鰱魚dpp-iv抑制多肽及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種鰱魚DPP-Ⅳ抑制多肽及其應(yīng)用，所述鰱魚抑制多肽為淡水魚鰱魚魚肉蛋白經(jīng)蛋白酶精細(xì)水解所得的天然產(chǎn)物，即鰱魚蛋白酶解功能多肽。鰱魚蛋白經(jīng)胃蛋白酶、胰酶和中性蛋白酶三段式酶解后制備得到的DPP-Ⅳ抑制多肽不僅具有良好的DPP-Ⅳ抑制活性，抑制率高達(dá)51.59％(多肽濃度5mg/mL)，并且擁有良好的耐受胃腸消化穩(wěn)定性。所述DPP-Ⅳ抑制多肽具有天然，安全，高效，成本低特點(diǎn)，是非常有前景的針對(duì)糖尿病預(yù)防或治療的食品功能基料，可用于制備預(yù)防或輔助治療受益于DPP-IV抑制的疾病的藥物或功能食品。
【專利說明】鰱魚DPP-IV抑制多肽及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，涉及一種具有DPP- IV抑制活性的淡水魚鰱 魚多肽及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿?。╠iabetes mellitus，DM)是目前世界范圍內(nèi)增長(zhǎng)速度最快和發(fā)病率最為 廣泛的疾病之一，已經(jīng)成為僅次于腫瘤和心血管疾病的"第三號(hào)殺手〃。糖尿病作為由多種 遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的一組慢性代謝異常綜合癥，是由于胰島素相對(duì)或絕對(duì)缺 乏，以及周圍靶組織不同程度對(duì)胰島素抵抗引起的碳水化合物、蛋白質(zhì)，脂肪代謝紊亂引發(fā) 的，它可導(dǎo)致失明、心腦血管疾病、腎功能衰竭、神經(jīng)病變、肢體壞疽以致截肢、昏迷等多種 并發(fā)癥的發(fā)生,嚴(yán)重危害人類健康。其中2型糖尿病（T2DM)占患者總數(shù)的90-95%。
[0003] 目前II型糖尿病的治療以小分子口服藥為主，磺脲類、格列奈類、雙胍類、噻唑烷 二酮類和α-糖苷酶抑制劑是常用的II型糖尿病治療藥物，但隨著時(shí)間的推移它們的療效 逐漸降低，并且存在著較多的不良反應(yīng)。目前，基于腸促胰素的治療包括胰升血糖素樣肽 1(GLP-1，glucagon-like ρ印tide-Ι)類似物及二肽基肽酶IV(DPP-IV)抑制劑成為糖尿病 新藥研究的熱點(diǎn)。而相對(duì)于GLP-I類似物，DPP-IV抑制劑具有可口服使用，更少的胃腸道 不良反應(yīng)及更好的耐受性，及其它可能的更多益處。
[0004] 自從2006年8月默克公司研制的DPP- IV抑制劑西他列汀在墨西哥上市后，國(guó)外 越來越多的人致力于化學(xué)合成的DPP-IV抑制劑，目前有很多已進(jìn)入待批和ΙΙ、ΠΙ期臨床階 段。這些化學(xué)合成藥物雖然在臨床前和臨床實(shí)驗(yàn)中并未表現(xiàn)出嚴(yán)重的副作用，只是出現(xiàn)一 些諸如惡心、瘙癢和鼻咽炎等的不良反應(yīng)，但因?yàn)镈PP-IV本身也擔(dān)負(fù)著許多生理學(xué)功能， 比如和⑶45 -起發(fā)揮共刺激作用可促進(jìn)T細(xì)胞激活、增殖，也可以使一些趨化因子、神經(jīng)肽 和小肽類激素失活等，長(zhǎng)期服用是否會(huì)產(chǎn)生副作用的爭(zhēng)議一直都存在。因此，如果能從天然 藥物或天然食物中獲得具有DPP-IV抑制活性的功能物質(zhì)，將對(duì)人類健康產(chǎn)生重大的影響。
