì)（可能與翻譯后事件相關(guān)，例如超磷酸化（Anderson等，（2006)，J. Biol. Chem.， 281,29739-29752)，以及作為可溶的有毒寡聚物和不溶的纖絲的細(xì)胞內(nèi)積累（Sharon等， (2001)，P. N. A. S.，98,9110-9115)的結(jié)果。
[0006] 此外，生物化學(xué)的證據(jù)表明，在細(xì)胞或動(dòng)物系統(tǒng)中a -突觸核蛋白的過(guò)量表達(dá)可 能引起細(xì)胞的應(yīng)激和/或最后通過(guò)各種機(jī)制的死亡，包括，尤其是，過(guò)度的多巴胺濃度和 反應(yīng)性氧種類的產(chǎn)生（Tabner 等，（2002)，F(xiàn)ree Radic. Biol. Med.，32(11) : 1076-83 ;Fahn 等，（1992)，Ann. Neurol，32,804-12)，以及線粒體功能障礙（Lee (2003), Antioxid. Redox Signal，5 :337_48 ;HaShimoto 等，（2003)，Neuromolecular Med.，4(1_2) :21_36)等等。公 開的PCR專利申請(qǐng)W0 07084737公開了治療具有與溶酶體酶牽連的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的溶酶體 貯積病癥。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明至少部分地基于發(fā)現(xiàn)，S卩，某些試劑，包括酸性葡糖腦苷脂酶（GBA)多 肽和蛋白酶的組織蛋白酶家族的選定成員（例如，組織蛋白酶D)可以降低中樞和/或外周 神經(jīng)系統(tǒng)的元件內(nèi)a-突觸核蛋白（aS)的細(xì)胞內(nèi)水平。結(jié)果，本發(fā)明包括，特別地，在不患 有已知的經(jīng)典溶酶體貯積病癥的受試者中治療突觸核蛋白病，例如,原發(fā)性突觸核蛋白病 的新方法，例如，通過(guò)施用非蛋白酶型溶酶體酶多肽，例如，脂質(zhì)代謝酶，例如GBA多肽，或 編碼GBA多肽的核酸分子，或活化GBA活性的試劑，或具有a-突觸核蛋白降低活性（"突 觸核蛋白酶"活性）的蛋白酶型溶酶體酶。
[0008] -般地，蛋白酶型溶酶體酶屬于天冬氨酰蛋白酶（例如組織蛋白酶D或組織蛋白 酶E)和半胱氨酰蛋白酶（例如，組織蛋白酶F和組織蛋白酶L)的類別。因此，本發(fā)明還包 括，特別地，用蛋白酶型溶酶體酶以及組織蛋白酶原（procathepsin)D、E、F和L多肽，或編 碼組織蛋白酶D、E、F或L的核酸分子，或編碼它們的蛋白原或前蛋白原多肽形式的核酸分 子來(lái)治療突觸核蛋白病的新方法。
[0009] 此外，非蛋白酶，例如，GBA多肽，或蛋白酶，例如組織蛋白酶D多肽，可以與提高或 誘導(dǎo)自體吞噬的試劑，例如雷帕霉素或雷帕霉素類似物共同施用。
[0010] 此外，考慮到阜化蛋白原（prosaposin，PS)和它的衍生物，阜化蛋白A(saposin A，SA)、皂化蛋白B(SB)、皂化蛋白C(SC)和皂化蛋白D(SD)作為GBA的體內(nèi)活性中的輔助 因子起到的關(guān)鍵作用，其他治療方法包括與GBA活化多肽，例如PS多肽和/或SC多肽一起 施用GBA多肽；或單獨(dú)施用PS多肽和/或SC多肽（來(lái)活化或提高內(nèi)源GBA)來(lái)促進(jìn)體內(nèi) a-突觸核蛋白穩(wěn)態(tài)蛋白水平的降低。
[0011] 一般地，本發(fā)明的特征在于治療患有突觸核蛋白病，例如原發(fā)或繼發(fā)的突觸核蛋 白病，而不患有臨床上診斷的、或不患有臨床上可診斷的溶酶體貯積病的受試者，例如人類 或動(dòng)物，例如馴養(yǎng)的動(dòng)物，例如，犬、貓、馬、山羊、奶牛和豬的方法。這些方法包括以有效降 低受試者的中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)中、或這兩者中、或受試者的溶酶體區(qū)室中的a-突觸核 蛋白水平的數(shù)量向受試者施用一種或更多種以下的：溶酶體酶多肽（例如，非蛋白酶型多 肽，例如GBA，或蛋白酶型酶多肽，例如，組織蛋白酶D)、編碼一種或更多種溶酶體酶多肽的 多核苷酸、溶酶體酶活化試劑、編碼溶酶體酶活化試劑的多核苷酸。
[0012] 突觸核蛋白病可以是一種或更多種以下的：帕金森氏?。≒D);散發(fā)的或可遺傳的 Lewy體癡呆（DLB);伴有突觸核蛋白沉積的純自主神經(jīng)衰竭（pure autonomic failure) (PAF);多系統(tǒng)萎縮癥（MSA);伴有腦部鐵積累的遺傳性神經(jīng)變性；和老年的偶發(fā)的Lewy體 疾病。在其他實(shí)施方式中，所述突觸核蛋白病可以是一種或更多種以下的：Lewy體變體 的阿爾茨海默氏??；Down' s綜合征；進(jìn)行性核上麻搏；Lewy體特發(fā)性震顫（essential tremor with Lewy bodies);有或者沒有癡呆的家族性帕金森氏綜合征；有或者沒有帕金 森氏綜合征的tau基因和progranulin基因關(guān)聯(lián)的癡呆；克-雅?。–reutzfeldt Jakob disease);牛海綿狀腦病；繼發(fā)性的帕金森病；由神經(jīng)毒素暴露引起的帕金森氏綜合征；伴 有a _突觸核蛋白沉積的藥物誘發(fā)的帕金森氏綜合征；散發(fā)的或可遺傳的脊髓小腦性共濟(jì) 失調(diào)；肌萎縮性側(cè)索硬化（ALS);和自發(fā)性的快速眼動(dòng)睡眠行為失常。
[0013] 在這些方法中，蛋白酶型溶酶體酶可以是天冬氨酰蛋白酶多肽，例如組織蛋白酶D 多肽、組織蛋白酶原D多肽、組織蛋白酶E多肽和組織蛋白酶原E多肽，或半胱氨酰蛋白酶 多肽，例如組織蛋白酶F多肽、組織蛋白酶原F多肽、組織蛋白酶L多肽和組織蛋白酶原L 多肽。
[0014] 在某些實(shí)施方式中，溶酶體酶活化試劑是或者包括GBA多肽活化試劑，例如 isofagomine(IFG)、或活化多肽，例如阜化蛋白原（prosaposin)多肽、阜化蛋白（saposin) A多肽、皂化蛋白B多肽、皂化蛋白C多肽和皂化蛋白D多肽的一種或更多種。當(dāng)然，也可以 使用編碼皂化蛋白原多肽、皂化蛋白A多肽、皂化蛋白B多肽、皂化蛋白C多肽和皂化蛋白 D多肽的任何一種或更多種的多核苷酸。
[0015] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明特征在于通過(guò)進(jìn)一步施用一種或更多種提高a-突觸核蛋 白的自體吞噬的試劑來(lái)治療在此描述的突觸核蛋白病的方法。例如，所述試劑可以是或者 包括mTOR抑制物、雷帕霉素、雷帕霉素類似物、依維莫司（everolimus)、環(huán)孢菌素、FK506、 hsc70、N_ 辛基-4_epi-0-井網(wǎng)霉烯胺（valienamine)或甘油。
[0016] 在此處描述的方法中，所述試劑可以是小分子、大分子、肽、抗體、核酸或其生物學(xué) 活性片段。
[0017] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明包括在此描述的溶酶體酶多肽、編碼一種或更多種溶酶體 酶多肽的多核苷酸、溶酶體酶活化試劑和編碼溶酶體酶活化試劑的多核苷酸中的一種或更 多種，在利用公知的制造方法制備用于治療突觸核蛋白病的藥物的方法中的用途。
[0018] "多肽"是指氨基酸的任何鏈，不考慮長(zhǎng)度或翻譯后修飾（例如，糖基化或磷酸 化），因而包括蛋白質(zhì)、多肽和肽。
[0019] "基本上純的多肽"是指已經(jīng)從體內(nèi)伴隨它的成分中分離的多肽。當(dāng)多肽按重量計(jì) 算至少60%沒有與之天然相關(guān)的蛋白質(zhì)和天然存在的有機(jī)分子，多肽是基本上純的。優(yōu)選 的，所述制品是按重量計(jì)算至少75%，更優(yōu)選的至少90%，最優(yōu)選的至少99%的所述期望 的多肽。
[0020] "GBA多肽"是任何GBA蛋白質(zhì)或多肽，其在此處描述的多巴胺能細(xì)胞模型中降低 a S水平方面具有相應(yīng)野生型GBA的生物學(xué)活性的至少百分之50。
[0021] "組織蛋白酶多肽"，例如組織蛋白酶D多肽，是任何組織蛋白酶蛋白或多肽，其在 此處描述的多巴胺能細(xì)胞模型中降低aS水平方面具有相應(yīng)野生型組織蛋白酶的生物學(xué) 活性的至少百分之50。
[0022] 如在此使用的，"a-突觸核蛋白"蛋白或多肽（aS或aS蛋白質(zhì)）包括單個(gè)的、 單體的蛋白質(zhì)或多肽，以及所述a S蛋白或多肽的以下形式：寡聚體形式，例如，二聚體或 三聚體的形式，或脂質(zhì)相關(guān)復(fù)合物的形式，或無(wú)脂質(zhì)的形式，或聚集物的形式，任何這些形 式可以是可溶的或不溶的。該術(shù)語(yǔ)還包括在與其他分子的復(fù)合物中存在的aS蛋白質(zhì)。
[0023] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明特征在于鑒定用于治療突觸核蛋白病的候選化合物的方 法，包括（a)獲得模型系統(tǒng)，例如，細(xì)胞系統(tǒng)，例如，多巴胺能細(xì)胞模型，例如在此描述的，便 于a -突觸核蛋白復(fù)合物的定量；(b)用測(cè)試化合物接觸所述模型系統(tǒng)來(lái)孵育；和（c)比較 在存在和不存在所述測(cè)試化合物的情況下a -突觸核蛋白的水平；其中在存在測(cè)試化合物 的情況下a-突觸核蛋白復(fù)合物的水平的降低表明所述測(cè)試化合物是用于治療突觸核蛋 白病的候選化合物。在某些實(shí)施方式中，a-突觸核蛋白蛋白質(zhì)的精確定量通過(guò)采用夾層 式、特異性和敏感性的ELISA，例如在此描述的，來(lái)實(shí)現(xiàn)。a-突觸核蛋白模型系統(tǒng)可以是， 例如，表達(dá)蛋白質(zhì)的細(xì)胞和/或動(dòng)物模型。
[0024] 本發(fā)明還特征在于治療突觸核蛋白病的方法，其中通過(guò)用蛋白質(zhì)、肽序 列、酶、抗體、天然脂質(zhì)、半合成脂質(zhì)和合成脂質(zhì)以及其衍生物靶向葡萄糖神經(jīng)酰胺 (glucosylceramide)和含糖基神經(jīng)酰胺（glycosylceramide)的鞘糖脂來(lái)降低神經(jīng)和非神 經(jīng)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖神經(jīng)酰胺和含有葡萄糖神經(jīng)酰胺的鞘糖脂的數(shù)量或濃度。例如，神經(jīng)和非 神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖神經(jīng)酰胺和含有糖基神經(jīng)酰胺的鞘糖脂的數(shù)量或濃度可以通過(guò)葡萄糖 神經(jīng)酰胺和含有葡萄糖神經(jīng)酰胺的鞘糖脂的酶學(xué)或非酶學(xué)水解來(lái)降低。這些方法可以通過(guò) 有結(jié)合能力的、但無(wú)催化活性的、處于野生型形式或處于突變形式的GBA來(lái)催化。在這些方 法中，也可以施用皂化蛋白原和/或它的衍生物，例如在此描述的皂化蛋白C。在某些實(shí)施 方式中，期望的蛋白質(zhì)或多肽，例如GBA，通過(guò)表達(dá)編碼所述酶或其衍生物的多核苷酸來(lái)獲 得。
[0025] 在這些方法中，所述試劑，例如皂化蛋白原、皂化蛋白A、皂化蛋白B、皂化蛋白C、 皂化蛋白D、由其衍生的肽、小分子或大分子、抗體、抗體的片段、或改善GBA的天然生物學(xué) 功能的小的或大的多核苷酸，例如，GBA活化試劑，被以有效降低aS蛋白質(zhì)水平的數(shù)量遞 送到中樞和/或外周神經(jīng)系統(tǒng)。
[0026] 除非另外定義，此處使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的普通 技術(shù)人員通常所理解的相同含義。雖然類似于或等同于在此描述的那些的方法和材料可以 被用于本發(fā)明的實(shí)踐和測(cè)試，以下描述了適合的方法和材料。在此提及的所有公開物、專利 申請(qǐng)、專利和其他參考文獻(xiàn)通過(guò)引用將它們完整地合并。在沖突的情況下，當(dāng)前的說(shuō)明書， 包括定義，是支配性的。此外，材料、方法和實(shí)施例僅是說(shuō)明性的，而不意圖是限制性的。
[0027] 根據(jù)以下的詳細(xì)說(shuō)明和根據(jù)權(quán)利要求，本發(fā)明的其他特征和益處將是明顯的。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028] 附圖1是Western印跡的呈現(xiàn)，展現(xiàn)了在體外人類腦神經(jīng)節(jié)苷脂和a-突觸核蛋 白之間穩(wěn)定的19_20kDa復(fù)合物（aS/G)的時(shí)間依賴性形成。
[0029] 附圖2A是在用指定水平的a-突觸核蛋白CDNA質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的MES23. 5細(xì)胞中 表達(dá)的a -突觸核蛋白蛋白質(zhì)的Western印跡的呈現(xiàn)。
[0030] 附圖2B是Western印跡的呈現(xiàn)，表明GBA cDNA轉(zhuǎn)染、+/-皂化蛋白原cDNA轉(zhuǎn)染 對(duì)MES23. 5-syn細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)a-突觸核蛋白蛋白質(zhì)水平的影響。后者蛋白質(zhì)的水平在 Western印跡的下部畫面中顯示。
[0031] 附圖2C是ELISA測(cè)量的柱形圖，表明在存在或缺乏皂化蛋白原的情況下，取決于 共轉(zhuǎn)染的GBA DNA的數(shù)量，在MES-syn細(xì)胞中檢測(cè)的細(xì)胞內(nèi)a -突觸核蛋白蛋白質(zhì)水平。
[0032] 附圖3A是夾心ELISA的性能的圖形，如通過(guò)0D吸光度讀?。╕軸）所監(jiān)測(cè)的，其 特異性地檢測(cè)重組a -突觸核蛋白蛋白質(zhì)的提高的量（X軸）。
[0033] 附圖3B是ELISA測(cè)量的柱形圖，表明在存在被轉(zhuǎn)染到這些細(xì)胞中的提高數(shù)量的 SNCA (突觸核蛋白，a (淀粉樣前體的非A4成分））cDNA (X軸）的情況下，在MES23. 5-syn 細(xì)胞中檢測(cè)到的細(xì)胞內(nèi)a-突觸核蛋白蛋白質(zhì)水平，其中溶胞產(chǎn)物以連續(xù)方式從1比200 稀釋到1比4, 000。
[0034] 附圖3C是通過(guò)夾心ELISA測(cè)量的、作為從附圖3A和附圖3B獲得的數(shù)據(jù)內(nèi)插的， 在給定數(shù)量的轉(zhuǎn)染的SCNA cDNA之后細(xì)胞內(nèi)a-突觸核蛋白蛋白質(zhì)的濃度的回歸分析。
[0035] 附圖3D是顯示在轉(zhuǎn)染24小時(shí)之后，確認(rèn)表達(dá)a -突觸核蛋白蛋白質(zhì)的MES-syn 細(xì)胞的完全細(xì)胞生存力的乳酸脫氫酶（LDH)和MTT分析的結(jié)果。
[0036] 附圖4是來(lái)自五個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的夾心ELISA結(jié)果的呈現(xiàn)，其表明在突變GBA多肽的 表達(dá)之后，在MES23. 5細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)a -突觸核蛋白蛋白質(zhì)水平方面百分之20到> 270的 提高，所述突變GBA多肽帶有近來(lái)與帕金森疾病和Lewy體癡呆相聯(lián)系的幾種錯(cuò)義突變之 一，或帶有對(duì)GBA活性位點(diǎn)有害的突變。a -突觸核蛋白蛋白質(zhì)水平按照與沒有異常GBA、 但僅空載體cDNA轉(zhuǎn)染的MES-syn細(xì)胞的濃度相關(guān)地表示。
[0037] 附圖5,當(dāng)在MES23. 5-syn細(xì)胞（MES-a S)中共同表達(dá)時(shí)，人類組織蛋白酶D的人 類和大鼠a -突觸核蛋白蛋白質(zhì)水平降低活性的夾心ELISA測(cè)量的柱形圖。
[0038] 附圖6是Western印跡的呈現(xiàn)，表明了當(dāng)在MES23. 5-syn細(xì)胞（MES-a S)中共同 表達(dá)時(shí)，人類組織蛋白酶D的劑量依賴性a-突觸核蛋白蛋白質(zhì)水平降低活性。
[0039] 附圖7是當(dāng)在MES23.5-syn細(xì)胞（MES-a S)中共同表達(dá)時(shí)，組織蛋白酶D的人類 a-突觸核蛋白蛋白質(zhì)水平降低活性的夾心ELISA測(cè)量的柱形圖。注意，野生型a-突觸 核蛋白蛋白質(zhì)可以被組織蛋白酶D以及幾種突變的a-突觸核蛋白同種型降低，所述突變 的a -突觸核蛋白同種型帶有錯(cuò)義突變，早先已經(jīng)與家族形式的疾病和尸檢確認(rèn)的帕金森 病相聯(lián)系。

【具體實(shí)施方式】
