循環(huán)miR-210在高血壓早期診斷及靶器官損害預警中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及循環(huán)miR-210的表達水平在高血壓早期診斷及靶器官損害預警中的應用。本發(fā)明優(yōu)點在于：本發(fā)明結果表明：循環(huán)miR-210的表達隨著血壓的升高而升高，為高血壓的早期診斷提供全新的診斷依據(jù)；循環(huán)miR-210的表達水平不僅與血壓水平呈正相關性，并且與靶器官損害程度呈正相關性；檢測循環(huán)miR-210的表達水平不僅有助于高血壓的早期診斷、早期發(fā)現(xiàn)，更重要是對高血壓靶器官損害的預警作用，為高血壓的早期診斷及早期預測靶器官的損害提供全新的手段，可有效的指導臨床用藥，延緩靶器官的損害，改善患者的生活質量。
【專利說明】循環(huán)miR-210在高血壓早期診斷及靶器官損害預警中的應 用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及微小核苷酸的新用途，具體地說，是循環(huán)miR-210的表達水平在高血 壓早期診斷及靶器官損害預警中的應用。

【背景技術】
[0002] 高血壓（hypertens ion )是最常見的慢性復雜性疾病，指在未服用降壓藥物的情況 下，非同日3次測量，收縮壓> HOmmHg和/或舒張壓>90mmHg。收縮壓在12(Tl39mmHg之 間和/或舒張壓在8(T89mmHg之間為高血壓前期或正常高值。
[0003] 高血壓是心臟病、腦卒中、終末期腎病及外周血管病等最常見的危險因素之一。 我國高血壓防治指南（2010年修訂版）指出：每300萬心血管死亡中至少一半與高血壓有 關，高血壓患者腦卒中的發(fā)生率為正常血壓者的7倍以上，重度高血壓患者發(fā)生終末期腎 病的危險性為血壓正常者的11倍以上。且流行病學調查顯示：每年我國將新增高血壓患 者1000萬，每5個成年人中就有1個患有高血壓，最新流行病學調查顯示美國約每3個成 人中就有1個高血壓患者。高血壓前期是高血壓最重要的"隱患人群"。我國約59. 31%的 城市人口處于高血壓前期階段，約44. 15%的農(nóng)村人口為高血壓前期，且研究表明：血壓在 12(Tl29/8(T84mmHg和13(Tl39/85?90mmHg的中年人群，10年后轉變?yōu)楦哐獕旱膸茁史謩e 有45%和64%。流行病學研究顯示，與血壓正常人相比，高血壓前期發(fā)生中風的幾率增加了 1. 66倍，發(fā)生終末期腎病的幾率增加了 1. 59倍，心血管疾病的發(fā)生率增加了 2. 0倍。因此， 早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷可有效防治高血壓的發(fā)生發(fā)展，更重要的是對高血壓靶器官損害的預 警，可有效的指導臨床用藥，延緩靶器官的損害，改善患者的生活質量。
[0004] 微小核苷酸(microRNA，miRs)是具有高度保守性的非編碼單鏈RNA，長度約為 18~25個核苷酸。據(jù)預測，miRs通過與靶基因的結合調控著人類基因組中3(Γ50%的基因，參 與生命過程中一系列重要的進程，包括早期胚胎發(fā)育、細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡、組織 發(fā)育、調亡等生理、病理過程，并且通過調控一組基因參與調節(jié)機體多種疾病的發(fā)生發(fā)展， 如腫瘤、心血管疾病、衰老等。研究表明，在疾病發(fā)生的早期，miRs即產(chǎn)生了可逆性的變化， 通過對miRs的檢測，可早期預測疾病的發(fā)生發(fā)展，從而指導臨床診療。
[0005]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中的不足，提供一種miR-210在制備早期診斷高血 壓試劑中的應用。
[0007] 本發(fā)明的第二個目的是，提供一種miR-210在制備早期診斷高血壓的醫(yī)療器械中 的應用。
[0008] 本發(fā)明的第三個目的是，提供一種miR-210在制備預測靶器官早期損傷試劑中的 應用。
[0009] 本發(fā)明的第四個目的是，提供一種miR-210在制備預測靶器官早期損傷的醫(yī)療器 械中的應用。
[0010] 本發(fā)明的第五個目的是，提供一種miR-210作為藥物靶點在篩選降血壓和靶器官 保護的藥物中的應用。