[0005] 近兩年來從食物來源中尋找具有DPP- IV抑制活性的小分子活性肽已成為研究熱 點(diǎn)。DPP- IV抑制活性肽指的是一類具有抑制DPP- IV活性的、相對(duì)分子量較小的多肽物質(zhì)， 這些多肽的氨基酸序列和肽鏈長(zhǎng)度各不相同，但都具有類似的功能。目前發(fā)現(xiàn)從食物蛋白 經(jīng)酶解或發(fā)酵產(chǎn)生的DPP- IV活性肽，一般鏈長(zhǎng)含2-14個(gè)氨基酸殘基。分子量低于lOOODa， 并且認(rèn)為，肽N末端氨基酸為Pro, Phe，Tyr或序列中含有疏水氨基酸的肽段具有較高的 DPP- IV抑制活性。
[0006] 在我國(guó)，鰱魚屬大宗淡水養(yǎng)殖魚類，因其肉薄、刺多，泥土味與魚腥味不易去除，使 得銷售價(jià)格很低。作為一種高產(chǎn)、低值的淡水魚，具有較高的開發(fā)價(jià)值。另外，目前以鰱魚 為原料加工的產(chǎn)品主要以初級(jí)加工產(chǎn)品為主，主要包括魚糜、軟罐頭、風(fēng)味魚干、肉腸、魚糕 等，存在加工產(chǎn)品品種少，規(guī)模小，附加值低等問題。近些年來國(guó)內(nèi)外已有一些采用酶解的 方法對(duì)魚蛋白進(jìn)行深加工利用的研究報(bào)道。魚蛋白被酶解后為肽段及氨基酸，具有相比全 蛋白更高的生物活性，利用蛋白酶解制備魚生物活性肽，是提高其附加值的有效途徑之一。
[0007] 因此，通過對(duì)鰱魚發(fā)展精深加工，實(shí)現(xiàn)鰱魚加工增值，使淡水魚加工向加工多樣化 和高附加值方向發(fā)展，成為鰱魚加工利用的一個(gè)重要研究方向，為促進(jìn)淡水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展 具有積極的作用。
[0008] 目前關(guān)于采用蛋白酶酶解食源性蛋白制備活性肽的研究很多，以鰱魚為原料開發(fā) 功能肽的研究也有所報(bào)道，如：尤娟等在"酶法制備鰱魚蛋白抗氧化肽研究"（見《漁業(yè)現(xiàn)代 化》，2010年第37卷第3期，42-47)提供了 5種蛋白酶水解鰱魚魚肉蛋白制備抗氧化肽的 研究結(jié)果。
[0009] 但目前以鰱魚為原料經(jīng)酶解反應(yīng)制備DPP-IV抑制活性肽未見相關(guān)研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供具有耐胃腸消化能力的淡 水魚鰱魚DPP- IV抑制活性多肽及其應(yīng)用。
[0011] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供了具有DPP-IV抑制活性且耐胃腸消化的 鰱魚多肽。
[0012] 本發(fā)明提供的一種具有DPP- IV抑制活性的鰱魚多肽，其由以下方法制備：鰱魚魚 肉蛋白經(jīng)胃蛋白酶、胰酶、中性蛋白酶三段式酶解后制得的酶解物，經(jīng)脫鹽，即得。
[0013] 所述鰱魚魚肉蛋白由以下方法制備：以鰱魚為原料，經(jīng)去鱗、去內(nèi)臟，洗凈，選取鰱 魚背部白肉，切成小塊后用攪碎機(jī)攪成肉糜，再經(jīng)滅除魚肉內(nèi)源性蛋白酶得到的。
[0014] 優(yōu)選地，所述鰱魚魚肉蛋白由以下方法制備：將鰱魚殺死后，去鱗、去內(nèi)臟，洗凈后 進(jìn)行采肉，選取鰱魚背部白肉，切成小塊后用攪碎機(jī)攪成肉糜，然后鰱魚肉糜與去離子水混 合，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度為5%，將調(diào)整好蛋白質(zhì)濃度的魚肉渾濁液在95°C水浴鍋內(nèi)放置IOmin 滅酶，冷卻后進(jìn)行均質(zhì)處理，即得鰱魚魚肉蛋白。