[0040]一般地，本發(fā)明涉及降低人類或動(dòng)物受試者的細(xì)胞中a s水平的方法，所述受試 者患有不是溶酶體貯積病癥的突觸核蛋白病，例如，患有原發(fā)（或不變）突觸核蛋白病的受 試者。這些方法包括，例如，施用非蛋白酶型溶酶體酶多肽，例如GBA多肽，或蛋白酶型溶酶 體酶多肽，例如組織蛋白酶D多肽，或編碼這些多肽的核酸分子，單獨(dú)地或與提高或誘導(dǎo)自 體吞噬的試劑如雷帕霉素或雷帕霉素類似物組合地施用。此外，GBA活化試劑，例如皂化蛋 白原多肽和/或皂化蛋白C多肽，可以被施用，或者皂化蛋白原多肽和/或皂化蛋白C多肽 可以單獨(dú)地施用（來(lái)提高內(nèi)源GBA活性的活化）來(lái)促進(jìn)體內(nèi)aS穩(wěn)態(tài)蛋白質(zhì)水平的降低。
[0041] 因而，本發(fā)明涉及通過(guò)提高溶酶體和/或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的加工，在某些實(shí)施方式中，通 過(guò)提高由溶酶體攝?。ㄗ泽w吞噬）的aS的數(shù)量，來(lái)調(diào)節(jié)a-突觸核蛋白（aS)的生理學(xué) 降解。雖然不希望受到任何工作原理的限制，aS聚集物的降解加工是穩(wěn)態(tài)水平下的系統(tǒng) 功能。通過(guò)將質(zhì)量作用的法則用于aS蛋白質(zhì)、寡聚形式、聚集物和/或復(fù)合物的穩(wěn)態(tài)降解 加工，人們可以通過(guò)提高它的離析物的豐度來(lái)調(diào)節(jié)朝向它的終產(chǎn)物的降解加工。通過(guò)改變 途徑的成分反應(yīng)，人們可以將總體加工朝向更高的產(chǎn)物水平推動(dòng)。因而，通過(guò)提高aS向溶 酶體中的輸入，或增強(qiáng)它本身的降解效率，人們可以將aS的水解作用和后續(xù)加工向更高 的產(chǎn)物水平推動(dòng)。提高途徑的自體吞噬成分和溶酶體成分可以產(chǎn)生對(duì)aS蛋白質(zhì)損傷的提 高的保護(hù)，這樣的組合可以實(shí)現(xiàn)超過(guò)疊加（additive)的效應(yīng)。
[0042]在此描述的某些實(shí)施方式是治療或延遲不是溶酶體貯積病的突觸核蛋白病病癥 的進(jìn)行或發(fā)展的方法，例如，通過(guò)施用提高GBA和/或皂化蛋白原/皂化蛋白C的活性或水 平的單種或復(fù)數(shù)種試劑。在某些實(shí)施方式中，所述試劑可以是GBA和/或皂化蛋白原/皂 化蛋白C多肽或其活性片段，或編碼這些多肽或活性片段的核酸。在某些實(shí)施方式中，所述 試劑是GBA的有結(jié)合能力的、但無(wú)催化活性的形式，或是編碼它們的核酸分子。
[0043] 在此描述的其他實(shí)施方式是治療或延遲突觸核蛋白病病癥的進(jìn)行或發(fā)展的方法， 例如，通過(guò)施用提高組織蛋白酶D或組織蛋白酶F和/或前組織蛋白酶原D或前組織蛋白 酶原F的活性或水平的單種或復(fù)數(shù)種試劑。在某些實(shí)施方式中，所述試劑可以是GBA和/ 或皂化蛋白原/皂化蛋白C/組織蛋白酶D/組織蛋白酶F多肽或其活性片段，或編碼這些 多肽或活性片段的核酸。在某些實(shí)施方式中，所述試劑是GBA、組織蛋白酶D或組織蛋白酶 F的有結(jié)合能力的、但無(wú)催化活性的形式，或是編碼它們的核酸分子。
[0044] 治療突觸核蛋白病病癥的方法
[0045] 術(shù)語(yǔ)突觸核蛋白病在此使用來(lái)命名一組神經(jīng)變性病癥，其特征是在神經(jīng)元和神經(jīng) 膠質(zhì)的選定群體的細(xì)胞區(qū)室內(nèi)突觸核蛋白（aS)的可溶的非纖絲變體、可溶的寡聚同 種型、不溶的非纖絲變體、復(fù)合物、和不溶的纖絲聚集物的任何一種或更多種的提高的水 平，例如，穩(wěn)態(tài)水平的存在。因而，aS穩(wěn)態(tài)水平被理解為涵蓋SNCA基因產(chǎn)物的所有可溶的 以及不溶的和中間的（亞穩(wěn)態(tài)）形式。
[0046] 這些病癥包括分組為"不變的"（或"原發(fā)的"）突觸核蛋白病的任何一種下列病癥 (Schlossmacher MG. a-synuclein and synucleinopathies. The DementiaS 2 Blue Books of Practical Neurology；Editors ：Growdon JH&Rossor MN. Butterworth Heinemann, Inc., 0xford.2007;Chapter 8:ppl84_213):帕金森氏病（PD)，例如，散發(fā)的帕金森病 / 帕金森氏綜合征和家族性的帕金森病/帕金森氏綜合征；散發(fā)的或可遺傳的Lewy體癡呆 (DLB) (aka彌漫性的Lewy體疾?。痪哂型挥|核蛋白沉積的純自主神經(jīng)衰竭（PAF);多系統(tǒng) 萎縮癥（MSA)(小腦的、帕金森病的、或混合型）；具有腦部鐵積累的遺傳的神經(jīng)變性（aka， 哈-斯病（Hallervordern Spatz disease),或泛酸激酶2-關(guān)聯(lián)的神經(jīng)變性）；和老年偶發(fā) 的Lewy體疾病。
[0047] 此外，"可變的"（或"繼發(fā)性的"）突觸核蛋白病已經(jīng)被鑒定，其中a-突觸核蛋 白新陳代謝的失調(diào)被認(rèn)為是繼發(fā)性的事件（考慮到神經(jīng)系統(tǒng)中蛋白質(zhì)的豐度），盡管如此 其對(duì)原發(fā)疾病的進(jìn)程、外顯率、發(fā)作年齡、嚴(yán)重度和表現(xiàn)度有顯著貢獻(xiàn)?？勺兺挥|核蛋白 病的病癥（SchlossmacherMG.a-synucleinandsynucleinopathies.TheDementiaS2 BlueBooksofPracticalNeurology；Editors：GrowdonJH&RossorMN.Butterworth Heinemann，Inc. ,Oxford. 2007;Chapter8:pp184-213)包括但不限于，Lewy體變體的阿 爾茨海默氏??；Down's綜合征；進(jìn)行性的核上麻痹；Lewy體特發(fā)震顫；由突變的基因和尚 未鑒定基因突變的基因座引起的、有或者沒有癡呆的家族性的帕金森氏綜合征；克-雅病 和相關(guān)的朊病毒疾病，例如牛海綿狀腦?。ǒ偱２。?；繼發(fā)性的帕金森病/由神經(jīng)毒素暴露 引起的帕金森氏綜合征/伴有a_突觸核蛋白沉積的藥物誘發(fā)的帕金森氏綜合征；散發(fā)的 或可遺傳的脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)；肌萎縮性側(cè)索硬化（ALS);自發(fā)性的快速眼動(dòng)睡眠行為 失常；和在哺乳動(dòng)物中伴隨原發(fā)性疾病過(guò)程的與中樞和/或外周a-突觸核蛋白積累相關(guān) 的其他狀況。
[0048] 臨床上，所有這些相關(guān)的病癥特征在于運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知、行為和/或自主神經(jīng)機(jī)能的慢 性的和進(jìn)行性的下降，取決于a-突觸核蛋白異常的分布。
[0049] 突觸核蛋白病可能或可能不與疾病癥狀相關(guān)聯(lián)。還可能也是正常老化的產(chǎn)物。例 如，超過(guò)55、60、65、70、75或80歲的人可能積累這樣的a S蛋白質(zhì)，例如以聚集物的形式， 而沒有與病理、癥狀或疾病狀態(tài)的明顯相關(guān)。這種狀況被稱為偶發(fā)的Lewy體疾病（參見上 文），具有這種狀況的人被認(rèn)為處于PD/帕金森氏綜合征的更高風(fēng)險(xiǎn)中。
[0050] -般地，患有在此預(yù)期的突觸核蛋白病類型的受試者不患有臨床上診斷的（或不 患有臨床上可診斷的）原發(fā)的溶酶體C積病癥（LSD)，例如高歇病（Gaucher disease)或 泰-薩?。═ay-Sachs disease);這些LSD綜合征常常展現(xiàn)常染色體隱性遺傳模式。然而， 在此外與經(jīng)典的LSD表型相關(guān)的基因中具有單個(gè)等位基因突變的受試者可能也發(fā)展突觸 核蛋白病，并遭受其結(jié)果（例如，PD/帕金森氏綜合征或Lewy體癡呆），但沒有全身性LSD 的證據(jù)（Eblan 等，N. Engl. J. Med.，2005)。
[0051] LSD是一類代謝病癥，包括超過(guò)四十種遺傳性病癥，其中許多涉及各種溶酶體水解 酶中的遺傳缺陷，其普遍由編碼溶酶體酶的基因的兩個(gè)等位基因中的突變引起。LSD的標(biāo)志 性特征是所討論的溶酶體水解酶的酶活性方面90% (或更高）的損失，產(chǎn)生的溶酶體內(nèi)代 謝物的異常積累，其導(dǎo)致核周體中大量的擴(kuò)大的溶酶體的形成。
[0052] 在此描述的方法可以用于治療所有患有原發(fā)或繼發(fā)性的突觸核蛋白病的人，包括 在他們的溶酶體酶基因，例如GBA基因中沒有突變的那些（S卩，沒有已知的單個(gè)基因異常的 散發(fā)的帕金森病患者）。這些是其中老化/毒性損傷/頭部外傷/修飾基因的影響或其他 未知原因可能一起引起或促成疾病的患者（Klein and Schlossmacher，Neurology, 2007， 69(22) :2093-104)。
[0053] 在此描述的新的方法還可以用于治療在一種或更多種溶酶體酶基因，例如在GBA 基因中具有雜合的（即，單個(gè)等位基因而不是兩個(gè)等位基因）突變的突觸核蛋白病患者的 亞群。這些受試者不患有典型的LSD (因?yàn)樗麄儾痪哂邪俜种?0或更多的酶缺失，因?yàn)樗麄?仍然從殘余的健康等位基因表達(dá)足夠的GBA)，但是他們常?；加性l(fā)的突觸核蛋白病。當(dāng) 前可獲得的數(shù)據(jù)表明，這種在GBA中的雜合突變充當(dāng)了帕金森?。ê拖嚓P(guān)病癥）的風(fēng)險(xiǎn)因 素，充當(dāng)了在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)展原發(fā)突觸核蛋白病的風(fēng)險(xiǎn)等位基因（Clark等.，Neurology, 2007,69(12) :1270-7)。引起興趣地，如果GBA基因的兩個(gè)拷貝（等位基因）都被突變（例 如，在GBA的N370S、L444P、K198T和R329C變體的載體中），具有經(jīng)典LSD特征的高歇病的 患者亞群將發(fā)展繼發(fā)性的突觸核蛋白病（Lwin等，Mol. Genet. Metab.，2004,81(1) :70-3)。
[0054] 特別是，所述治療可以預(yù)防性地施用給那些人，他們被基因分型為已知的GBA突 變（例如，他們由于高歇病的家族史已經(jīng)被基因分型）來(lái)預(yù)防帕金森病的發(fā)展，或在已經(jīng)發(fā) 展突觸核蛋白病病癥、具有已知的GBA突變的那些人中治療性地施用。因而，為溶酶體酶基 因例如GBA基因中的突變將受試者或患者基因分型的步驟，可以是在此描述的治療方法中 的第一步驟。對(duì)于突變是雜合子的患者是所述新方法的治療的候選人。
[0055] 施用或活化非蛋白酶型溶酶體酶多肽
[0056] 所述新方法包括向需要其的患者，例如在已經(jīng)診斷為患有非溶酶體貯積病癥的突 觸核蛋白病的受試者中，直接地或通過(guò)施用編碼GBA多肽的核酸分子施用非蛋白酶型溶酶 體酶多肽，例如GBA多肽。
[0057]GBA被稱為葡糖苷酶，0，酸；酸性0-葡糖苷酶；酸性0-葡糖苷酶；葡糖腦苷 脂酶；葡糖神經(jīng)酰胺酶；和GBAP。該基因正常地編碼溶酶體膜蛋白質(zhì)，其裂解糖基神經(jīng)酰 胺（也稱為葡糖腦苷脂），一種糖脂新陳代謝中的中間物，的糖苷鍵。它還可以裂解作 為第二底物的葡萄糖基鞘氨醇來(lái)產(chǎn)生葡萄糖和鞘氨醇（Sidransky，Mol Genet Met，2004， PP6-15)。這個(gè)基因中的突變可以引起高歇病，一種特征為葡萄糖腦苷脂和葡萄糖基鞘氨 醇的積累的溶酶體貯積病。選擇性剪接產(chǎn)生了編碼所述蛋白質(zhì)的多種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物變體。存 在著五種mRNA變體（它們?cè)?' UTR中不同），它們中最長(zhǎng)的在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào) Nos. NM_001005749. 1 (mRNA)和NP_001005749. 1 (氨基酸）中列出。關(guān)于GBA的信息可以在 Entrez Gene 數(shù)據(jù)庫(kù)中 GenelD :2629 中找到。
[0058] 所述方法還可以包括通過(guò)施用GBA活化多肽，例如皂化蛋白原（PS)和/或它的衍 生物、皂化蛋白A(SA)、皂化蛋白B(SB)、皂化蛋白C(SC)和皂化蛋白D(SD)來(lái)提高所施用的 GBA多肽或任何內(nèi)源GBA的活化。
[0059] 皂化蛋白原基因編碼高度保守的糖蛋白，其作為具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性的全長(zhǎng)蛋白質(zhì) 分泌，或在內(nèi)涵體/溶酶體區(qū)室中由組織蛋白酶D和其他蛋白酶蛋白水解加工成4種皂化 蛋白 A、B、C 和D(Leonova等?，J.Biol.Chem，1996,271 :17312-17320 ;Hiraiwa等，Arch. Biochem. Biophys.，1997,341 :17-24)。皂化蛋白A-D主要定位在溶酶體區(qū)室，在此它們促 進(jìn)具有短寡聚糖基團(tuán)的鞘糖脂的分解代謝。皂化蛋白C在低pH值條件下將GBA蛋白質(zhì)錨 定在溶酶體膜的內(nèi)側(cè)面，因而容許GBA適當(dāng)?shù)卣郫B用于正確的底物相互作用（Salvioli等， 2000, FEBS. Lett. 472 :17-21)。此外，皂化蛋白C保護(hù)GBA蛋白質(zhì)免于溶酶體蛋白酶的蛋 白水解降解（Sun等，J.Biol.Chem.，2003,278 :31918-31923)。這種蛋白質(zhì)的生物學(xué)重要 性被一事實(shí)強(qiáng)調(diào)了，即，在皂化蛋白原基因中的無(wú)效突變和/或在基因的皂化蛋白C區(qū)域中 的點(diǎn)突變可以導(dǎo)致臨床的高歇病，盡管存在野生型GBA(Pamplos等，Acta. Neuropathol.， 1999,97 :91_97 ;Tylki_Szymanska, 2007, Clin. Genet. ,72 :538_542 ;Rafi 等，1993, Somat. Cell Mol. Genet.，19 :1-7)。
[0060] 此外，最常見的GBA突變體N370S的體內(nèi)低活性可以被認(rèn)為是由于它不能與皂化 蛋白C和陰離子磷脂相互作用（Salvioli等，Biochem. J.，2005,390 :95-103)。皂化蛋白原 的選擇性剪接產(chǎn)生了編碼不同的同種型的多種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物變體。皂化蛋白原（變體高歇病和 變體異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良）在Entre Gene數(shù)據(jù)庫(kù)中以GenelD :5660描述了。它的同種 型的序列可在GenBank中獲得，如下：皂化蛋白原同種型a前蛋白原：NM_002778. 2(mRNA) 和NP_002769. 1(氨基酸）；皂化蛋白原同種型b前蛋白原：NM_001042465. 1 (mRNA)和 NP_001035930. 1(氨基酸）；和皂化蛋白原同種型c前蛋白原NM_001042466. 1(氨基酸）和 NP_001035931. 1042465. 1(mRNA)〇
[0061] GBA多肽和GBA編碼核酸分子，以及GBA活化多肽和相應(yīng)的核酸分子，可以使用已 知的技術(shù)施用，包括在此描述的技術(shù)。例如，GBA多肽編碼核酸分子可以利用在此描述的基 因治療來(lái)施用。
[0062] 施用蛋白酶型溶酶體酶多肽
[0063] 在可選擇的方法中，被診斷為患有不是LSD的突觸核蛋白病的受試者，可以用溶 酶體蛋白酶多肽，例如組織蛋白酶D多肽治療。這樣的蛋白酶可以直接地施用，或通過(guò)施用 編碼期望的蛋白酶的核酸分子來(lái)施用。
[0064] 一般地，蛋白酶型溶酶體酶屬于天冬氨酰蛋白酶，例如組織蛋白酶D (或組織蛋白 酶E)和半胱氨酰蛋白酶（例如，組織蛋白酶F和組織蛋白酶L)的類別。因而，本發(fā)明包括， 特別是，用與組織蛋白酶原D或組織蛋白酶原E多肽相關(guān)的蛋白酶型溶酶體酶，或作為選擇 用與組織蛋白酶原F或組織蛋白酶原L多肽相關(guān)的蛋白酶型溶酶體酶，或編碼組織蛋白酶 D、組織蛋白酶E、組織蛋白酶F或組織蛋白酶L的核酸分子，或編碼它們的前蛋白原多肽形 式的核酸分子，來(lái)治療突觸核蛋白病的新的方法。