[0011] 本發(fā)明的第六個目的是，提供一種miR-210拮抗劑或抑制劑在制備降血壓和靶器 官保護的藥物中的應用。
[0012] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案是：miR-210在制備早期診斷高血壓試 劑中的應用，所述的早期診斷高血壓試劑通過檢測循環(huán)中miR-210的表達水平對高血壓進 行早期診斷。
[0013] 為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術方案是:miR-210在制備早期診斷高 血壓的醫(yī)療器械中的應用，所述的早期診斷高血壓的醫(yī)療器械通過檢測循環(huán)中miR-210的 表達水平對高血壓進行早期診斷。
[0014] 為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術方案是:miR-210在制備預測靶器官 早期損傷試劑中的應用，所述的預測靶器官早期損傷試劑通過檢測循環(huán)中miR-210的表達 水平對靶器官的損害進行早期預測。
[0015] 為實現(xiàn)上述第四個目的，本發(fā)明采取的技術方案是:miR-210在制備預測靶器官 早期損傷的醫(yī)療器械中的應用，所述的預測靶器官早期損傷的醫(yī)療器械通過檢測循環(huán)中 miR-210的表達水平對靶器官的損害進行早期預測。
[0016] 所述的靶器官為心、腦、腎及外周血管。
[0017] 為實現(xiàn)上述第五個目的，本發(fā)明采取的技術方案是:miR-210作為藥物靶點在篩 選降血壓和靶器官保護的藥物中的應用。
[0018] 為實現(xiàn)上述第六個目的，本發(fā)明采取的技術方案是:miR-210拮抗劑或抑制劑在 制備降血壓和靶器官保護的藥物中的應用。
[0019] 本發(fā)明優(yōu)點在于： 1、 本發(fā)明收集血壓正常者、高血壓前期患者、高血壓患者血漿，對循環(huán)中miR-210的表 達水平進行研究，研究結果表明：循環(huán)miR-210的表達隨著血壓的升高而升高，為高血壓的 早期診斷提供全新的診斷依據(jù)； 2、 本發(fā)明采用自發(fā)性高血壓大鼠（SHR)作為高血壓模型，研究探討5周齡、12周齡、20 周齡SHR大鼠血壓變化趨勢及循環(huán)中miR-210的表達，并對12周齡、20周齡SHR大鼠心、 腦、腎靶器官的損害進行研究，研究結果表明：循環(huán)miR-210的表達水平不僅與血壓水平呈 正相關性，并且與靶器官損害程度呈正相關性； 3、 檢測循環(huán)miR-210的表達水平不僅有助于高血壓的早期診斷、早期發(fā)現(xiàn)，更重要是 對高血壓靶器官損害的預警作用，為高血壓的早期診斷及早期預測靶器官的損害提供全新 的手段，可有效的指導臨床用藥，延緩靶器官的損害，改善患者的生活質量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1.血壓正常者、高血壓前期患者、高血壓患者循環(huán)miR-210的表達情況，與血 壓正常者相比，*/?〈〇· 05。
[0021] 圖2.循環(huán)miR-210的表達水平，與正常人相比，*P〈0. 05。高血壓前期循環(huán) miR-210表達vs血壓正常者表達上調，具有統(tǒng)計學意義(/7〈0. 05)。
[0022] 圖3. SHR大鼠動態(tài)收縮壓、舒張壓變化趨勢，與正常對照組（WKY)相比，*/?〈0. 05 : 4周齡SHR大鼠作為高血壓動物模型，同周齡WKY為正常對照組。常規(guī)飲食，每周采用尾壓 法測量大鼠收縮壓、舒張壓。圖3顯示與正常對照組相比，模型組SHR大鼠收縮壓、舒張壓 雖周齡變化血壓持續(xù)升高。
[0023] 圖4.不同周齡SHR大鼠循環(huán)miR-210的表達情況，與正常對照組（WKY)相比， 切〈0. 05 :所有實驗動物分別于5周齡、12周齡、20周齡時眼眶取血，檢測循環(huán)miR-210的表 達水平。如圖4所示，與正常對照組相比，5周齡SHR大鼠循環(huán)miR-210的表達未見明顯差 異，12周齡時，SHR大鼠循環(huán)miR-210的表達顯示有上升趨勢，20周齡SHR大鼠循環(huán)miR-210 的表達顯著上調0X0. 05)。
