循環(huán)miR-505在高血壓早期診斷及靶器官早期損傷預(yù)警作用中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及循環(huán)miR-505的表達(dá)水平在高血壓早期診斷及靶器官早期損傷預(yù)警作用中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明研究結(jié)果表明：循環(huán)miR-505的表達(dá)隨著血壓的升高而升高，為高血壓的早期診斷提供全新的診斷依據(jù)；miR-505抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及內(nèi)皮細(xì)胞的管狀形成；檢測循環(huán)miR-505的表達(dá)水平不僅有助于高血壓的早期診斷、早期發(fā)現(xiàn)，更重要是對高血壓靶器官早期損害的預(yù)警作用，為高血壓的早期診斷及早期預(yù)測靶器官的損害提供全新的手段，可有的指導(dǎo)臨床用藥，延緩靶器官的損害，改善患者的生活質(zhì)量。
【專利說明】循環(huán)miR-505在高血壓早期診斷及靶器官早期損傷預(yù)警作 用中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微小核苷酸的新用途，具體地說，是循環(huán)miR-505的表達(dá)水平在高血 壓早期診斷及靶器官早期損傷預(yù)警作用中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 高血壓（hypertension)是指在靜息狀態(tài)下，收縮壓和/或舒張壓增高 (> 140mmHg/90mmHg)，常伴有脂質(zhì)代謝紊亂及心、腦、腎和視網(wǎng)膜等靶器官功能或器質(zhì)性變 化。收縮壓在12(Tl39mmHg之間和/或舒張壓在8(T89mmHg之間為高血壓前期或正常高值。
[0003] 高血壓是最常見的心血管病，是全球范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問題。流行病學(xué)調(diào)查 顯示，我國18歲及以上居民高血壓患病率為18. 8%，估計(jì)全國患病人數(shù)超過1. 6億。并且血 壓的升高是多種疾病的導(dǎo)火索，增加了冠心病、心力衰竭及腎臟疾患等發(fā)病率。然而，部分 高血壓患者并無明顯的臨床癥狀，高血壓被稱為人類健康的"隱形殺手"。因此，對高血壓病 的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷，可有效防治高血壓的發(fā)生發(fā)展，更重要的是對高血壓靶器官損害的 早期預(yù)警，可有效的指導(dǎo)臨床用藥，延緩靶器官的損害，改善患者的生活質(zhì)量。
[0004] 微小核苷酸(microRNA，miRs)是具有高度保守性的非編碼單鏈RNA，長度約為 18?25個核苷酸。據(jù)預(yù)測，miRs通過與靶基因的結(jié)合調(diào)控著人類基因組中3(Γ50%的基因，參 與生命過程中一系列重要的進(jìn)程，包括早期胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、組織 發(fā)育、調(diào)亡等生理、病理過程，并且通過調(diào)控一組基因參與調(diào)節(jié)機(jī)體多種疾病的發(fā)生發(fā)展， 如腫瘤、心血管疾病、衰老等。研究表明，在疾病發(fā)生的早期，miRs即產(chǎn)生了可逆性的變化， 通過對miRs的檢測，可早期預(yù)測疾病的發(fā)生發(fā)展，從而指導(dǎo)臨床診療。
[0005] 血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管表面的一層單層細(xì)胞，直接接觸血液成分和組織，起著調(diào)節(jié) 血管的舒縮、防止血小板粘附和血栓形成、調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的生長和增殖、防止炎癥細(xì) 胞的浸潤及有害物質(zhì)的透入等作用。內(nèi)皮功能紊亂不僅是高血壓發(fā)病最早期的病理性損 害，還是預(yù)測諸如猝死、急性心肌梗死、不穩(wěn)定型心絞痛、卒中等心腦血管事件發(fā)生的"晴雨 表"。因此，早期預(yù)測內(nèi)皮細(xì)胞的功能，可有效的指導(dǎo)臨床用藥，防治內(nèi)皮功能紊亂，有效的 防治高血壓的發(fā)生發(fā)展及靶器官的損害。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種miR-505在制備早期診斷高血 壓試劑中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的第二個目的是，提供一種miR-505在制備早期診斷高血壓的醫(yī)療器械中 的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的第三個目的是，提供一種miR-505在制備預(yù)測靶器官早期損傷試劑中的 應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的第四個目的是，提供一種miR-505在制備預(yù)測靶器官早期損傷的醫(yī)療器 械中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的第五個目的是，提供一種miR-505作為藥物靶點(diǎn)在篩選降血壓和靶器官 保護(hù)的藥物中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的第六個目的是，提供一種miR-505拮抗劑或抑制劑在制備降血壓和靶器 官保護(hù)的藥物中的應(yīng)用。