[0065] 蛋白酶的組織蛋白酶家族包括大約十二種成員，其通過(guò)它們的結(jié)構(gòu)和它們裂解的 蛋白質(zhì)來(lái)區(qū)分。大多數(shù)成員在溶酶體中存在的低pH值下變得活化。因而，這個(gè)家族的活性 幾乎完全在那些細(xì)胞器中存在。組織蛋白酶D基因（CTSD)編碼由二硫化物連接的重鏈和 輕鏈的二聚體組成的溶酶體天冬氨酰蛋白酶，所述重鏈和輕鏈都由單個(gè)蛋白質(zhì)前體產(chǎn)生。 作為肽酶C1家族的成員的這種蛋白酶具有類似于、但狹窄于胃蛋白酶A的特異性。人類 基因的序列信息可以在GenBank中作為智人（Homo sapiens)組織蛋白酶D(CTSD)，mRNA : NM_001909 獲得。
[0066] 在組織蛋白酶家族內(nèi)，僅一種其他的已知成員（除了組織蛋白酶D之外）具有天 冬氨酰蛋白酶活性，它是組織蛋白酶E。它被轉(zhuǎn)錄成2種變體。人類變體的序列信息可以在 GenBank 中作為智人組織蛋白酶 E(CTSE)，mRNA :NM_001910. 2 和 NM_148964. 1 獲得。
[0067] 在組織蛋白酶家族內(nèi)，各種其他成員具有半胱氨酸蛋白酶活性，例如組織蛋白酶 C、L、F和W。在這許多半胱氨酸蛋白酶組織蛋白酶中，F(xiàn)和W酶形成獨(dú)立的亞群，根據(jù)它們的 染色體位置、序列同源性和剪接模式（Wex等，1999，Biochem. Biophys. Res. Commun.，259 : 401-407)。組織蛋白酶F在腦以及心臟、骨骼肌和其他組織中表達(dá)（Wang等，1998, J. Biol. Chem.，273 :32000-32008)。在小鼠中組織蛋白酶F基因的敲除導(dǎo)致具有神經(jīng)膠質(zhì)增生、神 經(jīng)元損失和自體熒光微粒的積累的晚期發(fā)作的神經(jīng)疾病（Tang等，2006, M01. Cell Biol， 26 :2309-2316)，其被認(rèn)為是人類成年人發(fā)作的神經(jīng)元蠟樣質(zhì)脂褐質(zhì)沉積癥的模型。人類基 因的序列信息可以在GenBank中作為智人組織蛋白酶E(CTSE)，mRNA :NM_003793. 3獲得。 [0068] 組織蛋白酶D或F多肽以及組織蛋白酶D或F編碼核酸分子都可以使用已知的技 術(shù)，包括在此描述的技術(shù)來(lái)施用。例如，組織蛋白酶D編碼核酸分子可以利用在此描述的基 因治療來(lái)施用。
[0069] 施用其他溶酶體酶多肽
[0070] 可以被施用來(lái)提高溶酶體內(nèi)a S的降解加工的其他多肽的實(shí)例包括；天冬氨酰氨 基葡糖苷酶；a -半乳糖苷酶A ;棕櫚酰蛋白硫酯酶；三肽基肽酶；溶酶體跨膜蛋白質(zhì)；半 胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；酸性神經(jīng)酰胺酶；酸性a-L-巖藻糖苷酶；保護(hù)蛋白/組織蛋白酶A ;酸 性0 -半乳糖苷酶；艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶；a -L-艾杜糖苷酸酶；半乳糖腦苷脂酶、酸 性a -甘露糖苷酶；酸性0 -甘露糖苷酶；芳基硫酸酯酶B ;芳基硫酸酯酶A ;N_乙酰半乳 糖胺-6-硫酸酯；酸性P _半乳糖苷酶；N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶；酸性鞘磷脂酶； NPC-1 ; a -葡糖苷酶邛-氨基己糖苷酶B ;乙酰肝素N-硫酸酯酶；a -N-乙酰氨基葡糖苷 酶；乙酰-CoA ; a -氨基葡糖苷；N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯；a -N-乙酰氨基半乳糖苷酶； a -N-乙酰氨基半乳糖苷酶；a -神經(jīng)酰胺邛-葡糖醛酸酶邛-氨基己糖苷酶A ;葡糖腦苷 脂酶；泛素C-末端水解酶-L1 ;和酸性脂肪酶。
[0071] 所述蛋白質(zhì)和多肽可以是溶酶體降解酶或促進(jìn)突觸核蛋白或突觸核蛋白聚集物 降解的非溶酶體蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)和它們的編碼序列是本領(lǐng)域公知的。一般地，將使用 蛋白質(zhì)和它們的編碼序列的人類形式，而對(duì)于在動(dòng)物模型中起作用，動(dòng)物直向同源物可能 是期望的。可以使用一種或更多種這樣的酶。
[0072] 增強(qiáng)和誘導(dǎo)a _突觸核蛋白的自體吞噬
[0073] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面，增強(qiáng)和/或誘導(dǎo)自體吞噬的試劑，例如雷帕霉素或雷帕 霉素類似物與溶酶體酶共同施用來(lái)實(shí)現(xiàn)大于疊加的治療效果，所述溶酶體酶例如GBA多 肽、或非GBA型溶酶體蛋白酶，例如，組織蛋白酶D多肽。
[0074]自體吞噬是涉及細(xì)胞自身的成分通過(guò)溶酶體機(jī)制的降解的分解代謝過(guò)程。它是在 細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和穩(wěn)態(tài)中起到正常作用的緊密調(diào)節(jié)的過(guò)程，幫助維持細(xì)胞產(chǎn)物的合成、降解 和隨后的再循環(huán)之間的平衡。它是饑餓的細(xì)胞將營(yíng)養(yǎng)物從不必要的過(guò)程再分配到更關(guān)鍵的 過(guò)程的主要機(jī)制。
[0075] 存在著各種自體吞噬過(guò)程，所有的都共有通過(guò)溶酶體的細(xì)胞內(nèi)成分的降解。自體 吞噬的最為公知的機(jī)制包括細(xì)胞的目標(biāo)區(qū)域周圍膜的形成，從細(xì)胞質(zhì)的其余部分分隔出內(nèi) 容物。產(chǎn)生的泡囊然后與溶酶體融合，隨后降解內(nèi)容物。
[0076] 自體吞噬可以廣泛地分成三種類型：巨自體吞噬（macroautophagy)、微自體吞噬 和伴侶蛋白介導(dǎo)的自體吞噬：（i)巨自體吞噬涉及自身密封來(lái)吞入細(xì)胞溶質(zhì)成分（蛋白質(zhì) 和/或完整細(xì)胞器）的從頭形成的膜的形成，其在與溶酶體融合之后降解；（ii)微自體吞 噬是材料向溶酶體內(nèi)的直接內(nèi)陷；和（iii)伴侶蛋白介導(dǎo)的自體吞噬（CMA)涉及以特異性 肽序列標(biāo)記的特定細(xì)胞溶質(zhì)蛋白質(zhì)的降解。CMA在降解什么方面是高度選擇性的，僅降解某 些蛋白質(zhì)而非細(xì)胞器。CMA對(duì)組織例如肝臟、腎臟和許多類型的培養(yǎng)細(xì)胞中大約30%的細(xì) 胞溶質(zhì)蛋白質(zhì)的降解負(fù)責(zé)。
[0077] 伴侶蛋白分子結(jié)合標(biāo)記的蛋白質(zhì)，并經(jīng)由受體復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)標(biāo)記的蛋白質(zhì)到溶酶 體。在CMA中，僅那些具有共有肽序列的蛋白質(zhì)得以通過(guò)伴侶蛋白的結(jié)合被識(shí)別。這種CMA 底物/伴侶蛋白復(fù)合物然后移動(dòng)到溶酶體，在此，CMA受體溶酶體相關(guān)膜蛋白識(shí)別所述復(fù) 合物；通過(guò)內(nèi)側(cè)其他蛋白質(zhì)的幫助，蛋白質(zhì)被解折疊并轉(zhuǎn)位跨越溶酶體膜?？扇艿囊吧?a -突觸核蛋白已經(jīng)被報(bào)道通過(guò)這種機(jī)制降解（Cuervo等.（2004)，Science, 305 :1292)。
[0078]自體吞噬是日常的正常細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育的一部分，其中雷帕霉素的哺乳動(dòng)物靶 (mTOR)起到重要的調(diào)節(jié)作用。饑餓抑制mTOR活性，引起各種細(xì)胞反應(yīng)，包括細(xì)胞在早期G1 階段的停滯、蛋白質(zhì)合成的抑制作用、營(yíng)養(yǎng)物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白周轉(zhuǎn)、轉(zhuǎn)錄改變和自體吞噬。雷帕霉 素是抑制mTOR活性的公知的試劑。本領(lǐng)域已知的任何雷帕霉素類似物或mTOR抑制物可 以用于在此描述的方法。例如，依維莫司、環(huán)孢菌素和FK506可以使用，并測(cè)試它們的自體 吞噬刺激能力。雖然這樣的類似物和抑制物可能不都具有雷帕霉素的自體吞噬刺激活性， 這種活性可以在這些化合物中容易地測(cè)定。促進(jìn)自體吞噬的試劑包括伴侶蛋白蛋白質(zhì)，和 結(jié)合并護(hù)送底物到溶酶體的化合物?？梢源碳ぷ泽w吞噬的其他化合物包括hsc70、N-辛 基-4-印i-P-井R霉烯胺和甘油。一種或更多種這樣的試劑可以用于在此描述的增強(qiáng)自 體吞噬的方法。
[0079] 任何促進(jìn)突觸核蛋白的降解或引起突觸核蛋白復(fù)合物的解聚集作用的溶酶體酶， 單獨(dú)地或與其他溶酶體酶或試劑組合地，可以用于本發(fā)明。
[0080] 施用方法
[0081] 一般地，在此描述的方法包括向需要、或被確定需要這樣的治療的受試者施用治 療有效量的在此描述的治療化合物。
[0082] 如在上下文中使用的，"治療"是指改善突觸核蛋白病病癥的至少一種癥狀，和/或 引起受試者中aS蛋白質(zhì)的水平方面可測(cè)量的降低。類似地，施用"治療有效量"或"有效 量"的在此描述的組合物用于突觸核蛋白病的治療，將產(chǎn)生a S蛋白質(zhì)的降低的水平，和/ 或引起突觸核蛋白病病癥的一種或更多種癥狀的改善。這種數(shù)量可以相同或不同于"預(yù)防 有效量"，其是抑制，例如預(yù)防，疾病或疾病癥狀的發(fā)作所必需的數(shù)量。
[0083] 有效量可以以一次或更多次施用、應(yīng)用或劑量施用。組合物的治療有效量取決于 選擇的組合物。組合物可以從每天一次或更多次到每周一次或更多次地施用；包括每隔一 天一次。熟練技術(shù)人員將理解，某些因素將影響有效地治療受試者所需的劑量和時(shí)機(jī)，包括 但不限于，疾病或病癥的嚴(yán)重度、早先的治療、受試者的一般健康狀態(tài)和/或年齡、和存在 的其他疾病。此外，使用治療有效量的在此描述的組合物治療受試者可以包括單次治療或 一系列的治療。
[0084] 化合物的劑量、毒性和治療效力可以被測(cè)定，例如，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中 的標(biāo)準(zhǔn)藥物學(xué)操作，例如，用于測(cè)定LD50 (對(duì)50%的群體致死的劑量）和ED50 (對(duì)50%的 群體治療有效的劑量）的那些。在有毒和治療效果之間的劑量比例是治療指數(shù)，它可以被 表示為L(zhǎng)D50/ED50的比例。展現(xiàn)了高治療指數(shù)的化合物是優(yōu)選的。當(dāng)使用展現(xiàn)了毒性副作 用的化合物時(shí)，應(yīng)當(dāng)小心地設(shè)計(jì)遞送系統(tǒng)，所述遞送系統(tǒng)將這些化合物靶向受感染組織以 最小化對(duì)未感染細(xì)胞的潛在損害，從而降低副作用。
[0085] 從細(xì)胞培養(yǎng)分析和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)可被用于配制用于人類的劑量范圍。這些 化合物的劑量?jī)?yōu)選地處在包括很小或沒有毒性的ED50的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。取決于采用的 劑型和使用的給藥途徑，劑量可以在這個(gè)范圍內(nèi)變動(dòng)。對(duì)于在本發(fā)明的方法中使用的任何 化合物，可以最初地從細(xì)胞培養(yǎng)分析來(lái)估計(jì)治療有效劑量。可以在動(dòng)物模型中配制劑量來(lái) 達(dá)到包括在細(xì)胞培養(yǎng)中測(cè)定的IC50(即，達(dá)到癥狀的半最大抑制的測(cè)試化合物的濃度）的 循環(huán)血漿濃度范圍。這種信息可用于更精確地測(cè)定人類中有用的劑量。可以通過(guò)例如高效 液相色譜法測(cè)定血漿中的水平。
[0086] 關(guān)于劑量的更具體的信息在下文討論。
[0087] 多肽和小分子的施用
[0088] 如果期望，可以全身地施用跨越血腦屏障的試劑。做為選擇，試劑例如在此描述 的多肽和小分子，可以直接地遞送到其中細(xì)胞顯示了 aS積累的身體中的位點(diǎn)。不跨越 血腦屏障的試劑可以例如利用通過(guò)腦功能區(qū)定位（stereotactic)導(dǎo)引來(lái)便利化的直接 注射來(lái)施用到腦部。這樣的試劑還可以經(jīng)由腦室內(nèi)的（intraventricular)或?qū)嵸|(zhì)內(nèi)的 (intraparenchymal)途徑施用。
[0089] 在其他實(shí)施方式中，編碼期望的多肽的核酸分子可以以例如含有多肽編碼基因的 病毒載體的形式遞送。病毒遞送可以在一定條件下，所述條件有利于轉(zhuǎn)基因在特定的中樞 或周圍神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)，例如，在腦室襯里的室管膜或其他膠質(zhì)細(xì)胞。室管膜細(xì)胞可以被 轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)表達(dá)轉(zhuǎn)基因和將編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物分泌到腦脊液（CSF)中。
[0090] 在此描述的多肽可以摻入藥物組合物中，所述藥物組合物對(duì)于治療，例如抑制、減 弱、預(yù)防或改善突觸核蛋白病是有用的。所述藥物組合物可以施用給患有突觸核蛋白病病 癥的受試者，或處于發(fā)展所述缺陷的風(fēng)險(xiǎn)中的人。所述組合物應(yīng)當(dāng)含有處在藥學(xué)上可接受 的載體中的治療或預(yù)防數(shù)量的多肽。藥物載體可以是任何適合于將多肽遞送到患者的相容 的、無(wú)毒的物質(zhì)。無(wú)菌水、醇類、脂肪和蠟可以用作載體。藥學(xué)上可接受的佐劑、緩沖劑、分散 劑等等，也可以摻入到藥物組合物中。所述載體可以與適合于通過(guò)腦室內(nèi)注射或輸注（所 述形式也可以適合于靜脈內(nèi)或鞘內(nèi)的施用），或其它，施用的任何形式的多肽組合。
[0091]適合的載體包括，例如，生理鹽水、抑菌劑水、Cremophor EL* (BASF，Parsippany， N. J.)或磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)、其他鹽水溶液、葡萄糖溶液、甘油溶液、水和油乳劑，例如 用石油、動(dòng)物、植物或合成來(lái)源的油制造的那些（花生油、豆油、礦物油或芝麻油）。在某些 實(shí)施方式中，人工的CSF被用作載體。一般地，載體將是無(wú)菌的和無(wú)熱原的。所述藥物組合 物中多肽的濃度可以廣泛地變化，即，從總成分的按重量計(jì)算至少約〇. 01 %，到按重量計(jì)算 O. 1 %、到約1 %重量、到多達(dá)按重量計(jì)算20%或更多。
[0092]對(duì)于在此描述的多肽或其他試劑的腦室內(nèi)的施用，所述組合物必需是無(wú)菌的并應(yīng) 當(dāng)是流體。必須在制造和儲(chǔ)存條件下是穩(wěn)定的，并且必須保存于對(duì)抗微生物例如細(xì)菌和真 菌的污染作用之下。可以通過(guò)各種抗細(xì)菌和抗真菌劑，例如，對(duì)羥苯甲酸、氯代丁醇、酚、抗 壞血酸、硫柳汞等等，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物作用的預(yù)防。在很多情況下，有用的是在組合物中包 括等滲試劑，例如，糖類、多元醇如甘露醇、山梨醇和氯化鈉。
[0093] 施用的速率是這樣，從而單劑量的施用可以作為快速濃注（bolus)施用。單劑量 也可以在約1-5分鐘、約5-10分鐘、約10-30分鐘、約30-60分鐘、約1-4小時(shí)內(nèi)輸注，或消 耗超過(guò)四、五、六、七或八小時(shí)。這可以花費(fèi)超過(guò)1分鐘、超過(guò)2分鐘、超過(guò)5分鐘、超過(guò)10 分鐘、超過(guò)20分鐘、超過(guò)30分鐘、超過(guò)1小時(shí)、超過(guò)2小時(shí)或超過(guò)3小時(shí)。雖然快速濃注的 腦室內(nèi)施用是有效的，緩慢的輸注是特別有效的。不受任何特定的工作原理的限制，相信的 是，由于CSF的周轉(zhuǎn)（turn-over)，緩慢的輸注是有效的。