[0015] 所述經(jīng)胃蛋白酶、胰酶和中性蛋白酶三段式酶解具體包括以下步驟：
[0016] 1)第一步酶解反應(yīng)，胃蛋白酶：PH2.0、底物濃度5.0%、溫度37°C、酶與底物比 1 %、水解時(shí)間為Ih ;
[0017] 2)第二步酶解反應(yīng)：將胃蛋白酶酶解物用下面的方法繼續(xù)酶解胰酶：pH7. 5、溫度 37°C、酶與底物比2%、水解時(shí)間為2h ;
[0018] 3)第三步酶解反應(yīng)：將胰酶酶解物用下面的方法繼續(xù)酶解：中性蛋白酶：pH7. 5、 溫度45 °C、酶與底物比3 %、水解時(shí)間為6h。
[0019] 4)滅活除雜：將中性蛋白酶酶解后的水解液經(jīng)沸水浴IOmin滅活中最終水解液中 的蛋白酶后，迅速冷卻，酶解物離心，取上清。
[0020] 上述方法中：
[0021] 所述pH調(diào)節(jié)劑為鹽酸、氫氧化鈉或碳酸氫鈉；
[0022] 所述脫鹽是指將三段式酶解得到的上清液以一定流速通過陽離子交換樹脂進(jìn)行 脫鹽，濃縮獲得多肽液、或進(jìn)一步冷凍或噴霧干燥后得到多肽粉。
[0023] 本發(fā)明還提供了一種制備上述淡水魚鰱魚多肽的方法，該方法包括以下步驟：
[0024] 1)將鰱魚殺死后，去鱗、去內(nèi)臟，洗凈后進(jìn)行采肉，選取鰱魚背部白肉，切成小塊后 用攪碎機(jī)攪成肉糜，然后鰱魚肉糜與去離子水混合，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度為5%，將調(diào)整好蛋白 質(zhì)濃度的魚肉渾池液在95°C水浴鍋內(nèi)放置IOmin滅酶,冷卻后進(jìn)行均質(zhì)處理，即得鰱魚魚 肉蛋白。
[0025] 2)第一步酶解反應(yīng)，胃蛋白酶：pH2.0、底物濃度5.0%、溫度37°C、酶與底物比 1 %、水解時(shí)間為Ih ;
[0026] 3)第二步酶解反應(yīng)：將胃蛋白酶酶解物用下面的方法繼續(xù)酶解胰酶：pH7. 5、溫度 37°C、酶與底物比2%、水解時(shí)間為2h ;
[0027] 4)第三步酶解反應(yīng)：將胰酶酶解物用下面的方法繼續(xù)酶解：中性蛋白酶：pH7. 5、 溫度45 °C、酶與底物比3 %、水解時(shí)間為6h。
[0028] 5)滅活除雜：將中性蛋白酶酶解后的水解液經(jīng)沸水浴IOmin滅活中最終水解液中 的蛋白酶后，迅速冷卻，酶解物離心，取上清；
[0029] 6)脫鹽：指將三段式酶解得到的上清液通過離子交換樹脂進(jìn)行脫鹽，以l_2BV/h 流速通過離子交換樹脂，收集流出液，濃縮，即得。
[0030] 上述方法中：
[0031] 所述步驟5)中離心的速度和時(shí)間為1500-2500Xg，10-20min，優(yōu)選為1800Xg， 20min〇
[0032] 本發(fā)明還提供了含上述淡水魚鰱魚多肽的制劑，所述制劑中鰱魚多肽占總重量的 1-90%。本發(fā)明還提供了淡水魚鰱魚多肽在制備預(yù)防和治療2型糖尿病或者慢性代謝綜合 紊亂癥的藥物或保健品中的應(yīng)用，所述慢性代謝綜合紊亂癥有肥胖、免疫低下、心腦血管等 病癥。