[0012] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：miR-505在制備早期診斷高血壓試 劑中的應(yīng)用，所述的早期診斷高血壓試劑通過檢測循環(huán)中miR-505的表達(dá)水平對高血壓進(jìn) 行早期診斷。
[0013] 為實(shí)現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:miR-505在制備早期診斷高 血壓的醫(yī)療器械中的應(yīng)用，所述的早期診斷高血壓的醫(yī)療器械通過檢測循環(huán)中miR-505的 表達(dá)水平對高血壓進(jìn)行早期診斷。
[0014] 為實(shí)現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:miR-505在制備預(yù)測靶器官 早期損傷試劑中的應(yīng)用，所述的預(yù)測靶器官早期損傷試劑通過檢測循環(huán)中miR-505的表達(dá) 水平對靶器官的損害進(jìn)行早期預(yù)測。
[0015] 為實(shí)現(xiàn)上述第四個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：miR-505在制備預(yù)測靶器官 早期損傷的醫(yī)療器械中的應(yīng)用，所述的預(yù)測靶器官早期損傷的醫(yī)療器械通過檢測循環(huán)中 miR-505的表達(dá)水平對靶器官的損害進(jìn)行早期預(yù)測。
[0016] 所述的靶器官為心、腦、腎、外周血管。
[0017]為實(shí)現(xiàn)上述第五個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:miR-505作為藥物靶點(diǎn)在篩 選降血壓和靶器官保護(hù)的藥物中的應(yīng)用。
[0018] 為實(shí)現(xiàn)上述第六個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:miR-505拮抗劑或抑制劑在 制備降血壓和靶器官保護(hù)的藥物中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于： 1、 本發(fā)明收集血壓正常者、高血壓前期患者、高血壓患者血漿，對循環(huán)中miR-505的表 達(dá)水平進(jìn)行研究，研究結(jié)果表明：循環(huán)miR-505的表達(dá)隨著血壓的升高而升高，為高血壓的 早期診斷提供全新的診斷依據(jù)； 2、 本發(fā)明采用不同內(nèi)皮細(xì)胞研究miR-505對內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響作用，研究結(jié)果表 明：miR-505抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及內(nèi)皮細(xì)胞的管狀形成； 3、 檢測循環(huán)miR-505的表達(dá)水平不僅有助于高血壓的早期診斷、早期發(fā)現(xiàn)，更重要是 對高血壓靶器官早期損害的預(yù)警作用，為高血壓的早期診斷及早期預(yù)測靶器官的損害提供 全新的手段，可有的指導(dǎo)臨床用藥，延緩靶器官的損害，改善患者的生活質(zhì)量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖 L 循環(huán) miR-505 的表達(dá)水平（與 Healthy Control 相比，*/?〈0· 05)。SYBG 染料 法RT-PCR檢測血壓正常者、高血壓前期患者、高血壓患者循環(huán)miR-505的表達(dá)情況：圖1結(jié) 果顯示，高血壓前期患者、高血壓患者循環(huán)miR-505的表達(dá)均顯著上調(diào)〇?〈0. 05)。
[0021] 圖2.循環(huán)miR-505的表達(dá)水平（與Healthy Control相比，*/?〈0· 05)。探針法 RT-PCR檢測血壓正常者、高血壓患者循環(huán)miR-505表達(dá)情況：圖2結(jié)果顯示，高血壓患者循 環(huán)miR-505的表達(dá)顯著上調(diào)〇?〈0. 05)。
[0022] 圖3. miR-505對不同內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用的影響（與正常組相比，切〈0.05)。 miR-505抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖：采用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基分別培養(yǎng)視網(wǎng)膜內(nèi) 皮細(xì)胞（HRECs)、人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HBMECs)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs)，以3000個 /孔接種于96孔板中，分別轉(zhuǎn)染20nM miR-505 mimic和inhibitor (RNAiMax轉(zhuǎn)染試劑） 48h后，進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。圖3結(jié)果顯示，miR-505 mimic顯著抑制視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的增殖 (/?〈0· 05)。