[0094] 雖然文獻(xiàn)中的估計(jì)值和計(jì)算值是變化的，CSF被認(rèn)為在人類中在約4、5、6、7或8小 時(shí)內(nèi)周轉(zhuǎn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，緩慢的輸注時(shí)間應(yīng)當(dāng)被計(jì)量，從而它大約等于或大于CSF的 周轉(zhuǎn)時(shí)間。周轉(zhuǎn)時(shí)間可能取決于受試者的物種、大小和年齡，但是可以使用本領(lǐng)域已知的方 法來(lái)測(cè)定。輸注也可以在一天或更多天的時(shí)間內(nèi)持續(xù)。患者可以治療一個(gè)月一次、兩次、或 三次或更多次，例如，每周地，例如每?jī)芍艿?。輸注可以按照腦部或內(nèi)臟器官中疾病的底物 的重新積累所指示的，在受試者的生命過(guò)程中重復(fù)。重新積累可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的用于 鑒定和量化相關(guān)底物的任何技術(shù)來(lái)測(cè)定，所述技術(shù)可以對(duì)取自腦部和/或來(lái)自一種或更多 種內(nèi)臟器官的一種或更多種樣品進(jìn)行。這樣的技術(shù)包括酶的分析和/或免疫分析，例如，放 射免疫分析或ELISA。
[0095]緩慢的心室內(nèi)輸注提供了在至少腦部中、以及潛在地在內(nèi)臟器官中，所施用的多 肽（例如，酶）的減低數(shù)量的底物。在腦部、肺部、脾臟、腎臟和/或肝臟中積累的底物例如 a S蛋白質(zhì)的降低可以是顯著的?？梢詫?shí)現(xiàn)大于10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、 80 %或90 %的降低。實(shí)現(xiàn)的降低在患者與患者之間，或甚至在單個(gè)患者的器官與器官之間 不必然是均勻的。降低可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的任何技術(shù)來(lái)測(cè)定，例如，通過(guò)酶分析和/或免 疫分析技術(shù)，如在此其他地方討論的。
[0096]在說(shuō)明性的實(shí)施方式中，施用伴隨著所述多肽向受試者或患者的側(cè)腦室的一個(gè)或 兩個(gè)中的輸注。通過(guò)輸注到側(cè)腦室中，所述多肽被遞送到腦部中的位點(diǎn)，在其中產(chǎn)生最大數(shù) 量的CSF。所述多肽還可以輸注到腦部的超過(guò)一個(gè)腦室中。治療可以由每個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)的單 次輸注組成，或可以是重復(fù)的。可以使用多個(gè)輸注/注射位點(diǎn)。例如，多肽所施用的腦室可 以包括側(cè)腦室和第四腦室。在某些實(shí)施方式中，除了第一施用位點(diǎn)之外，含有所述多肽的組 合物被施用到另一個(gè)位點(diǎn)，所述另一個(gè)位點(diǎn)可以是所述第一施用位點(diǎn)的對(duì)側(cè)或同側(cè)的。注 射/輸注可以是單次或多次，單側(cè)的或雙側(cè)的。
[0097]為了特異性地將含有所述多肽的溶液或其他組合物遞送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特 定區(qū)域，例如，特定的腦室，例如，腦部的側(cè)腦室或第四腦室，它可以通過(guò)腦功能區(qū)定位的 (stereotaxic)顯微注射來(lái)施用。例如，在手術(shù)的當(dāng)天，患者具有固定就位的腦功能區(qū)定位 框架基座（旋緊到顱骨上）。具有腦功能區(qū)定位框架基座的大腦（與參考（fiduciary)標(biāo)記 相容的MRI)使用高分辨率MRI成像。MRI圖像然后轉(zhuǎn)移到運(yùn)行腦功能區(qū)定位軟件的計(jì)算 機(jī)。一系列冠狀的、矢狀的和軸向的圖像用于確定載體注射的目標(biāo)位點(diǎn)和軌跡。軟件直接 將軌跡轉(zhuǎn)換為適合于腦功能區(qū)定位框架的3維坐標(biāo)。在進(jìn)入位點(diǎn)上方鉆出鉆孔，用以給定 的深度插入的針頭定位腦功能區(qū)定位裝置。然后注射藥學(xué)上可接受的載體中的多肽溶液。 可以使用其他的施用途徑，例如，在直接可視化的或其他非腦功能區(qū)定位的應(yīng)用之下的淺 皮層應(yīng)用。
[0098]遞送緩慢的輸注的一種途徑是使用泵。這樣的泵是商業(yè)上可獲得的，例如，來(lái)自 Alzet (Cupertino, CA)或 Medtronic (Minneapolis, MN)。泵可以是可植入的。施用酶的另 一種方便的途徑是使用套管或?qū)Ч?。套管或?qū)Ч芸梢杂糜跁r(shí)間上分開的多次施用。套管和 導(dǎo)管可以腦功能區(qū)定位地植入。期待的是，多次施用將用于治療患有突觸核蛋白病病癥的 典型患者。導(dǎo)管和泵可以單獨(dú)地或組合地使用。
[0099] 核酸分子的施用和基因治療
[0100] 在此描述的核酸分子，例如編碼GBA或組織蛋白酶D多肽的核酸分子，可以使用多 種不同的方法遞送。例如，基因轉(zhuǎn)移可以由DNA病毒載體，例如腺病毒（Ad)或腺病毒相關(guān)病 毒（AAV)來(lái)介導(dǎo)。載體構(gòu)建體是指包括病毒基因組或其部分以及轉(zhuǎn)基因的多核苷酸分子。 腺病毒（Ad)是相對(duì)良好地表征的、病毒的同源的組，包括超過(guò)50種血清型。參見，例如，國(guó) 際PCT申請(qǐng)NO. W0 95/27071。Ad容易生長(zhǎng)，不需要整合到宿主細(xì)胞基因組中。重組Ad衍 生的載體，特別是降低重組的潛力和野生型病毒的產(chǎn)生的那些，也已經(jīng)被構(gòu)建。參見，國(guó)際 PCT申請(qǐng)NO. W0 95/00655和W0 95/11984。野生型AAV具有整合到宿主細(xì)胞的基因組中的 高感染性和特異性。參見，Hermonat and Muzyczka(1984)Proc. Natl. Acad. Sci.，USA，81: 6466-6470 和 Lebkowski 等?（1988)Mol. Cell. Biol，8 :3988-3996。
[0101] 遞送在此描述的核酸分子的適合的親神經(jīng)的（neurotrophic)病毒載體包括，但 不限于，腺相關(guān)病毒載體（AAV)、單純性皰疹病毒載體（美國(guó)專利No. 5, 672, 344)和慢病毒 載體。
[0102] 在新的方法中，可以使用任何血清型或假型的AAV。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中使 用的病毒載體的血清型選自由AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7和AAV8構(gòu)成的組 (參見，例如，Gao等?（2002)PNAS，99:1185411859;and Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols，ed.Machida，Humana Press，2003)。可以使用除了在此列出的 那些之外的其它血清型。此外，假型AAV載體也可以在此處描述的方法中使用。假型AAV 載體是在第二AAV血清型的衣殼中含有AAV血清型的基因組的那些；例如，含有AAV2衣殼 和AAV1基因組的AAV載體，或含有AAV5衣殼和AAV2基因組的AAV載體（Auricchio等.， (2001) Hum. Mol. Genet. ,10(26) :3075-81)。
[0103] AAV載體來(lái)自對(duì)哺乳動(dòng)物不致病的單鏈的（ss)DNA細(xì)小病毒（paroviruses)(在 Muzyscka(1992)Curr. Top. Microb. Immunol.，158 :97_129 中綜述）。簡(jiǎn)要地，基于 AAV 的 載體除去了 rep和cap病毒基因，它們占據(jù)了病毒基因組的96%，留下兩個(gè)側(cè)翼的145堿 基對(duì)（bp)的反向末端重復(fù)（ITR)，其被用于啟動(dòng)病毒DNA復(fù)制、包裝和整合。在不存在輔 助病毒的情況下，野生型AAV整合到人類宿主細(xì)胞基因組中，優(yōu)先的位點(diǎn)特異性在染色體 19ql3. 3,或者它可以游離地維持。單個(gè)的AAV顆?？梢匀菁{最高達(dá)5kb的ssDNA，因而留下 約4. 5kb用于轉(zhuǎn)基因和調(diào)節(jié)元件，這一般是足夠的。然而，例如，在美國(guó)專利NO. 6, 544, 785 中描述的反式剪接系統(tǒng)，可以近乎加倍這種限制。
[0104] 在說(shuō)明性的實(shí)施方式中，AAV是AAV2。許多血清型的腺相關(guān)病毒，特別是AAV2， 已經(jīng)作為基因治療載體被廣泛地研究和表征。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉功能性的基于AAV的 基因治療載體的制備。關(guān)于AAV產(chǎn)生、純化和制備用于施用到人類受試者的各種方法的 許多參考文獻(xiàn)可以在大范圍的公開文獻(xiàn)中找到（參見，例如，Viral Vectors for Gene Therapy :Methods and Protocols，ed. Machida，Humana Press，2003)。另外，在美國(guó)專利 NO. 6, 180, 613和6, 503, 888中已經(jīng)描述了靶向CNS的細(xì)胞的基于AAV的基因治療。其他 示范性的AAV載體是編碼人類蛋白質(zhì)的重組的AAV2/l、AAV2/2、AAV2/5, AAV2/6、AAV2/7和 AAV2/8血清型載體。
[0105] 在此處描述的某些方法中，載體包括與啟動(dòng)子可操作連接的轉(zhuǎn)基因。所述轉(zhuǎn)基因 編碼生物學(xué)活性分子，例如，GBA多肽，其在CNS中的表達(dá)引起突觸核蛋白病的至少部分矯 正。
[0106] 在真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的水平基本上由轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒內(nèi)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子決定。 顯示了長(zhǎng)期活性，以及是組織和甚至細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子在某些實(shí)施方式中使用。啟動(dòng) 子的實(shí)例包括，但不限于，巨細(xì)胞病毒（CMV)啟動(dòng)子（Kaplitt等.（1994)Nat.Genet.，8 : 148-154)、CMV/ 人類 3 3 珠蛋白啟動(dòng)子（Mandel 等.（1998) J. Neurosci.，18 :4271-4284)、 GFAP 啟動(dòng)子（Xu 等?（2001)Gene Ther.，8 :1323-1332)、1. 8kb 神經(jīng)元特異性烯醇酶（NSE) 啟動(dòng)子（Klein 等?（1998)Exp. Neurol，150 :183-194)、雞 3 肌動(dòng)蛋白（CBA)啟動(dòng)子 (Miyazaki (1989) Gene，79 :269-277)、葡糖醛酸酶（⑶ SB)啟動(dòng)子（Shipley 等（1991) Genetics，10 :1009-1018)，以及泛素啟動(dòng)子，例如，分離自人類泛素A、人類泛素B和人類泛 素C的那些，如在美國(guó)專利No. 6, 667, 174中所描述的。為了延長(zhǎng)表達(dá)，其他調(diào)節(jié)元件可以 另外地可操作連接到所述轉(zhuǎn)基因，例如，旱獺肝炎病毒調(diào)節(jié)后元件（Woodchuck Hepatitis Virus Post Regulatory Element，WPRE)(Donello等（1998) J.Virol，72:5085-5092)，或牛 生長(zhǎng)激素（BGH)多聚腺苷酸位點(diǎn)。
[0107] 對(duì)于某些CNS基因治療應(yīng)用，控制轉(zhuǎn)錄活性是必需的。為此，利用病毒載體的基因 表達(dá)的藥理學(xué)調(diào)節(jié)可以通過(guò)包括各種調(diào)節(jié)元件和藥物應(yīng)答啟動(dòng)子來(lái)獲得，例如，在Haberma 等?（1998)Gene Ther.，5 :1604-16011 ;and Ye等?（1995)Science，283 :88-91 中所描述的。
[0108] 高滴度的AAV制品可以利用本領(lǐng)域已知的的技術(shù)產(chǎn)生，例如，在美國(guó)專 利 N0. 5,658,776 和 Viral Vectors for Gene Therapy:Methods and Protocols, ed. Machida，Humana Press，2003 中描述的。
[0109] 劑量
[0110] 對(duì)于疾病的治療，多肽，例如，GBA或組織蛋白酶多肽或在此描述的其他試劑的合 適劑量，將取決于要治療的疾病的種類、疾病的嚴(yán)重度和進(jìn)程、多肽或試劑是用于預(yù)防性還 是治療性目的、早先的治療、患者的臨床歷史、對(duì)酶或試劑的反應(yīng)、以及主治醫(yī)師的判斷。
[0111] 在組合治療方法中，在此描述的組合物以治療有效的或協(xié)同的數(shù)量施用。治療協(xié) 同的數(shù)量是以高于當(dāng)單獨(dú)施用兩種多肽/試劑時(shí)疊加的方式，顯著降低或消除與特定疾病 相關(guān)的狀況或癥狀所必需的，與一種或更多種其他多肽或試劑組合的一種或更多種多肽或 其他試劑的數(shù)量。
[0112] 雖然劑量可以取決于疾病和患者而變化，多肽一般以約0. 1到約1000毫克每50kg 患者每次施用的數(shù)量施用給患者，可以每周地、每月地或以需要的其他時(shí)間間隔來(lái)重復(fù)。在 一個(gè)實(shí)施方式中，所述多肽以約1到約500毫克每50kg患者每月的數(shù)量施用給患者。在其 他實(shí)施方式中，所述多肽以約5到約300毫克每50kg患者每月、或約10到約200毫克每 50kg患者每月的數(shù)量施用給患者。
[0113] 取決于疾病的類型和嚴(yán)重度，所述多肽或試劑可以被施用，從而提供的局部濃度 是約 100pg/ml 到約 100 u g/ml，Ing/mL 到約 95 u g/mL，10ng/ml 到約 85 u g/ml，100ng/ml 到約 75 ii g/ml，約 lOOng/ml 到約 50 ii g/ml，約 1 ii g/ml 到約 25 ii g/ml，約 1 ii g/ml 到約 15 ii g/ml，約 1 ii g/ml 到約 10 ii g/ml，或約 1 ii g/ml 到約 4 ii g/ml。
[0114] 當(dāng)所述多肽或試劑通過(guò)病毒病毒顆粒的基因治療來(lái)遞送時(shí)，劑量可以是從約 2X 106 到約 2X 1012drp，約 2X 107 到約 2X 10ndrp，約 2X 108 到約 2X 101Qdrp(DNaSe 抗性 顆粒）每單位劑量。在某些實(shí)施方式中，組合物中的載體的濃度或滴度是至少：(a)5、6、7、 8、9、10、15、20、25 或 50(X1012gp/ml) ; (b)5、6、7、8、9、10、15、20、25 或 50(X 109tu/ml);或 (c)5、6、7、8、9、10、15、20、25 或 50(X10lcliu/ml)。
[0115] 術(shù)語(yǔ)"基因組顆粒（gp)"或"基因組等價(jià)物"當(dāng)涉及病毒滴度使用時(shí)，是指含有重 組AAV DNA基因組的病毒顆粒的數(shù)量，不考慮感染性或功能性。在特定的載體制品中的基因 組顆粒的數(shù)量可以由在此處的實(shí)施例中描述的操作，或例如，在Clark等.（1999)Hum. Gene Ther.，10 :1031-1039 ;Veldwijk 等?（2002)M〇1. Ther.，6 :272-278 中描述的來(lái)測(cè)量。
[0116] 術(shù)語(yǔ)"感染單位（iu) "、"感染性顆粒"或"復(fù)制單位"如涉及病毒滴度使用的，是指 通過(guò)例如在McLaughlin等?（1988) J.Virol，62 :1963-1973中描述的感染性中心分析，也稱 為復(fù)制中心分析所測(cè)量的，感染性的和有復(fù)制能力的重組AAV載體顆粒的數(shù)量。
[0117] 術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)導(dǎo)單位（tu)"如涉及病毒滴度使用的，是指例如在此處的實(shí)施例中描 述的，或例如在 Xiao 等?（1997) Exp. Neurobiol.，144 :113-124 ;或在 Fisher 等?（1996) J. Virol，70 :520-532 (LFU分析）中描述的功能分析中所測(cè)量的，引起功能性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的 產(chǎn)生的感染性重組AAV載體顆粒的數(shù)量。
[0118] 當(dāng)所述多肽或試劑通過(guò)蛋白質(zhì)或化學(xué)療法施用時(shí)，所述劑量可以從約0. lmg到約 50mg，約 0? lmg 到約 25mg，約 0? lmg 到約 10mg，約 0? 5mg 到約 5mg，約 0? 5mg 到約 2. 5mg 每單 位劑量。