[0033] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0034] 1、本發(fā)明提供的是以淡水魚鰱魚經(jīng)三段式酶解方法制備的具有DPP-IV抑制活性 的多肽。對(duì)于功能多肽產(chǎn)品制備來說，原料蛋白種類、酶解方式、酶解條件和制備目標(biāo)決定 著最終產(chǎn)品中的肽段組成，本發(fā)明所述制備得到的鰱魚DPP-IV抑制活性多肽，與以往公開 的所有類似產(chǎn)物都有所不同。
[0035] 2、本發(fā)明提供的鰱魚多肽，是鰱魚魚肉蛋白經(jīng)胃蛋白酶+胰酶+中性蛋白酶三 段式酶解后的水解物，具有良好的DPP- IV抑制活性，其抑制率可達(dá)到51. 59 % (多肽濃度 5mg/mL)〇
[0036] 相比其它已公開的海水魚而言，本發(fā)明提供的淡水魚鰱魚魚肉蛋白經(jīng)蛋白酶酶解 后制得的多肽物，具有更高的DPP-IV抑制活性。且由于本發(fā)明是采用三段式蛋白酶酶解程 序，前兩步分別使用的胃腸消化酶胃蛋白酶和胰酶，所以最終得到的多肽產(chǎn)品可以耐受人 體胃腸道蛋白酶的降解，從而順利達(dá)到腸道更加有利人體利用。
[0037] 3、本發(fā)明提供的鰱魚多肽，可直接加工成藥劑形式、或者制成膳食補(bǔ)充劑，直接面 對(duì)糖尿病患者等特定消費(fèi)群體，另外也可作為保健食品的功能成分，針對(duì)食品加工企業(yè)這 個(gè)市場(chǎng)領(lǐng)域，用于加工成具有抗糖尿病保健作用的食品，尤其適合加入到水產(chǎn)加工制品中， 以魚肉蛋白制備的DPP-IV抑制多肽加入到水產(chǎn)品中再進(jìn)一步加工成各種產(chǎn)品，無論從營(yíng) 養(yǎng)特性還是消費(fèi)心理方面，都更容易為消費(fèi)者和市場(chǎng)所接受。國(guó)內(nèi)外還沒有與此相同的產(chǎn) 品。
[0038] 本發(fā)明所述的鰱魚DPP- IV抑制多肽，是從天然食物中獲得具有DPP-IV抑制活性 的功能物質(zhì)，以我國(guó)大宗淡水魚鰱魚為原料開發(fā)此類產(chǎn)品，相比現(xiàn)有技術(shù)具有安全、高效、 成本低等特點(diǎn)。同時(shí)也加大了對(duì)鰱魚資源的開發(fā)力度，提高了鰱魚產(chǎn)品附加值，有助于我國(guó) 淡水魚產(chǎn)業(yè)的健康方向發(fā)展。

【具體實(shí)施方式】
[0039] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0040] 胃蛋白酶、胰酶和中性蛋白酶的來源，其中：胃蛋白酶的生物來源為豬胃；胰酶的 生物來源為牛胰腺，購(gòu)自Sigma;中性蛋白酶的來源Bacillus amyloliquefaciens，購(gòu)自山 東得利。
[0041] 實(shí)施例1:鰱魚魚肉蛋白溶液的制備
[0042] 將鰱魚殺死后,去鱗、去內(nèi)臟,洗凈后進(jìn)行采肉,選取鰱魚背部白肉，切成小塊后用 攪碎機(jī)攪成肉糜；然后鰱魚肉糜與去離子水混合，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度為5%，將調(diào)整好蛋白質(zhì) 濃度的魚肉渾濁液在95°C水浴鍋內(nèi)放置IOmin滅酶，以滅除魚肉中的內(nèi)源性蛋白酶；冷卻 后進(jìn)行均質(zhì)處理，即得鰱魚魚肉蛋白溶液，冷凍干燥備用或直接進(jìn)行下步酶解反應(yīng)。
[0043] 實(shí)施例2 :淡水魚鰱魚多肽的制備