[0024] 圖5. 12周齡WKY、SHR大鼠心肌組織、腎臟組織、腦組織HE染色結果。12周齡 SHR大鼠心肌組織、腎臟組織已存在病理損傷：12周齡時，正常對照組與模型組隨機選取10 只處死動物，解剖心臟、腎臟進行病理學觀察。主要采用石蠟切片，蘇木素-伊紅染色，顯微 鏡下觀察病理形態(tài)的變化。圖5顯示，與正常對照組心肌組織（a)相比，12周齡模型組SHR 大鼠心肌組織可見炎性細胞的浸潤，伴有小灶性壞死（b);與正常對照組腎臟組織（c)相比， 模型組SHR大鼠腎臟組織可見炎性細胞的浸潤（d);腦組織均未見明顯病理性變化（e、f)。
[0025] 圖6. 20周齡模型組SHR大鼠心肌組織存在顯著的病理損傷：20周齡時處死動 物，解剖心臟進行病理學觀察。主要采用石蠟切片，蘇木素-伊紅染色進行病理形態(tài)的觀察 及Masson三色染色觀察纖維化程度。如圖6所示：與正常對照組（a、c)相比，模型組SHR 大鼠心肌組織出現(xiàn)大量炎性細胞的浸潤，多發(fā)性灶性壞死，肌纖維間充血水腫（b)。Masson 三色染色結果顯示，模型組SHR大鼠心肌血管周圍纖維化程度較正常對照組顯著（d)。
[0026] 圖7. 20周齡模型組SHR大鼠腎臟組織存在顯著的病理損傷：20周齡時處死動 物，解剖腎臟進行病理學觀察。主要采用石蠟切片，蘇木素-伊紅染色進行病理形態(tài)的觀察 及Masson三色染色觀察纖維化程度。如圖7所示：與正常對照組相比（a、d)，模型組SHR大 鼠腎臟組織可見腎間質炎性細胞的浸潤（b)，腎盂粘膜上皮損傷脫落（c)。Masson三色染色 結果顯示，模型組SHR大鼠腎間質纖維化程度較正常對照組顯著（e)。
[0027] 圖8. 20周齡模型組SHR大鼠腦組織存在顯著的病理損傷：20周齡時處死動物， 解剖腦組織進行病理學觀察。主要采用石蠟切片，蘇木素-伊紅染色進行病理形態(tài)的觀察 及Masson三色染色觀察纖維化程度。如圖8所示：與正常對照組（a、d)相比，模型組SHR 大鼠腦組織可見顱內(nèi)出血（b)，腦膜血管擴張充血（c)。Masson三色結果未見明顯病理性變 化。

【具體實施方式】
[0028] 下面結合附圖對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0029] 實施例1 在本實施方案中，我們主要采用SYBG染料法RT-PCR的研究手段，探討并明確循環(huán) miR-210的表達與血壓呈正相關性。并且，在本實施方案中，我們采用4周齡SHR大鼠作為 高血壓動物模型，研究并明確SHR大鼠循環(huán)miR-210的表達與血壓水平呈正相關性，并且與 高血壓所致心、腦、腎靶器官損害程度呈正相關性。這一研究首次揭示循環(huán)miR-210的表達 水平不僅反應血壓水平，并且可以預測高血壓患者是否存在靶器官的損害。
[0030] 一、方法 1.臨床研究樣本收集 用于本發(fā)明的臨床樣本全部來自本院，并且所有研究對象都認真閱讀并簽署知情同 意書，符合倫理學標準。研究對象均為男性，年齡在30-60歲之間。在未使用降壓藥物 的情況下，非同日三次測量，收縮壓<120mmHg和舒張壓<90mmHg為正常血壓；收縮壓 > HOmmHg和/或舒張壓> 90mmHg為高血壓；收縮壓12CTl39mmHg和/或舒張壓在 8(T89mmHg為高血壓前期。所有研究對象既往無其他心血管疾病，嚴重的肝腎功能損害，糖 尿病，肝炎、結核等傳染性疾病。所有研究對象均于早8 :00-9:00,空腹，使用K2-EDTA抗凝 管靜脈采集2ml血液。3000轉/分，離心10分鐘，取上層血漿用于本研究。
[0031] 2.臨床樣本循環(huán)microRNA的提取 根據(jù)miRNeasyMini Kit (QIAGEN)并且根據(jù)生產(chǎn)廠商提供的標準操作流程進行血楽 樣品microRNA抽提，備用。
[0032] 3. SYBG染料法RT-PCR檢測臨床樣本循環(huán)miR-210的表達 根據(jù) miScript Reverse Transcription Kit (cat218061, QIAGEN)及其操作規(guī)范進 行反轉錄 20ul 反應體系，采用 SYBR Green PCR Master Mix (cat218073, QIAGEN)，根 據(jù)廠家規(guī)范流程操作，使用Roche LightCycler 480 II進行RT-PCR檢測：95°C，15min; 94°〇，158,40個循環(huán)；551：，3〇8;7〇1：，3〇8。