[0119] 在此描述的多肽和試劑可以作為單劑量施用或重復(fù)地施用。對(duì)于持續(xù)幾天或更長(zhǎng) 時(shí)間的重復(fù)施用，取決于其條件，持續(xù)進(jìn)行治療直到產(chǎn)生期望的對(duì)疾病癥狀的抑制?？梢酝?過(guò)傳統(tǒng)的技術(shù)和分析來(lái)容易地監(jiān)測(cè)本發(fā)明的療法的進(jìn)展。
[0120] 藥物組合物
[0121] "藥物組合物"或"藥物"意圖包括活性成分或試劑的組合，例如，酶多肽，和任選地 載體或其他材料，例如，化合物或組合物，其是惰性的（例如，可檢測(cè)的試劑或標(biāo)記）或活性 的，例如佐劑、稀釋劑、粘合劑、穩(wěn)定劑、緩沖液、鹽、親脂性溶劑、防腐劑、佐劑等等，或兩種 或更多種這些物質(zhì)的混合物。
[0122] 載體優(yōu)選的是藥學(xué)上可接受的。它們可以包括藥物的賦形劑和添加劑、蛋白質(zhì)、 肽、氨基酸、脂質(zhì)和碳水化物（例如，糖類，包括單糖、二糖、三糖、四糖和寡聚糖；衍生的糖 類，例如糖醇、醛糖酸，酯化的糖類等等；以及多糖或糖聚合物），其可以單獨(dú)地或組合地存 在，包含單獨(dú)地或按照重量或體積的1-99. 99%地組合地。示范性的蛋白質(zhì)賦形劑包括血清 白蛋白，例如人血清白蛋白（HSA)、重組人白蛋白（rHA)、明膠、酪蛋白，等等。也可以在緩沖 能力上起作用的代表性的氨基酸/抗體成分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜堿、組氨酸、 谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿司 帕坦，等等。碳水化物賦形劑也意圖包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，其實(shí)例包括但不限于，單糖，例 如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖，等等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、 纖維二糖，等等，多糖，例如棉子糖、松三糖、麥芽糊精、葡聚糖、淀粉，等等，以及糖醇，例如 甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇、拉克替醇、木糖醇山梨醇（葡糖醇）和肌醇。
[0123] 術(shù)語(yǔ)載體還包括緩沖液或pH調(diào)整試劑或含有它們的組合物；一般地，緩沖液是從 有機(jī)酸或堿制得的鹽。代表性的緩沖液包括有機(jī)酸鹽，例如檸檬酸、抗壞血酸、葡糖酸、碳 酸、酒石酸、丁二酸、乙酸或鄰苯二甲酸的鹽，Tris、氨基丁三醇鹽酸鹽或磷酸鹽緩沖液。其 他載體包括聚合的賦形劑/添加劑，例如聚乙烯吡咯烷酮，菲科爾（ficoll)(聚合的糖類）、 葡萄糖結(jié)合劑（dextrate)(例如，環(huán)糊精，例如2-輕基丙基quadrature.-環(huán)糊精）、聚乙 二醇、調(diào)味劑、抗微生物劑、甜味劑、抗氧化劑、抗靜電劑、表面活性劑（例如，聚山梨醇酯， 例如"吐溫20"參和"吐溫80"#)、脂質(zhì)（例如，磷脂、脂肪酸）、類固醇（例如，膽固醇）和 螯合劑（例如，EDTA)。
[0124] 如在此使用的，術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的載體"包含與藥物施用相容的任何標(biāo)準(zhǔn) 藥物載體，例如鹽水、溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲試劑，等 等，磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水和乳劑，例如油/水或水/油乳劑，和各種類型的潤(rùn)濕劑。補(bǔ) 充的活性化合物也可以摻入到組合物中。根據(jù)本發(fā)明制造和/或使用的、包括特定的多 肽、核酸分子或其他試劑的組合物和藥物可以包括穩(wěn)定劑和防腐劑，和任何在此描述的 載體，其他的條件是它們對(duì)于體內(nèi)使用是可接受的。其他載體、穩(wěn)定劑和佐劑的實(shí)例， 參見 Martin REMINGTON，S PHARM. SCI.，15th Ed. (Mack Publ. Co.，EaSton (1975) and Williams&Williams， （1995)，和"PHYSICIAN' S DESK REFERENCE， " 52nd ed.，Medical Economics, Montvale, N. J. (1998)〇
[0125] 在此描述方法包括藥物組合物的制造和用途，所述藥物組合物可以包括通過(guò)在此 描述的篩選方法鑒定的化合物作為活性成分。還包括的是所述藥物組合物本身。例如，在 此描述的組合物可以包括提高GBA或PS/SC的一種或兩種的活性或水平的試劑。
[0126] 藥物組合物一般被配制為與它們預(yù)定施用途徑相容。施用途徑的實(shí)例包括胃腸外 的，例如，靜脈內(nèi)的、皮內(nèi)的、皮下的、口服（例如，吸入）、經(jīng)皮的（局部的）、經(jīng)粘膜的和直 腸的施用。
[0127] 配制適合的藥物組合物的方法是本領(lǐng)域已知的，參見，例如，Drugs and the Pharmaceutical Sciences ：a Series of Textbooks and Monographs (Dekker, NY)系列中 的書籍。例如，用于胃腸外的、皮內(nèi)的或皮下的應(yīng)用的溶液或懸浮液可以包括以下成分，無(wú) 菌的稀釋劑，例如注射用水、鹽水溶液、不揮發(fā)的油類、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成 溶劑；抗細(xì)菌試劑，例如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸或亞硫酸氫 鈉；螯合劑，例如，乙二胺四乙酸；緩沖液，例如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及用于調(diào)整 張力的試劑，例如氯化鈉或葡萄糖。pH值可以使用酸或堿調(diào)整，例如，鹽酸或氫氧化鈉。胃 腸外的制品可以封裝到由玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多劑量小瓶中。
[0128] 適合于注射的藥物組合物可包括無(wú)菌水溶液（在水可溶時(shí)）或分散體，以及用于 無(wú)菌可注射溶液或分散體的臨時(shí)制備的無(wú)菌粉劑。對(duì)于靜脈內(nèi)施用，適合的載體包括，生理 鹽水、抑菌水、Cremophor EL?(BA SF ;Parsippany，N. J.)或磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)。在所 有情況下，組合物應(yīng)當(dāng)是無(wú)菌的，并應(yīng)當(dāng)是流體，達(dá)到存在容易的可注射性的程度。它在制 造和儲(chǔ)存條件下應(yīng)該是穩(wěn)定的，并且必須保存于對(duì)抗微生物例如細(xì)菌和真菌的污染作用之 下。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其含有，例如，水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇、液體 聚乙二醇等等）、以及其適合的混合物。例如，通過(guò)使用包衣例如卵磷脂、在分散體的情況下 通過(guò)維持所需的粒子大小、以及通過(guò)使用表面活性劑，可以維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性?？梢酝ㄟ^(guò)各 種抗細(xì)菌和抗真菌劑，例如，對(duì)羥苯甲酸、氯代丁醇、酚、抗壞血酸、硫柳汞等等，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)微 生物作用的預(yù)防。在很多情況下，優(yōu)選的是在組合物中包括等滲試劑，例如，糖類、多元醇如 甘露醇、山梨醇、氯化鈉。通過(guò)在組合物中包括延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁和明膠，可 以實(shí)現(xiàn)可注射組合物的延長(zhǎng)的吸收。
[0129] 通過(guò)將活性化合物以所需的數(shù)量摻入到具有以上列舉成分的一種或組合的適合 的溶劑中，根據(jù)需要，繼之以過(guò)濾滅菌，來(lái)制備無(wú)菌可注射溶液。一般地，通過(guò)將活性化合物 摻入到含有堿性分散介質(zhì)以及來(lái)自以上列舉那些的其他所需成分的無(wú)菌載體中，來(lái)制備分 散體。對(duì)于用于制備無(wú)菌可注射溶液的無(wú)菌粉劑來(lái)說(shuō)，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和凍干 技術(shù)，其產(chǎn)生活性成分加上來(lái)自其早先無(wú)菌過(guò)濾溶液的任何其他期望成分的粉劑。
[0130] 口服組合物一般包括惰性稀釋劑或可食用的載體。對(duì)于口服治療施用來(lái)說(shuō)，活性 化合物可以與賦形劑混合，以片劑、錠劑或膠囊例如明膠膠囊的形式使用?？诜M合物也可 以使用用作嗽口劑的流體載體來(lái)制備。藥學(xué)上相容的結(jié)合試劑、和/或佐劑材料可以包括 為組合物的部分。片劑、藥丸、膠囊、錠劑等等可以含有任何以下的成分，或類似性質(zhì)的化合 物：粘合劑，例如微晶纖維素、西黃蓍樹膠或明膠；賦形劑，例如淀粉或乳糖，崩解劑，例如 藻酸、Primogel⑩或玉米淀粉；潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂或Sterotest?;助流劑，例如，膠體二 氧化硅；甜味劑，例如蔗糖或糖精；調(diào)味劑，例如薄荷、水楊酸甲酯或橙味調(diào)味劑。
[0131] 對(duì)于通過(guò)吸入施用，化合物可從壓縮容器或分配器以氣溶膠噴霧來(lái)遞送，所述壓 縮容器或分配器含有適合的推進(jìn)劑，例如氣體，如二氧化碳，或噴霧器。這樣的方法包括在 美國(guó)專利No. 6, 468, 798中描述的那些。
[0132] 在此描述的治療化合物的全身性施用也可以通過(guò)是經(jīng)粘膜或經(jīng)皮的方式。對(duì)于經(jīng) 粘膜或經(jīng)皮施用，適合于需透過(guò)的障礙物的滲透劑可以用于制劑中。這種滲透劑一般是本 領(lǐng)域已知的，包括，例如，對(duì)于經(jīng)粘膜施用，洗滌劑、膽汁鹽、和羧鏈孢酸衍生物。經(jīng)粘膜施用 可以通過(guò)使用鼻噴霧劑或栓劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)于經(jīng)皮施用，如本領(lǐng)域一般已知的，活性化合物被 配制到軟膏劑、油膏劑、凝膠劑或乳膏劑中。
[0133] 藥物組合物也可以以用于直腸遞送的栓劑（例如，具有常規(guī)的栓劑基質(zhì)，例如可 可脂和其他甘油酯）或滯留灌腸劑的形式制備。
[0134] 是或包括核酸的治療化合物可以通過(guò)適合于核酸試劑，例如DNA疫苗的施用的任 何方法來(lái)施用。這些方法包括基因槍、生物注射器和皮膚貼片，以及無(wú)針頭的方法，例如在 美國(guó)專利No. 6, 194, 389中公開的微粒DNA疫苗技術(shù)，以及如美國(guó)專利No. 6, 168, 587中公 開的使用粉末形式的疫苗的哺乳動(dòng)物經(jīng)皮無(wú)針頭的疫苗接種。另外，鼻內(nèi)遞送是可能的，特 別是，在 Hamajima 等，（1998) Clin. Immunol. Immunopathol，88 (2)，205-10 中描述了。也可 以使用脂質(zhì)體（例如，在美國(guó)專利6, 472, 375中描述的）和微膠囊。也可以使用生物可降 解的可靶向微粒遞送系統(tǒng)（例如，在美國(guó)專利No. 6, 471，996中描述的）。
[0135] 在一個(gè)實(shí)施方式中，使用載體制備治療化合物，所述載體將保護(hù)所述治療化合物 對(duì)抗從身體的快速消除，例如控釋制劑，包括植入物和微膠囊化的遞送系統(tǒng)?？梢允褂蒙?物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚羥基乙酸、膠原、聚正酯 (polyorthoesters)、聚乳酸。這樣的制劑可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。這些材料也可以商業(yè)地 獲自Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc。脂質(zhì)體懸浮液（包括具有針對(duì)病 毒抗原的單克隆抗體、靶向受感染細(xì)胞的脂質(zhì)體）也可以用作藥學(xué)上可接受的載體。這些 可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來(lái)制備，例如，如美國(guó)專利No. 4, 522, 811中描述的。
[0136] 所述藥物組合物可以與施用的說(shuō)明一起被包括在容器、包裝或分配器中。
[0137] 試劑盒
[0138] 根據(jù)本發(fā)明的試劑盒是獨(dú)立部件的組裝物。雖然它們可以包裝在單個(gè)容器中，它 們可以被獨(dú)立地分裝。甚至單獨(dú)的容器也可以分到不同的區(qū)室中。一般地，一套說(shuō)明書將 伴隨著試劑盒，并提供了用于遞送所述酶，例如，腦室內(nèi)地遞送GBA多肽的說(shuō)明書。所述說(shuō) 明書可以是印刷的形式，電子形式，指導(dǎo)視頻或DVD的形式，在光盤、在軟磁盤上，在包裝中 提供的地址的互聯(lián)網(wǎng)上，或這些方式的組合。其他成分，例如稀釋齊IJ、緩沖液、溶齊IJ、膠帶、螺 絲和維護(hù)工具可以在所述酶、一個(gè)或更多個(gè)套管或?qū)Ч芎?或泵之外提供。
[0139] 篩選方法
[0140] 還包括在此的是篩選測(cè)試化合物，例如，多肽、多核苷酸、無(wú)機(jī)或有機(jī)的大分子或 小分子測(cè)試化合物的方法，來(lái)鑒定在治療不與溶酶體貯積病相關(guān)的突觸核蛋白病病癥，例 如原發(fā)的突觸核蛋白病中有用的試劑。特別是，所述新的篩選分析被設(shè)計(jì)以定位充當(dāng)野生 型或突變型GBA的GBA活化試劑的新的化合物。
[0141] 如在此使用的，"小分子"是指分子量低于約3, 000道爾頓的小的有機(jī)的或無(wú)機(jī)的 分子。一般地，對(duì)于本發(fā)明有用的小分子具有低于3, 000道爾頓（Da)的分子量。所述小分子 可以是，例如，至少約l〇〇Da到約3,000Da (例如，約100到約3,000Da、約100到約2500Da、 約 100 到約 2, 000Da、約 100 到約 1，750Da、約 100 到約 1，500Da、約 100 到約 1，250Da、約 100 到約1，000Da、約100到約750Da、約100到約500Da、約200到約1500、約500到約1000、約 300 到約 1000Da、或約 100 到約 250Da)。
[0142] 測(cè)試化合物可以是，例如，天然產(chǎn)物或組合化學(xué)庫(kù)的成員。一組各種分子應(yīng)當(dāng) 被用來(lái)覆蓋各種功能，例如，電荷、芳香性、氫鍵鍵合、柔性、大小、側(cè)鏈長(zhǎng)度、疏水性和剛 性。適合于合成小分子的組合技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，例如，由Obrecht and Villalgordo, Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound Libraries，Pergamon-Elsevier Science Limited(1998)所例不的，包括那些例 如"分裂和合并（split and pool)"或"平行"合成技術(shù)，固相和溶液相技術(shù)和編碼技術(shù)（參 見，例如Czarnik，（1997)Curr. Opin. Chem. Bio.，1 :6〇-6)。此外，許多小分子庫(kù)是商業(yè)上可 獲得的。許多適合的小分子測(cè)試化合物在美國(guó)專利No. 6, 503, 713中列出了，通過(guò)完全引用 合并在此。
[0143] 利用本發(fā)明的方法篩選的庫(kù)可以包含多種測(cè)試化合物類型。給定的庫(kù)可以包含一 組結(jié)構(gòu)上相關(guān)的或不相關(guān)的測(cè)試化合物。在某些實(shí)施方式中，測(cè)試化合物是肽或擬肽分子。 在某些實(shí)施方式中，測(cè)試化合物是核酸。