[0044] 第一步酶解反應(yīng)：稱取一定量魚肉蛋白粉，溶于蒸餾水中（5%，W/w)。將溶液置于 37°C的恒溫水浴內(nèi)，當(dāng)溶液溫度升至37°C時(shí)，用lmol/L HCl將其pH值調(diào)至2.0,向溶液中 添加胃蛋白酶啟動(dòng)第一步酶解反應(yīng)，酶和底物的重量比即E: S為1 %，37°C水解Ih后，得到 胃蛋白酶的酶解物；
[0045] 第二步酶解反應(yīng)：用0. 9mol/L NaHCO3調(diào)節(jié)胃蛋白酶的酶解物的pH值至5. 3,隨后 用lmol/L NaOH調(diào)節(jié)其pH值至7. 5,然后加入胰酶，酶和底物的重量比即E: S為2%，啟動(dòng) 第二步酶解反應(yīng)，37°C反應(yīng)2h后，得到胰酶的酶解物；
[0046] 第三步酶解反應(yīng)：將胰酶的酶解物升至45°C，加入中性蛋白酶，酶和底物的重量 比即E:S為3%，啟動(dòng)第三步酶解反應(yīng)，并在45°C下維持6h，得到中性蛋白酶的酶解物；上 述三步酶解反應(yīng)進(jìn)程中保持?jǐn)嚢?，并不斷的添?IM NaOH或IM HCl維持各自反應(yīng)體系pH 值，使其處于最佳酶解狀態(tài)。
[0047] 滅活：三段式酶解反應(yīng)結(jié)束后，水解液經(jīng)沸水浴IOmin滅酶，迅速冷卻，酶解物離 心（1800父8,2〇1^11)，取上清，濾過液以28￥/11的流速過陽離子交換樹脂脫鹽，收集流出液， 濃縮、得到鰱魚DPP-IV多肽液，或進(jìn)一步冷凍或噴霧干燥后得到多肽粉。
[0048] 實(shí)驗(yàn)例3 :酶解反應(yīng)條件的優(yōu)選
[0049] 采用實(shí)施例2的方法，對(duì)酶解反應(yīng)的酶解物及反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)選，并檢測(cè)其最終 產(chǎn)物中DPP- IV抑制活性，其結(jié)果見表1 :
[0050] 表1 :酶解反應(yīng)條件及酶解過程中的水解度和DPP- IV抑制活性
[0051]

【權(quán)利要求】
1. 一種具有DPP- IV抑制活性的淡水魚鰱魚多肽，其特征在于，其由以下方法制備：鰱 魚魚肉蛋白經(jīng)胃蛋白酶、胰酶和中性蛋白酶三段式酶解后制得的酶解物，經(jīng)脫鹽，即得。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的淡水魚鰱魚多肽，其特征在于，所述經(jīng)胃蛋白酶、胰酶和中性 蛋白酶三段式酶解包括以下步驟： 1) 第一步酶解反應(yīng)，胃蛋白酶：PH2. 0、底物濃度5. 0%、溫度37°C、酶與底物比1%、水 解時(shí)間為lh ; 2) 第二步酶解反應(yīng)：將胃蛋白酶酶解物用下面的方法繼續(xù)酶解胰酶：pH7. 5、溫度 37°C、酶與底物比2%、水解時(shí)間為2h ; 3) 第三步酶解反應(yīng)：將胰酶酶解物用下面的方法繼續(xù)酶解：中性蛋白酶：pH7. 5、溫度 45°C、酶與底物比3%、水解時(shí)間為6h ; 4) 滅活除雜：將中性蛋白酶酶解后的水解液經(jīng)沸水浴lOmin滅活最終水解液中的蛋白 酶后，迅速冷卻，酶解物離心，取上清。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的淡水魚鰱魚多肽，其特征在于，所述鰱魚魚肉蛋白由以下方 法制備：以鰱魚為原料，經(jīng)去鱗、去內(nèi)臟，洗凈，選取鰱魚背部白肉，切成小塊后用攪碎機(jī)攪 成肉糜，再經(jīng)滅除魚肉內(nèi)源性蛋白酶得到的。