[0023] 圖4. miR-505對不同內(nèi)皮細(xì)胞遷移作用的影響(放大倍數(shù)：100X，與Control組 相比，切〈〇. 05)。miR-505抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移：用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基分別 HRECs、HBMECs、HUVECs，以 3000 個 / 孔接種于 96 孔板中，分別轉(zhuǎn)染 20nM miR-505 mimic 和inhibitor (RNAiMax轉(zhuǎn)染試劑）48h后，分別進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。圖4A、B結(jié)果顯示， miR-505 mimic 顯著抑制 HRECs、HBMECs、HUVECs 的遷移(/?〈0· 05)。
[0024] 圖5. miR-505對不同內(nèi)皮細(xì)胞tube formation的影響作用（放大倍數(shù)：40X , 與Control組相比，*/?〈0. 05)。miR-505抑制內(nèi)皮細(xì)胞管狀形成：用含有10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基分別HRECs、HUVECs、HBMECs，以3000個/孔接種于96孔板中，分別轉(zhuǎn)染20nM miR-505 mimic (RNAiMax轉(zhuǎn)染試劑）48h后，分別進(jìn)行小管形成實(shí)驗(yàn)。圖5A、B結(jié)果顯示， miR-505 mimic 顯著抑制 HRECs、HUVECs、HBMECs 的管狀形成 〇?〈0· 05)。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0026] 實(shí)施例1 在本實(shí)施方案中，我們分別采用SYBG染料法、探針法RT-PCR的研究手段，探討并明確 循環(huán)miR-505的表達(dá)與血壓呈正相關(guān)性。并且，在本實(shí)施方案中，我們采用視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞 (HRECs)、人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HBMECs)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs)研究并明確miR-505 的過表達(dá)顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及管狀形成，這一研究首次揭示循環(huán)miR-505的 表達(dá)水平不僅反應(yīng)血壓水平，并且可以預(yù)知內(nèi)皮細(xì)胞的功能，為高血壓早期靶器官損害起 到預(yù)警作用。
[0027] -、方法 1.臨床研究樣本收集 用于本發(fā)明的臨床樣本全部來自本院，并且所有研究對象都認(rèn)真閱讀并簽署知情同 意書，符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。研究對象均為男性，年齡在30-60歲之間。在未使用降壓藥物 的情況下，非同日三次測量，收縮壓<120mmHg和舒張壓<90mmHg為正常血壓；收縮壓 > HOmmHg和/或舒張壓>90mmHg為高血壓；收縮壓12CTl39mmHg和/或舒張壓在 8(T89mmHg為高血壓前期。所有研究對象既往無其他心血管疾病，嚴(yán)重的肝腎功能損害，糖 尿病，肝炎、結(jié)核等傳染性疾病。所有研究對象均于早8 :00-9:00,空腹，使用K2-EDTA抗凝 管靜脈采集2ml血液。3000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，取上層血漿用于本研究。
[0028] 2.臨床樣本循環(huán)microRNA的提取 根據(jù)miRNeasyMini Kit (QIAGEN)并且根據(jù)生產(chǎn)廠商提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行血楽 樣品microRNA抽提，備用。
[0029] 3. RT-PCR檢測臨床樣本循環(huán)miR-505的表達(dá) 根據(jù) miScript Reverse Transcription Kit (cat218061, QIAGEN)及其操作規(guī)范進(jìn) 行反轉(zhuǎn)錄2〇111反應(yīng)體系，分別采用5￥81?6代611?0?1&18丨61]\^1(。3丨218073，〇^^^吣、 探針（Life technology),根據(jù)廠家規(guī)范流程操作，使用Roche LightCycler 480 II進(jìn)行 町-卩〇?檢測：951：，1511^11;941：，158,40個循環(huán) ；551：，308;701：，30 8。
[0030] 4. miR-505顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖：含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基分別培 養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞（HRECs)、人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HBMECs)， 以3000個/孔接種于96孔板中，分別轉(zhuǎn)染20nM miR-505 mimic和inhibitor (RNAiMax 轉(zhuǎn)染試劑)，于37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，行MTT實(shí)驗(yàn)，490nm波長下檢測其吸光值。如 圖 3 結(jié)果顯不，與轉(zhuǎn)染 Negative control 相比，轉(zhuǎn)染 miR-505 mimic 后，對 HUVECs、HBMECs 的增殖未見明顯的抑制作用，但顯著抑制HRECs的增殖（P〈0. 05)，轉(zhuǎn)染miR-505 Inhibitor 后，細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)染Negative control相比，細(xì)胞增殖均未見明顯差異。