[0144] 在某些實(shí)施方式中，測(cè)試化合物和它的庫(kù)可以通過(guò)系統(tǒng)地改變第一測(cè)試化合物， 例如，結(jié)構(gòu)上類似于目標(biāo)多肽的已知的天然結(jié)合配體第一測(cè)試化合物，或被鑒定為能夠結(jié) 合目標(biāo)多肽的第一小分子，的結(jié)構(gòu)，例如，利用本領(lǐng)域已知的方法或在此描述的方法，并將 所述結(jié)構(gòu)與產(chǎn)生的生物學(xué)活性相關(guān)聯(lián)，例如，結(jié)構(gòu)_活性關(guān)系研究，來(lái)獲得。本領(lǐng)域技術(shù)人 員將理解，對(duì)于產(chǎn)生這樣的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系，存在著多種的標(biāo)準(zhǔn)方法。因而，在某些情況下， 所述工作基本上是經(jīng)驗(yàn)性的，在其他實(shí)施方式中，內(nèi)源多肽或其部分的三維結(jié)構(gòu)可以被用 作小分子化合物的合理設(shè)計(jì)的出發(fā)點(diǎn)。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，例如利用在此描述的方法 篩選小分子的一般庫(kù)。
[0145] 在某些實(shí)施方式中，測(cè)試化合物被用于測(cè)試樣品，例如，細(xì)胞或活組織或器官，評(píng) 估測(cè)試化合物的一種或更多種效力。在例如培養(yǎng)的或原代細(xì)胞中，測(cè)試化合物提高GBA或 PS/SC的水平和/或活性的能力可以被測(cè)定。在此描述的基于MES細(xì)胞的模型可以被用于 這樣的篩選分析。舉例來(lái)說(shuō)，利用MES細(xì)胞培養(yǎng)平板（96-或384孔的），基于小分子的化學(xué) 物質(zhì)庫(kù)以1 U M的測(cè)試濃度施加36-48小時(shí)的時(shí)間。細(xì)胞被裂解并通過(guò)夾心ELISA分析，例 如,如在此處附圖3A到3D中示出的，來(lái)測(cè)定這些化合物對(duì)每個(gè)反應(yīng)孔中的a -突觸核蛋白 蛋白質(zhì)濃度的凈影響。
[0146] 在某些實(shí)施方式中，所述測(cè)試樣品是，或來(lái)自于（例如，來(lái)自它的樣品）在此描述 的突觸核蛋白病病癥的體內(nèi)模型。例如，可以使用動(dòng)物模型，例如，嚙齒動(dòng)物模型，例如小鼠 或大鼠模型。特別地，突觸核蛋白病的MaSliah小鼠模型是適合的（可從JSW Research， Graz，Austria 商業(yè)上獲得）（參見，MaSliah 等?，Science，2000Feb 18 ;287 (5456): 1265-9)。
[0147] 評(píng)估這些效力的每一種的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)的能 力可以在基因或蛋白質(zhì)水平上評(píng)估，例如，使用定量的PCR或免疫分析方法。在某些實(shí)施 方式中，高通量方法，例如本領(lǐng)域已知的蛋白質(zhì)或基因芯片（參見，例如Ch. 12, Genomics， in Griffiths 等.,Eds. Modern genetic Analysis, 1999, ff. H. Freeman and Company ； Ekins and Chu，1999Trends in Biotechnology，17 :217_218 ;MacBeath and Schreiber， 2000Science,289(5485) ：1760-1763 ；Simpson, Proteins and Proteomics ：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press ；2002 ；Hardiman, Microarrays Methods and Applications :Nuts&Bolts，DNA Press，2003)可以用于檢測(cè)對(duì)在此描述的多肽的兩 種、三種、四種、五種或更多種的影響。
[0148] 通過(guò)在此描述的方法篩選的、和被確定提高GBA或PS/SC的水平和/或活性，或降 低aS聚集物的水平的測(cè)試化合物，可以被認(rèn)為是候選化合物。隨后在例如病癥的體內(nèi)模 型，例如突觸核蛋白病病癥的動(dòng)物模型中篩選的、被確定具有對(duì)所述病癥、例如對(duì)所述病癥 的一種或更多種癥狀具有期望的效果的候選化合物，可以被認(rèn)為是候選治療試劑。一旦在 臨床環(huán)境中篩選，候選治療試劑是治療試劑。候選化合物、候選治療試劑和治療試劑可以任 選地被優(yōu)化和/或衍生化，并與生理可接受的賦形劑配制來(lái)形成藥物組合物。
[0149] 因而，在第一篩選中被鑒定為"命中"（例如，提高GBA或PS/SC的水平和/或活性 的測(cè)試化合物）的測(cè)試化合物可以被選擇和系統(tǒng)性地改變，例如，使用合理的設(shè)計(jì)，來(lái)優(yōu)化 結(jié)合親和性（affinity)、親合力（avidity)、特異性或其他參數(shù)。這樣的優(yōu)化也可以利用在 此描述的方法來(lái)篩選。因而，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括利用本領(lǐng)域已知的方法和/或 在此描述的方法篩選化合物的第一庫(kù)，鑒定該庫(kù)中的一個(gè)或更多個(gè)命中，將那些命中進(jìn)行 系統(tǒng)性結(jié)構(gòu)改變來(lái)產(chǎn)生與所述命中結(jié)構(gòu)上相關(guān)的化合物的第二庫(kù)，利用在此描述的方法篩 選所述第二庫(kù)。
[0150] 被鑒定為命中的測(cè)試化合物可以被認(rèn)為是在治療此處描述的突觸核蛋白病病癥 方面有用的候選治療化合物。對(duì)于測(cè)定"命中"的結(jié)構(gòu)有用的各種技術(shù)可以用于在此描述 的方法，例如，NMR，質(zhì)譜法、裝備有的電子俘獲檢測(cè)器的氣相色譜法、熒光和吸收光譜法。因 而，本發(fā)明還包括通過(guò)在此描述的方法鑒定為"命中"的化合物，以及它們的施用方法和在 治療、預(yù)防或延遲在此描述的病癥的發(fā)展或進(jìn)行方面的用途。
[0151] 被鑒定為候選治療化合物的測(cè)試化合物可以進(jìn)一步通過(guò)向在此描述的突觸核蛋 白病病癥的動(dòng)物模型施用來(lái)篩選?？梢员O(jiān)視動(dòng)物在病癥方面的改變，例如，在病癥的參數(shù)方 面，例如，與臨床結(jié)局相關(guān)的參數(shù)方面的改善。
[0152] 實(shí)施例
[0153] 在以下實(shí)施例中進(jìn)一步描述了本發(fā)明，其不限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍在 權(quán)利要求中描述。
[0154] 實(shí)施例1 :鞘糖脂在體外與a -突觸核蛋白生物化學(xué)相關(guān)
[0155] 在這個(gè)實(shí)施例中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)展現(xiàn)了，在a _突觸核蛋白蛋白質(zhì)和人類腦神經(jīng)節(jié)苷 脂之間穩(wěn)定復(fù)合物的存在，其最終變?yōu)镚BA酶的底物。
[0156] 神經(jīng)節(jié)苷脂是復(fù)合的鞘糖脂，其含有葡萄糖腦苷脂單位作為它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)的部 分（參見，例如Dreisewerd等，（2005) Anal Chem. ,77,4098-107)。結(jié)果，葡萄糖腦苷脂單位 構(gòu)成了在神經(jīng)節(jié)苷脂的連續(xù)合成-降解循環(huán)中的構(gòu)建塊和降解產(chǎn)物。一組良好表征的、腦 衍生的神經(jīng)節(jié)苷脂（參見 Schlossmacher 等，（2005) N.EJ.M.，352, 728-731，和 Dreisewerd 等.（2005))與重組a-突觸核蛋白蛋白質(zhì)的體外共同孵育，導(dǎo)致了在高度變性SDS/PAGE 條件下穩(wěn)定的復(fù)合物的形成，如Western印跡所顯示的，促使16kDa a -突觸核蛋白復(fù)合物 朝向19_20kDa更高分子量a -突觸核蛋白蛋白質(zhì)/葡萄糖腦苷脂復(fù)合物的電泳移動(dòng)（附 圖1)。
[0157] 附圖1是Western印跡的呈現(xiàn)，展現(xiàn)了在體外人類腦神經(jīng)節(jié)苷脂和a -突觸核蛋 白蛋白質(zhì)之間穩(wěn)定的19_20kDa復(fù)合物（aS/G)的時(shí)間依賴性形成。人類腦衍生的神經(jīng)節(jié) 苷脂（G)與重組人類a-突觸核蛋白蛋白質(zhì)（aS;野生型）在4°C共孵育最長(zhǎng)至72小時(shí) 的各個(gè)時(shí)間段，之后進(jìn)行SDS/PAGE。作為陰性對(duì)照（C)，水與重組人類a-突觸核蛋白蛋白 質(zhì)孵育72小時(shí)。在19-20kDa處遷移的上部條帶的時(shí)間依賴性出現(xiàn)，在與神經(jīng)節(jié)苷脂孵育 而不是與水孵育的樣品中被觀察到，被解釋為穩(wěn)定的突觸核蛋白蛋白質(zhì)-神經(jīng)節(jié)苷脂 (a S/G)復(fù)合物。未復(fù)合的a-突觸核蛋白蛋白質(zhì)的存在由分子量16kDa的條帶指示。
[0158] 這些和相關(guān)的發(fā)現(xiàn)表明，a-突觸核蛋白蛋白質(zhì)可以與含有葡萄糖腦苷脂的復(fù)合 脂質(zhì)以一定方式作用，所述方式是高度穩(wěn)定的和對(duì)SDS的存在是相對(duì)抗性的。
[0159] 實(shí)施例2 :葡萄糖腦苷脂在體外與a _突觸核蛋白蛋白質(zhì)生物化學(xué)相關(guān)
[0160] 人類組織衍生的或合成的葡萄糖腦苷脂（aka作為葡萄糖神經(jīng)酰胺；GC)在4°C與 重組人類a-突觸核蛋白蛋白質(zhì)（aS;野生型）共同孵育最長(zhǎng)至72小時(shí)的各個(gè)時(shí)間段，之 后進(jìn)行SDS/PAGE。作為陰性對(duì)照（C)，水與重組人類a-突觸核蛋白蛋白質(zhì)孵育72小時(shí)。 大約19_22kDa處遷移的上部條帶的時(shí)間依賴性出現(xiàn)應(yīng)當(dāng)在與葡萄糖腦苷脂孵育的樣品中 注意到。未復(fù)合的a-突觸核蛋白蛋白質(zhì)的存在由分子量16kDa的條帶指示。
[0161] 這些和相關(guān)的發(fā)現(xiàn)表明，a-突觸核蛋白蛋白質(zhì)可以與葡萄糖腦苷脂以一定方式 作用，所述方式是高度穩(wěn)定的和對(duì)SDS的存在是相對(duì)抗性的。
[0162] 實(shí)施例3 :葡萄糖鞘氨醇在體外與a -突觸核蛋白蛋白質(zhì)生物化學(xué)相關(guān)
[0163] 人類組織衍生的或合成的葡萄糖鞘氨醇（aka作為葡萄糖基鞘氨醇；Gs)與重組人 類a-突觸核蛋白蛋白質(zhì)（aS;野生型）在4°C共同孵育最長(zhǎng)至72小時(shí)的各個(gè)時(shí)間段，之 后進(jìn)行SDS/PAGE。作為陰性對(duì)照（C)，水與重組人類a-突觸核蛋白蛋白質(zhì)孵育72小時(shí)。 大約19_22kDa處遷移的上部條帶的時(shí)間依賴性出現(xiàn)應(yīng)當(dāng)在與葡萄糖鞘氨醇孵育的樣品中 注意到。未復(fù)合的a-突觸核蛋白蛋白質(zhì)的存在由分子量16kDa的條帶指示。
[0164] 這些和相關(guān)的發(fā)現(xiàn)表明，a-突觸核蛋白蛋白質(zhì)可以與葡萄糖鞘氨醇以一定方式 作用，所述方式是高度穩(wěn)定的和對(duì)SDS的存在是相對(duì)抗性的。
[0165] 實(shí)施例4 :用于a -突觸核蛋白蛋白質(zhì)表達(dá)的、表達(dá)多巴胺的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的 建立
[0166] 表達(dá)多巴胺的嚙齒動(dòng)物中腦細(xì)胞培養(yǎng)物系統(tǒng)（MES23. 5細(xì)胞）被用于a -突觸核 蛋白蛋白質(zhì)過(guò)量表達(dá)系統(tǒng)的建立。早先，這些細(xì)胞已經(jīng)被Sharon等人使用來(lái)創(chuàng)造過(guò)量表 達(dá)a S的穩(wěn)定的細(xì)胞系。然而，這些作者注意到，穩(wěn)定的a S轉(zhuǎn)染的MES23. 5細(xì)胞克隆在傳 代2個(gè)月或更久之后逐漸地放松a S表達(dá)（Sharon R，等，（2001) PNAS 98,9110-9115)。為 了避免這個(gè)問(wèn)題，在本研究中，MES23. 5細(xì)胞每次使用Lipofectamine?2000(Invitrogen Corp)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。由于MES23. 5細(xì)胞僅僅松散地附著到組織培養(yǎng)塑料皿，細(xì)胞在聚-D-賴 氨酸包被的塑料皿上培養(yǎng)，是一種早先未在文獻(xiàn)中使用的方法。此外，Invitrogen Corp建 議當(dāng)細(xì)胞> 80%匯合時(shí)用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染，在這項(xiàng)研究中經(jīng)驗(yàn)性地發(fā)現(xiàn)的是，當(dāng) 細(xì)胞50-60%匯合時(shí)轉(zhuǎn)染大大地改善了轉(zhuǎn)染效率（通過(guò)姐妹反應(yīng)孔中編碼綠色熒光蛋白 (GFP)的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率來(lái)測(cè)量的，在熒光顯微鏡下在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后目測(cè)）。
[0167] 如在附圖2A中示出的，MES23. 5細(xì)胞用在CMV啟動(dòng)子控制下的全長(zhǎng)的aS編碼 SNCA cDNA質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。細(xì)胞用0、0. 25、0. 5、1、5和10iig (每10cm皿）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。24小 時(shí)后，細(xì)胞用 Tris 緩沖鹽水洗滌，在 140mM NaCl、50mM Tris-HCl，pH 8. 0、lmM EDTA、0. 5% Triton-XlOO和IX蛋白酶抑制物中裂解。溶胞產(chǎn)物在4°C在100,000Xg離心30分鐘，取 出上清液的上部2/3,在硅化試管中在-80°C冷凍。使用ImM DTT作為還原劑在SDS/PAGE 運(yùn)行樣品。a S蛋白質(zhì)的表達(dá)在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)通過(guò)Western印跡確認(rèn)，其中細(xì)胞溶胞產(chǎn)物 使用針對(duì)aS蛋白質(zhì)的單克隆抗體（syn-1抗體，BD Transduction Labs)來(lái)探測(cè)。顯示了 表達(dá)是取決于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒初始數(shù)量的，最高到5-10 y g每10cm皿的飽和數(shù)量。
[0168] 實(shí)施例5 :利用MES23. 5細(xì)胞用于a -突觸核蛋白和選擇的溶酶體蛋白質(zhì)的伴隨 表達(dá)的探索研究
[0169] 在這個(gè)實(shí)施例中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)（附圖2B中所示）展現(xiàn)了在細(xì)胞GBA蛋白質(zhì)方面提 高的水平可以降低神經(jīng)突觸核蛋白蛋白質(zhì)的水平。
[0170] MES23. 5 細(xì)胞用 0? ga S編碼 SNCA cDNA每 10cm皿加上 1. 25、2. 5 或g(低、 中或高）GBA編碼cDNA，在不存在或存在5 y g皂化蛋白原編碼cDNA的情況下轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn) 的所有分支使用空的載體cDNA平衡到總共10. 5 ii g cDNA每10cm皿。在CMV啟動(dòng)子之下 的GBA和皂化蛋白原編碼cDNA質(zhì)粒、以及pCMV-XL5空載體購(gòu)自O(shè)riGene Technologies， Inc (在分離和混合制備之后，克隆被完全測(cè)序證實(shí)）。24小時(shí)后，細(xì)胞被裂解，并探測(cè)GBA 和aS蛋白質(zhì)水平。附圖2B3中的上部畫面是指示缺乏和存在共同轉(zhuǎn)染的皂化蛋白原的情 況下GBA蛋白質(zhì)表達(dá)的Western印跡的呈現(xiàn)。使用單克隆抗體8E4探測(cè)GBA。在不存在阜 化蛋白原的情況下，GBA以稍微基因劑量依賴性的方式發(fā)生過(guò)量表達(dá)。在存在皂化蛋白原 過(guò)量表達(dá)的情況下，GBA信號(hào)本身被降低。這種觀察結(jié)果可以通過(guò)在GBA活化期間的修飾、 導(dǎo)致它在這些SDS/PAGE/Western印跡條件下被采用的單克隆抗體的降低的可識(shí)別性，通 過(guò)在它被PS/SC活化之后更快的GBA的溶酶體內(nèi)降解速率來(lái)解釋，或者，考慮到三種不同的 帶有外源cDNA的質(zhì)粒的伴隨遞送，它可以作為總體降低的cDNA轉(zhuǎn)錄和翻譯率的結(jié)果而發(fā) 生。