[0033] 4. SHR大鼠收縮壓、舒張壓動態(tài)變化情況：以4周齡清潔級SHR雄性大鼠為高血 壓模型組，平均體重109. 2±0. 8g，以同周齡清潔級WKY雄性大鼠為正常對照組，平均體重 109. 4±1.9g。實驗動物均購自北京維通利華有限公司。常規(guī)攝食及飲水飼養(yǎng)。每周使用 尾壓法測量大鼠血壓（BP-98A Series, Softron)。
[0034] 5. 5周齡、12周齡、20周齡SHR大鼠循環(huán)miR-210的表達情況：所有實驗動物分 別于第5周齡、12周齡、20周齡時眼眶取血，3000轉/分，離心30min，取上層血漿，使用 miRNeasy Mini Kit (QIAGEN)并且根據(jù)生產(chǎn)廠商提供的標準操作流程抽提血楽樣品中 microRNA，并根據(jù)miScript Reverse Transcription Kit (cat218061, QIAGEN)及其操作 規(guī)范進行反轉錄 20ul 反應體系，采用 SYBR Green PCR Master Mix (cat218073, QIAGEN) ，根據(jù)廠家規(guī)范流程操作，使用Roche LightCycler 480 II進行RT-PCR檢測：95°C，15min; 94°〇，158,40個循環(huán)；551：，3〇8;7〇1：，3〇8。
[0035] 6. 12周齡、20周齡SHR大鼠心臟、腎臟、腦組織病理變化情況：12周齡時，正常對 照組、模型組隨機選取10只，處死動物，取心、腦、腎，4%的多聚甲醛固定，包埋，石蠟切片， HE染色觀察其病理形態(tài)變化。20周齡時處死所有動物，取心、腦、腎，4%的多聚甲醛固定，包 埋，石蠟切片，HE染色觀察其病理形態(tài)變化及Masson三色染色評價纖維化程度。
[0036] 7.統(tǒng)計分析 計量資料以均數(shù)土標準差表示，符合正態(tài)分布和方差齊性采用單因素方差分析的單 向分類的方差分析（one-way-classification AN0VA)，兩兩比較使用t檢驗，如不符合正態(tài) 性和方差齊性則用M、min、max表示，組間比較用Kruslal-Wallis H檢驗。
[0037] 二、結果 1.血壓正常者、高血壓前期患者、高血壓患者臨床基本信息 如表1所示，血壓正常者、高血壓前期患者、高血壓患者平均年齡、BMI、谷丙轉氨酶、 肌酐、尿素、尿酸、空腹血糖、甘油三脂、膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白均未見明顯差 異，高血壓前期患者、高血壓患者收縮壓、舒張壓均顯著高于血壓正常者0X0.05)。
[0038] 表1.血壓正常者、高血壓前期患者、高血壓患者臨床基本信息

【權利要求】
1. miR-210在制備早期診斷高血壓試劑中的應用，所述的早期診斷高血壓試劑通過檢 測循環(huán)中miR-210的表達水平對高血壓進行早期診斷。 2. miR-210在制備早期診斷高血壓的醫(yī)療器械中的應用，所述的早期診斷高血壓的醫(yī) 療器械通過檢測循環(huán)中miR-210的表達水平對高血壓進行早期診斷。 3. miR-210在制備預測靶器官早期損傷試劑中的應用，所述的預測靶器官早期損傷試 劑通過檢測循環(huán)中miR-210的表達水平對靶器官的損害進行早期預測。 4. miR-210在制備預測靶器官早期損傷的醫(yī)療器械中的應用，所述的預測靶器官早期 損傷的醫(yī)療器械通過檢測循環(huán)中miR-210的表達水平對靶器官的損害進行早期預測。
5. 根據(jù)權利要求3-4任一所述的應用，其特征在于，所述的靶器官為心、腦、腎和外周 血管。 6. miR-210作為藥物靶點在篩選降血壓和靶器官保護的藥物中的應用。 7. miR-210拮抗劑或抑制劑在制備降血壓和靶器官保護的藥物中的應用。
【文檔編號】A61B5/021GK104306992SQ201410546163
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月16日 優(yōu)先權日:2013年11月26日
【發(fā)明者】張騰, 陳瑜, 楊琴波, 賈成林, 王培偉, 熊敏琪, 崔金剛, 李黎, 杜宵燁 申請人:上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院