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的淡水魚鰱魚多肽，其特征在于，所述鰱魚魚肉蛋白由以下方 法制備：將鰱魚殺死后，去鱗、去內(nèi)臟，洗凈后進(jìn)行采肉，選取鰱魚背部白肉，切成小塊后用 攪碎機(jī)攪成肉糜，然后鰱魚肉糜與去離子水混合，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度為5%，將調(diào)整好蛋白質(zhì) 濃度的魚肉渾池液在95°C水浴鍋內(nèi)放置lOmin滅酶,冷卻后進(jìn)行均質(zhì)處理，即得鰱魚魚肉 蛋白。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的淡水魚鰱魚多肽，其特征在于，所述脫鹽是指將三段式酶解 得到的上清液通過離子交換樹脂進(jìn)行脫鹽。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的淡水魚鰱魚多肽，其特征在于，所述脫鹽方法包括以下步驟： 將三段式酶解得到的上清液以l-2BV/h流速通過離子交換樹脂，收集流出液。
7. -種制備權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的淡水魚鰱魚多肽的方法，其特征在于，該方法 包括以下步驟： 1) 將鰱魚殺死后，去鱗、去內(nèi)臟，洗凈后進(jìn)行采肉，選取鰱魚背部白肉，切成小塊后用攪 碎機(jī)攪成肉糜，然后鰱魚肉糜與去離子水混合，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度為5%，將調(diào)整好蛋白質(zhì)濃 度的魚肉渾池液在95°C水浴鍋內(nèi)放置lOmin滅酶,冷卻后進(jìn)行均質(zhì)處理，即得鰱魚魚肉蛋 白； 2) 第一步酶解反應(yīng)，胃蛋白酶：pH2. 0、底物濃度5. 0%、溫度37°C、酶與底物比1%、水 解時(shí)間為lh ; 3) 第二步酶解反應(yīng)：將胃蛋白酶酶解物用下面的方法繼續(xù)酶解胰酶：pH7. 5、溫度 37°C、酶與底物比2%、水解時(shí)間為2h ; 4) 第三步酶解反應(yīng)：將胰酶酶解物用下面的方法繼續(xù)酶解：中性蛋白酶：pH7. 5、溫度 45°C、酶與底物比3%、水解時(shí)間為6h ; 5) 滅活除雜：將中性蛋白酶酶解后的水解液經(jīng)沸水浴lOmin滅活中最終水解液中的蛋 白酶后，迅速冷卻，酶解物離心，取上清； 6) 脫鹽：指將三段式酶解得到的上清液通過離子交換樹脂進(jìn)行脫鹽，以一定流速通過 離子交換樹脂，收集流出液，濃縮，即得。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟4)中離心的速度和時(shí)間分別為 1500-2500Xg，10-20min。
9. 權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的DPP- IV抑制多肽粉在制備預(yù)防或輔助治療受益于 DPP-IV抑制的疾病的藥物或食品中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P9/00GK104480176SQ201410546577
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月15日
【發(fā)明者】陳尚武, 張穎 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)