[0171] 附圖2B的下部畫面顯示了，在不存在共同轉(zhuǎn)染的皂化蛋白原的情況下，在最大數(shù) 量的共轉(zhuǎn)染的GBA cDNA的情況下，GBA降低了共同表達(dá)的a-突觸核蛋白蛋白質(zhì)水平。這 種觀察到的GBA的a -突觸核蛋白蛋白質(zhì)降低效力通過(guò)皂化蛋白原的共表達(dá)被大大地強(qiáng)化 了，由在甚至更低濃度（低度和中度）的轉(zhuǎn)染的GBA編碼cDNA之下a-突觸核蛋白蛋白質(zhì) 水平的強(qiáng)烈降低所表明。附圖2C中的柱形圖展現(xiàn)了附圖2B中顯示的數(shù)據(jù)的半定量的概述。
[0172] 總之，斷定的是，在這些離體（ex vivo)細(xì)胞培養(yǎng)條件下，提高的GBA活性可以降 低a-突觸核蛋白穩(wěn)態(tài)水平，特別是在存在提高的PS/SC的情況下。因而，這種策略可以用 于降低體內(nèi)a-突觸核蛋白穩(wěn)態(tài)水平，包括，在處于a-突觸核蛋白含量的嚴(yán)重升高的水平 的風(fēng)險(xiǎn)中、或已經(jīng)受其影響的人類腦部，例如在患有突觸核蛋白病病癥的受試者中。因此， 提高體內(nèi)的GBA活性和/或PS/SC水平的策略代表了帕金森氏病（PD)和相關(guān)的突觸核蛋 白病的神經(jīng)保護(hù)性治療的新的通路。
[0173] 實(shí)施例6 :定量測(cè)定轉(zhuǎn)染的MES23. 5細(xì)胞中a-突觸核蛋白濃度的第一種（first in kind)敏感和精確的ELISA系統(tǒng)的建立
[0174] 對(duì)于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)和研究，希望的是降低對(duì)Western印跡方法的依賴，它是低通 量的并具有有限的動(dòng)態(tài)范圍，作為替代創(chuàng)造一種定量的夾心ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析）系 統(tǒng)用于a S的中度通量定量，具有改進(jìn)的敏感性、優(yōu)化的特異性和動(dòng)態(tài)范圍。
[0175] 針對(duì)重組的全長(zhǎng)人類a S產(chǎn)生來(lái)自6只兔子的血清，并在Open Biosystems，Inc. (http ://www. openbiosystems. com)上親和純化。重組a S已經(jīng)被HPLC和MS表征并進(jìn)行 氨基酸組成和蛋白質(zhì)濃度分析。對(duì)于ELISA, 384孔MaxiSorp平板（Nunc, Inc)用在包被緩 沖液（具有〇.2%似吧的似110)34119.6)中稀釋的5〇111/孔捕獲多克隆4匕〇^-2)來(lái)包 被。在用PBS/0. 05% Tween-20 (PBS-T)洗滌之后，平板在封閉緩沖液（1. 125 %魚皮明膠； PBS-T)中在37°C下封閉2小時(shí)。在4次洗滌之后，加載樣品在4°C孵育12小時(shí)。生物素化的 Syn-lmAb (作為分析Ab)使用200ii g硫代-NHS-LC生物素（Pierce)產(chǎn)生，在封閉緩沖液中 稀釋并在37°C下添加到平板2小時(shí)。在4次洗滌之后，在封閉緩沖液中稀釋的ExtrAvidin 磷酸酶（Sigma)在37°C應(yīng)用1小時(shí)。通過(guò)使用FaSt-P-硝基苯基磷酸酶（Sigma)進(jìn)行顯 色，每5分鐘在OD 405nm動(dòng)態(tài)地監(jiān)測(cè)直到60分鐘。
[0176] 各種濃度的高度純化的、重組的人類a S(r-haS)用作標(biāo)準(zhǔn)物來(lái)建立ELISA敏感性 和分析范圍，如在附圖3A中顯示的（r2 > 0. 98)。
[0177]為了以低細(xì)胞毒性優(yōu)化"DNA :Lipofectamine?2000"比例，MES23. 5 細(xì)胞用 0? 25、 0. 5或1 ii g a S編碼野生型人類SNCA cDNA加空載體cDNA直到總共5. 5 ii g DNA每10cm皿 來(lái)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，如上述收獲細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。對(duì)于細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的連續(xù)稀釋物，含 有來(lái)自載體轉(zhuǎn)染的孔的0.5%溶胞產(chǎn)物的封閉緩沖液用作稀釋劑，其也用于產(chǎn)生空白和重 組人類aS的相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢查飽和度動(dòng)力學(xué)，用于在標(biāo)準(zhǔn)物和樣品稀釋物處于對(duì)數(shù) 階段時(shí)的時(shí)點(diǎn)的鑒定。
[0178] 當(dāng)通過(guò)ELISA分析這些細(xì)胞溶胞產(chǎn)物時(shí)，記錄了 MES- a S細(xì)胞中的濃度，其顯示了 在連續(xù)稀釋之后預(yù)計(jì)的平行關(guān)系，并且是SCNA cDNA劑量依賴性的（這兩個(gè)方面在附圖3B 的圖形中顯示），以及第一次允許精確的計(jì)算活細(xì)胞中表達(dá)的a S蛋白質(zhì)濃度的總量（如附 圖3C中所示）。
[0179] 還確認(rèn)的是，在細(xì)胞表達(dá)的這些精細(xì)化的條件下，MES23. 5和MES-syn細(xì)胞的生 存力沒有改變，如通過(guò)作為細(xì)胞滲漏的標(biāo)志物、條件培養(yǎng)基中LDH(乳酸脫氫酶，正常細(xì) 胞溶質(zhì)酶）所測(cè)量的，和通過(guò)作為完整細(xì)胞新陳代謝的標(biāo)志物、MTT((3-(4,5-二甲基噻 唑-2-基）-2，5-聯(lián)苯四唑備溴化物）向甲月替的細(xì)胞轉(zhuǎn)變所測(cè)量的。對(duì)于這些標(biāo)準(zhǔn)的毒性 分析，并行地進(jìn)行了導(dǎo)致100%細(xì)胞裂解（0.1%Trit 〇n-X€)100處理）的陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果 在附圖3D中示出。還確定的是，對(duì)于所有實(shí)驗(yàn)中選擇的cDNA濃度范圍，MES- a S和MES-載 體細(xì)胞在MTT分析中是完全代謝活性的，顯示了沒有細(xì)胞溶質(zhì)衍生的LDH向轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染 細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中的釋放。因而，兩項(xiàng)分析都展現(xiàn)了細(xì)胞的完整性。
[0180] 實(shí)施例7 :在GBA中突觸核蛋白病病相關(guān)的、以及催化位點(diǎn)定點(diǎn)突變促進(jìn)了多巴胺 能MES細(xì)胞中a -突觸核蛋白的積累
[0181] 實(shí)施例6中描述的優(yōu)化的細(xì)胞表達(dá)/ELISA讀出系統(tǒng)被用于檢查突變的GBA蛋白 質(zhì)的過(guò)量表達(dá)對(duì)MES23. 5細(xì)胞中a S水平的影響。
[0182] MES細(xì)胞用0. 5 ii g每10cm皿的帶有a S編碼SNCA cDNA的質(zhì)粒加上5 ii g每10cm 皿的野生型或突變的人類GBA編碼質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。使用的GBA變體是野生型、N370S、D409H、 L444P、E235A 和 E340A。這 5 種 GBA 突變體利用 Quickchange ⑩試劑盒（Stratagene)通過(guò) 定點(diǎn)誘變來(lái)產(chǎn)生，并驗(yàn)證序列。N370S、D409H和L444P已知（以純合的或復(fù)合的雜合狀態(tài)） 以雜合的狀態(tài)在高歇病中、在帕金森病患者和/或患有Lewy體癡呆的患者中存在。E235A 和E340A突變GBA蛋白質(zhì)已知不在人類中存在。它們分別涉及GBA酶的酸性/堿性催化劑 和親核劑，早先顯示是無(wú)催化活性的，盡管被適當(dāng)?shù)卣_地運(yùn)輸?shù)饺苊阁w中（Fabrega等， 2000,Glycobiology，vol 10,pp 1217-1224)。
[0183] 轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，MES細(xì)胞被如上所述地裂解，通過(guò)ELISA分析所有溶胞產(chǎn)物。如 在概述了幾項(xiàng)ELISA實(shí)驗(yàn)（附圖4中示出）的復(fù)合柱形圖中展示的，當(dāng)將a -突觸核蛋白 穩(wěn)態(tài)方面的變化與平行加載的重組突觸核蛋白蛋白質(zhì)的已知數(shù)量比較時(shí)，記錄的是在 這些條件下野生型GBA(而不是皂化蛋白原）的與aS的共同表達(dá)（Syg/lOcm皿）不顯著 地改變a S水平（109. 7+/-9. 88%的載體cDNA對(duì)照水平）。這與上文的實(shí)施例5中觀察到 的結(jié)果相比較。觀察到的矛盾可以反映兩個(gè)范例中轉(zhuǎn)染的總DNA的差異（附圖2B ;附圖2C 對(duì)比附圖4)，從而導(dǎo)致DNA :Lipofectamine⑩2000比例的改變，以及共同表達(dá)的阜化蛋白 原（皂化蛋白C)的作用方面的差異。因而可想像的是，野生型GBA對(duì)這些MES23. 5細(xì)胞中 的aS水平具有可變的影響，取決于aS進(jìn)入溶酶體的比率以及超過(guò)一種溶酶體酶的組成 或活化狀態(tài)。
[0184] 相比之下，帶有疾病相關(guān)的N370S、D409H或L444P的GBA突變體與a S的 共轉(zhuǎn)染（5yg每10cm皿）一致地導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)a-突觸核蛋白積累，其是對(duì)照水平的 121.1+/-4.98%、269.4+/-56.6%和 172.7+/-23.02%(平均值+/-平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差，11 = 4(-6)，來(lái)自5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)），如在附圖4的柱形圖中所展現(xiàn)的。這些結(jié)果第一次幫助解釋 了，為什么具有N370S、D409H或L444P突變的人對(duì)散發(fā)的帕金森氏病更為敏感。令人感興 趣的是，一般產(chǎn)生高歇?。á牵┑淖钶p形式的突變，即，N370S，僅僅促進(jìn)aS的輕微積累，而 與更嚴(yán)重的GD表型相關(guān)的那些促進(jìn)更突出的細(xì)胞內(nèi)a S積累（參見，例如，附圖4中的GBA 突變 D409H)。
[0185] 為了研究GBA突變對(duì)a S濃度的促積累效應(yīng)是由于引起更一般化的細(xì)胞應(yīng)激的運(yùn) 輸缺陷、還是由于溶酶體內(nèi)酶的功能的損失，我們接下來(lái)采用了正確地運(yùn)輸?shù)饺苊阁w、但是 展現(xiàn)了酶功能的完全喪失的兩種突變體。GBA的帶有E235A和E340A錯(cuò)義突變的變體與a S 的共轉(zhuǎn)染（5yg每10cm皿）產(chǎn)生了細(xì)胞內(nèi)a-突觸核蛋白水平，其分別是對(duì)照載體DNA水 平的 231. 0+/-37. 14%和 156. 4+/-19. 65% (平均值 +/-sem，n = 4(-6)，來(lái)自 5 個(gè)獨(dú)立實(shí) 驗(yàn)），如在附圖4中顯示的柱形圖中展現(xiàn)的。
[0186] 根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，看起來(lái)這種非蛋白酶型溶酶體酶的活性喪失至少部分地對(duì) a S積累效應(yīng)起作用，其是由人類疾病相關(guān)的GBA突變體誘導(dǎo)的。
[0187] 實(shí)施例8:組織蛋白酶D的表達(dá)一致地和顯著地以劑量依賴性方式降低a _突觸 核蛋白蛋白質(zhì)水平
[0188] 在實(shí)施例6中描述的系統(tǒng)被用于檢查蛋白酶型溶酶體酶，S卩，組織蛋白酶D，對(duì)共 轉(zhuǎn)染的a S水平的影響。
[0189] MES23. 5細(xì)胞轉(zhuǎn)染了 0. 5 ii g每10cm皿的攜帶編碼a S的野生型人類SNCA cDNA 的質(zhì)粒（在附圖6顯示的Western印跡中稱為MES-hSNCA WT細(xì)胞），加1.25、2. 5或5iig 每10cm皿的人類組織蛋白酶D編碼CTSD cDNA質(zhì)粒，其購(gòu)自O(shè)riGene Technologies，Inc.， 處于CMV啟動(dòng)子的控制下。在分離和maxiprep之后，組織蛋白酶D克隆被全序列證實(shí)。每 個(gè)轉(zhuǎn)染分支用空載體DNA平衡直到總共5. 5 y g DNA每10cm皿。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，細(xì)胞被裂 解，產(chǎn)生的溶胞產(chǎn)物通過(guò)在此描述的夾心ELISA來(lái)分析。
[0190] 如附圖5中展現(xiàn)的，人類組織蛋白酶D的共表達(dá)降低了細(xì)胞內(nèi)a-突觸核蛋白蛋 白質(zhì)水平。這以CTSD cDNA劑量依賴性方式發(fā)生，因?yàn)楣厕D(zhuǎn)染的組織蛋白酶D的提高的 數(shù)量引起了細(xì)胞內(nèi)a-突觸核蛋白水平的漸進(jìn)性的降低。當(dāng)將a-突觸核蛋白穩(wěn)態(tài)方面 的改變與平行加載的重組a-突觸核蛋白蛋白質(zhì)的已知水平比較時(shí)，計(jì)算出的是，組織蛋 白酶D過(guò)量表達(dá)的最高濃度（5iig/10cm皿）產(chǎn)生了是對(duì)照水平的25. 3+/-7.0%的細(xì)胞 內(nèi)總a-突觸核蛋白水平（n= 11，來(lái)自3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)）。組織蛋白酶D過(guò)量表達(dá)的更低 的水平（1.251^/10〇11皿和2.51^/10〇11皿）產(chǎn)生了分別是對(duì)照水平的68+/-17.7%和 53+/-16.8%的細(xì)胞內(nèi)a-突觸核蛋白水平（ n = 2,來(lái)自2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)）。類似地，人類組 織蛋白酶D能夠降低共轉(zhuǎn)染的大鼠a S的水平，使用相同的范例。
[0191] 為了展現(xiàn)組織蛋白酶D的aS降低效力實(shí)際上測(cè)量為高達(dá)可檢測(cè)的細(xì)胞內(nèi)aS 濃度總量的百分之75,和為了顯示后者的效力不是由于所選的ELISA系統(tǒng)，通過(guò)Western 印跡確認(rèn)了結(jié)果。如附圖6所示，細(xì)胞溶胞產(chǎn)物用2種不同的抗突觸核蛋白抗體獨(dú)立地探 測(cè)：早先描述的單克隆的syn-1和兔多克隆7071AP (Periquet等，（2007) J. Neurosci.，27 : 3338-46)。
[0192] 重要地，組織蛋白酶D與a S的共表達(dá)24小時(shí)不導(dǎo)致任何可見的更低或更高分子 量種類的產(chǎn)生，如通過(guò)syn-1和7071AP所顯現(xiàn)的。當(dāng)使用第三抗體，兔多克隆、親和純化的 hSA-2時(shí)（數(shù)據(jù)未顯示），和當(dāng)印跡在更長(zhǎng)的暴露下過(guò)度顯現(xiàn)時(shí)，獲得了相同的結(jié)果。
[0193] 為了確認(rèn)組織蛋白酶D的效力在體內(nèi)發(fā)生，而不在細(xì)胞裂解過(guò)程期間發(fā)生，強(qiáng)力 的組織蛋白酶D抑制物胃酶抑素A的效力通過(guò)它在細(xì)胞裂解緩沖液中的存在來(lái)檢查。如在 附圖5的圖形柱條中顯示的（左側(cè)前兩個(gè)柱），在裂解緩沖液中包含胃酶抑素A不改變?nèi)馨?產(chǎn)物中檢測(cè)的a S的數(shù)量，從而展現(xiàn)了上文附圖5和6中描述的結(jié)果不是細(xì)胞裂解過(guò)程的 假象。