[0031] 5. miR-505顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移：含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基分別培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞（HRECs)、人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HBMECs)，以 3000個/孔接種于96孔板中，分別轉(zhuǎn)染20nM miR-505 mimic和inhibitor(RNAiMax轉(zhuǎn)染 試劑)48h后，采用含1%FBS的DMEM制備含有2 X IO5細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液，加入Transwel 1小 室中，下室為20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，4%的多聚甲醇固定， 并進(jìn)行0. 1%結(jié)晶紫染色，觀察細(xì)胞遷移情況。如圖4A、B結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-505 inhibitor 后，對內(nèi)皮細(xì)胞遷移未見明顯差異，但在轉(zhuǎn)染miR-505 mimic后，顯著抑制HUVECs、HRECs、 HBMECs 的遷移(/?〈0· 05)。
[0032] 6. miR-505顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞的管狀形成：采用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基 分別HRECs、HUVECs、HBMECs，以3000個/孔接種于96孔板中，分別轉(zhuǎn)染20nM miR-505 mimic (RNAiMax轉(zhuǎn)染試劑)48h后，制備Matrigel聚合凝膠，轉(zhuǎn)染2 X 104/ml內(nèi)皮細(xì)胞，37°C 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析內(nèi)皮細(xì)胞的管狀形成。如 圖5A、B所示，轉(zhuǎn)染miR-505 mimic后顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞的管狀形成〇7〈0. 05)。
[0033] 4.統(tǒng)計(jì)分析 計(jì)量資料以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，符合正態(tài)分布和方差齊性采用單因素方差分析的單 向分類的方差分析（one-way-classification AN0VA)，兩兩比較使用t檢驗(yàn)，如不符合正態(tài) 性和方差齊性則用M、min、max表示，組間比較用Kruslal-Wallis H檢驗(yàn)。
[0034] 二、結(jié)果 I. SYBG染料法RT-PCR檢測樣本臨床基本信息 如表1所示，血壓正常者、高血壓前期患者、高血壓患者平均年齡、BMI、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、 肌酐、尿素、尿酸、空腹血糖、甘油三脂、膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白均未見明顯差 異，高血壓前期患者、高血壓患者收縮壓、舒張壓均顯著高于血壓正常者0X0.05)。
[0035] 表I. SYBG染料法RT-PCR檢測樣本臨床基本信息

【權(quán)利要求】
1. miR-505在制備早期診斷高血壓試劑中的應(yīng)用，所述的早期診斷高血壓試劑通過檢 測循環(huán)中miR-505的表達(dá)水平對高血壓進(jìn)行早期診斷。 2. miR-505在制備早期診斷高血壓的醫(yī)療器械中的應(yīng)用，所述的早期診斷高血壓的醫(yī) 療器械通過檢測循環(huán)中miR-505的表達(dá)水平對高血壓進(jìn)行早期診斷。 3. miR-505在制備預(yù)測靶器官早期損傷試劑中的應(yīng)用，所述的預(yù)測靶器官早期損傷試 劑通過檢測循環(huán)中miR-505的表達(dá)水平對靶器官的損害進(jìn)行早期預(yù)測。 4. miR-505在制備預(yù)測靶器官早期損傷的醫(yī)療器械中的應(yīng)用，所述的預(yù)測靶器官早期 損傷的醫(yī)療器械通過檢測循環(huán)中miR-505的表達(dá)水平對靶器官的損害進(jìn)行早期預(yù)測。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3-4任一所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的靶器官為心、腦、腎、外周血 管。 6. miR-505作為藥物靶點(diǎn)在篩選降血壓和靶器官保護(hù)的藥物中的應(yīng)用。 7. miR-505拮抗劑或抑制劑在制備降血壓和靶器官保護(hù)的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K49/00GK104306993SQ201410546228
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月26日
【發(fā)明者】張騰, 陳瑜, 楊琴波, 賈成林, 王培偉, 熊敏琪, 崔金剛, 李黎 申請人:上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院