[0194] 為了確認(rèn)組織蛋白酶D對(duì)于MES23. 5細(xì)胞中aS的降低的效果是特異性的，而 不是由于細(xì)胞代謝和完整性方面的一般性降低，對(duì)已經(jīng)用最高數(shù)量的組織蛋白酶D編碼 cDNA(5ii g/10cm皿）共轉(zhuǎn)染的MES-syn細(xì)胞進(jìn)行MTT和LDH分析。使用0? 1% Triton-X? 100的細(xì)胞的裂解充當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照，代表最大的細(xì)胞死亡。用CTSD cDNA共轉(zhuǎn)染的MES-syn 細(xì)胞展現(xiàn)了正常的MTT信號(hào)，其與對(duì)照載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞沒有不同（分別101. 3+/-3. 91 %和 100+/-4. 05%;n = 6,來(lái)自2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)）。類似地，用組織蛋白酶D共轉(zhuǎn)染的MES-syn細(xì) 胞展現(xiàn)了與對(duì)照載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相同的LDH信號(hào)。
[0195] 為了檢查組織蛋白酶D是否也可以降低帶有錯(cuò)義突變的aS蛋白質(zhì)的水平， MES23. 5細(xì)胞用低數(shù)量（0? 5 ii g/10cm皿）的、編碼a -突觸核蛋白A30P、E46K或A53T變 體，以及S129D和S129A突變體的SNCA cDNA轉(zhuǎn)染，所述A30P、E46K或A53T變體與人類中 的家族性的帕金森疾病相關(guān)聯(lián)。在絲氨酸129殘基上a S的磷酸化已知是體內(nèi)a S聚集物 的病理學(xué)標(biāo)志（Anderson J 等，2006, J Biol Chem，vol 281，pp29739-29752.)。Ser 殘基 向ASp的突變本領(lǐng)域已知模擬了持續(xù)的、基于絲氨酸的磷酸化。a S的不能磷酸化的S129A 突變體也被包括用于比較。
[0196] 如在附圖7的柱形圖中顯示的，當(dāng)與空載體DNA的共表達(dá)相比較時(shí)，組織蛋白酶D 編碼（^50〇0嫩(51^/10〇11皿）與六30?、￡461(、六531\51290或5129六〇5的共同表達(dá)引起 了對(duì)所有檢查的aS蛋白質(zhì)的相似程度的aS水平降低。當(dāng)比較a-突觸核蛋白穩(wěn)態(tài)方面 的改變和平行加載的重組a-突觸核蛋白蛋白質(zhì)的良好表征的水平時(shí)，估計(jì)的是，組織蛋 白酶D過(guò)量表達(dá)（在5iig/10cm皿的cDNA濃度下）產(chǎn)生了細(xì)胞內(nèi)a-突觸核蛋白水平，對(duì) 于A30P、E46K、A53T、S129D或S129AaS多肽，分別是相關(guān)的對(duì)照水平的23. 98+/-3. 57%、 33. 08+/-18. 51%、39. 21+/-14. 63%、34. 84+/-11. 36%和 34. 31+/-13. 39%(n= 2(-3)，來(lái) 自2-3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)）。
[0197] 這個(gè)結(jié)果表明，（a)組織蛋白酶D也能夠降解在家族性中存在的a S的突變形 式，以及（b) aS的Ser 129殘基處的磷酸化或脫磷酸化不改變由組織蛋白酶D對(duì)aS展現(xiàn) 的蛋白水解的（"突觸核蛋白酶"）活性。
[0198] 值得注意的，a S的殘基D98和Q99代表了在伴侶蛋白介導(dǎo)的自體吞噬（CMA)期間 由 Lamp2a 受體識(shí)別的基序；Cuervo 等，2004, Science，vol 305, pp 1292-1295)。為 了研究 這種基序在組織蛋白酶D誘導(dǎo)的a S降低作用方面的重要性，MES 23. 5細(xì)胞也用編碼突變 a S變體的cDNA(0. 5 y g/lOcm皿）轉(zhuǎn)染，其中D98和Q99殘基都通過(guò)定點(diǎn)誘變改變?yōu)楸?酸（即，a S的DQ/AA變體）。當(dāng)比較DQ/AA- a S穩(wěn)態(tài)方面的改變與平行加載的重組a-突 觸核蛋白蛋白質(zhì)的良好表征的水平時(shí)，估計(jì)的是，組織蛋白酶D過(guò)量表達(dá)（5 ii g/10cm皿） 產(chǎn)生了是載體對(duì)照水平的22.14+/-5.32%的細(xì)胞內(nèi)00/^4〇3水平（11 = 3，來(lái)自3個(gè)獨(dú)立 實(shí)驗(yàn)；未顯示）。根據(jù)這些結(jié)果，看起來(lái)a -突觸核蛋白也通過(guò)lamp2a介導(dǎo)的CMA以外的 方法進(jìn)入溶酶體，或者組織蛋白酶D展現(xiàn)了和/或誘導(dǎo)了溶酶體外活性突觸核蛋白酶活性。
[0199] 實(shí)施例9 :組織蛋白酶F的表達(dá)降低a -突觸核蛋白蛋白質(zhì)水平
[0200] 在實(shí)施例6中描述的系統(tǒng)被用于檢查另一種溶酶體組織蛋白酶，S卩，組織蛋白酶 F，對(duì)共轉(zhuǎn)染的aS水平的影響。
[0201] MES23. 5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染了 0? g/10cm 皿的 a S 編碼 SCNA cDNA 質(zhì)粒、加 g/10cm 皿 的人類組織蛋白酶F編碼人類CTSF質(zhì)粒，其購(gòu)自O(shè)riGene Technologies, Inc.，處在CMV啟 動(dòng)子的控制下。在分離和maxiprep之后，組織蛋白酶F克隆被全序列證實(shí)。轉(zhuǎn)染后24小 時(shí)，細(xì)胞被裂解，通過(guò)夾心ELISA分析溶胞產(chǎn)物。
[0202] 轉(zhuǎn)染后二十四小時(shí)，共同表達(dá)的人類組織蛋白酶F蛋白質(zhì)降低了細(xì)胞內(nèi)a-突觸 核蛋白蛋白質(zhì)濃度，如通過(guò)夾心ELISA所測(cè)量的。當(dāng)比較a-突觸核蛋白穩(wěn)態(tài)水平方面的改 變與平行加載的重組a-突觸核蛋白蛋白質(zhì)的良好表征的水平時(shí)，估計(jì)的是，組織蛋白酶F 過(guò)量表達(dá)（5iig/10cm皿）產(chǎn)生了對(duì)照水平的51.7+/-14. 1%的細(xì)胞內(nèi)a-突觸核蛋白水平 (n = 3,來(lái)自2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)）。
[0203] 為了確認(rèn)組織蛋白酶F對(duì)降低a S的效果是特異性的，而不是由細(xì)胞完整性方面 一般性的降低所引起，對(duì)用組織蛋白酶F編碼CTSF cDNA共轉(zhuǎn)染（5iig/10cm皿）的MES-syn 細(xì)胞進(jìn)行LDH分析。使用0. 1% Trit〇n-X100的細(xì)胞的裂解充當(dāng)細(xì)胞毒性的陽(yáng)性對(duì)照，促進(jìn) 最大的細(xì)胞死亡。用組織蛋白酶F共轉(zhuǎn)染的MES-syn細(xì)胞展現(xiàn)了小于或等于對(duì)照載體轉(zhuǎn)染 的細(xì)胞的LDH信號(hào)（數(shù)據(jù)來(lái)自2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，未顯示）。
[0204] 實(shí)施例10 :提高的GBA活性防止小鼠模型中a -突觸核蛋白的積累
[0205] 其中野生型人類a-突觸核蛋白蛋白質(zhì)在腦部適中地過(guò)度產(chǎn)生的小鼠模型被用 作腦部細(xì)胞體中a-突觸核蛋白蛋白質(zhì)積累的模型。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的GBA活性水平通過(guò) 用isofagomine(IFG)或isofagomine樣物質(zhì)處理小鼠，或通過(guò)在小鼠中施用或過(guò)量表達(dá) GBA蛋白質(zhì)來(lái)提高，isofagomine是一種已經(jīng)顯示了在小鼠和人類中提高GBA活性的亞氨基 糖（Lieberman R等?，（2007)Nat Chem Biol.Feb ;3(2) :101_7.)。提高的 GBA 活性防止了 中樞和/或外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞中a-突觸核蛋白蛋白質(zhì)的年齡依賴性的積累。
[0206] 實(shí)施例11 :提高的GBA活性提供了帕金森病小鼠模型中的治療效果
[0207] 通過(guò)顯示在測(cè)試動(dòng)物的腦中a-突觸核蛋白聚集物的降低的積累，神經(jīng)元中提高 的GBA活性的治療效果在新的家族性帕金森氏病模型C3H-Tg (SNCA) 83Vle中確認(rèn)了。這種 小鼠模型表達(dá)處于小鼠朊病毒（prnp)蛋白質(zhì)啟動(dòng)子的控制下的突變的A53T人類a-突觸 核蛋白。prnp啟動(dòng)子已經(jīng)顯示了在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的大多數(shù)神經(jīng)元中實(shí)現(xiàn)高水平的基因表 達(dá)。到8月齡，純合的B6 ;C3H-Tg (SNCA) 83Vle小鼠開始發(fā)展進(jìn)行性的表型和年齡依賴性的 胞質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元包含物，類似于在患有突觸核蛋白病的患者中所見的那些。提高GBA活性防 止了腦部細(xì)胞體中突觸核蛋白的年齡依賴性積累，并且降低了疾病表型。
[0208] 實(shí)施例12 :提高的組織蛋白酶D活性防止小鼠模型中a-突觸核蛋白的積累
[0209] 其中野生型或突變體人類a-突觸核蛋白蛋白質(zhì)在腦部適中地過(guò)度產(chǎn)生的小鼠 模型可被用作人類腦部細(xì)胞體中突觸核蛋白蛋白質(zhì)積累的模型。組織蛋白酶D活性通 過(guò)全身地處理小鼠，或通過(guò)用組織蛋白酶D活性的小分子活化物或穩(wěn)定劑的腦部或腦功能 區(qū)定位地（stereotactically)輸注，或通過(guò)體內(nèi)施用或過(guò)量表達(dá)組織蛋白酶D蛋白質(zhì)或它 的前蛋白原來(lái)提高。提高的組織蛋白酶D活性防止了腦部細(xì)胞體中a-突觸核蛋白蛋白質(zhì) 的年齡依賴性積累。當(dāng)然，相同的測(cè)試可以使用其他組織蛋白酶多肽、前多肽和用編碼它們 的多核苷酸來(lái)進(jìn)行。
[0210] 實(shí)施例13 :提高的組織蛋白酶D活性提供了帕金森病小鼠模型中的治療效果
[0211] 通過(guò)顯示在測(cè)試動(dòng)物的腦中a-突觸核蛋白聚集物的降低的積累，神經(jīng)元中提高 的組織蛋白酶D活性的治療效果在新的家族性帕金森氏病模型C3H-Tg (SNCA) 83Vle中確認(rèn) 了。這種小鼠模型表達(dá)處于小鼠朊病毒（prnp)蛋白質(zhì)啟動(dòng)子的控制下的突變的A53T人類 a-突觸核蛋白。prnp啟動(dòng)子已經(jīng)顯示了在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的大多數(shù)神經(jīng)元中實(shí)現(xiàn)高水平的 基因表達(dá)。到8月齡，純合的B6 ;C3H-Tg (SNCA) 83Vle小鼠開始發(fā)展進(jìn)行性的表型和年齡依 賴性的胞質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元包含物，類似于在患有a突觸核蛋白病的患者中所見的那些。提高的 組織蛋白酶D活性防止了腦部細(xì)胞體中a -突觸核蛋白的年齡依賴性積累，并且降低了疾 病表型。當(dāng)然，這個(gè)模型可以用于按照類似方式測(cè)試其他組織蛋白酶。
[0212] 其他實(shí)施方式
[0213] 已經(jīng)描述了本發(fā)明的許多實(shí)施方式。盡管如此，要理解的是，可以進(jìn)行各種修改而 不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，其他實(shí)施方式在以下的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 以下的任何一種或更多種在制備用于治療患有突觸核蛋白病、而不患有臨床上診斷 的溶酶體貯積病的受試者的藥物中的用途： 酸性0 -葡糖腦苷脂酶（GBA)多肽， 編碼酸性￠-葡糖腦苷脂酶（GBA)多肽的多核苷酸， GBA多肽活化多肽， 編碼GBA多肽活化試劑的多核苷酸， 組織蛋白酶D多肽， 組織蛋白酶原D多肽，和 編碼組織蛋白酶D或組織蛋白酶原D多肽的多核苷酸， 其中所述治療包括以有效降低所述受試者的中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)、或這兩者中、或受 試者的溶酶體區(qū)室中a-突觸核蛋白的水平的量向受試者施用所述藥物。
2. 權(quán)利要求1的用途，其中所述突觸核蛋白病是原發(fā)的突觸核蛋白病。
3. 權(quán)利要求2的用途，其中所述突觸核蛋白病包括以下的任何一種或更多種：帕金森 氏?。≒D);散發(fā)的或可遺傳的Lewy體癡呆（DLB);伴有突觸核蛋白沉積的純自主神經(jīng)衰竭 (PAF);多系統(tǒng)萎縮癥（MSA);伴有腦部鐵積累的遺傳性神經(jīng)變性；和老年的偶發(fā)的Lewy體 疾病。
4. 權(quán)利要求1的用途，其中所述突觸核蛋白病是繼發(fā)性的突觸核蛋白病。
5. 權(quán)利要求4的用途，其中所述突觸核蛋白病包含以下的任何一種或更多種：Lewy體 變體的阿爾茨海默氏?。籇own's綜合征；進(jìn)行性核上麻痹；Lewy體特發(fā)性震顫；有或者沒 有癡呆的家族性帕金森氏綜合征；有或者沒有帕金森氏綜合征的tau基因和progranulin 基因關(guān)聯(lián)的癡呆；克-雅病；牛海綿狀腦病；繼發(fā)性的帕金森?。挥缮窠?jīng)毒素暴露引起的帕 金森氏綜合征；伴有a _突觸核蛋白沉積的藥物誘發(fā)的帕金森氏綜合征；散發(fā)的或可遺傳 的脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)；肌萎縮性側(cè)索硬化（ALS);和自發(fā)性的的快速眼動(dòng)睡眠行為失常。
6. 權(quán)利要求1的用途，其中所述GBA活化多肽包含皂化蛋白原多肽、皂化蛋白A多肽、 皂化蛋白B多肽、皂化蛋白C多肽和皂化蛋白D多肽的任何一種或更多種。
7. 權(quán)利要求6的用途，其中所述GBA活化多肽包含皂化蛋白C多肽。
8. 權(quán)利要求1的用途，其中編碼GBA活化多肽的多核苷酸包含編碼皂化蛋白原多肽、皂 化蛋白A多肽、皂化蛋白B多肽、皂化蛋白C多肽和皂化蛋白D多肽的任何一種或更多種的 多核苷酸。
9. 權(quán)利要求1的用途，進(jìn)一步包括施用一種或更多種提高a-突觸核蛋白復(fù)合物的自 體吞噬的試劑。
10. 權(quán)利要求9的用途，其中所述試劑包含mTOR抑制物。
11. 權(quán)利要求9的用途，其中所述試劑包含雷帕霉素或雷帕霉素類似物。 12?權(quán)利要求9的用途，其中所述試劑包含依維莫司、環(huán)孢菌素、FK506、hsc70、N-辛 基-4-epi-P -井R霉烯胺和甘油的一種或更多種。
13. 權(quán)利要求9的用途，其中所述試劑包含小分子、大分子、肽、抗體、核酸或其生物學(xué) 活性片段。
14. 以下任何一種或更多種在制備用于突觸核蛋白病治療的藥物的方法中的用途： 酸性0 -葡糖腦苷脂酶(GBA)多肽， 編碼酸性￠-葡糖腦苷脂酶（GBA)多肽的多核苷酸， GBA多肽活化多肽， 編碼GBA多肽活化試劑的多核苷酸， 組織蛋白酶D多肽， 組織蛋白酶原D多肽，和 編碼組織蛋白酶D或組織蛋白酶原D多肽的多核苷酸。
15.以下的任何一種或更多種在制備用于治療患有突觸核蛋白病、而不患有臨床上診 斷的溶酶體貯積病的受試者的藥物中的用途： 組織蛋白酶F多肽，和 編碼組織蛋白酶F多肽的多核苷酸， 其中所述治療包括以有效降低所述受試者的中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)、或這兩者中、或受 試者的溶酶體區(qū)室中a-突觸核蛋白的水平的量向受試者施用所述藥物。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK104383556SQ201410524803
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2008年5月16日 優(yōu)先權(quán)日:2007年5月16日
【發(fā)明者】M.施羅斯-馬赫, V.庫(kù)倫, L.施哈布丁, S.H.程 申請(qǐng)人:布里格姆婦女醫(yī)院