姜黃素衍生物DIMMO在制備自噬誘導(dǎo)劑中的應(yīng)用一、技術(shù)領(lǐng)域：本發(fā)明涉及一種姜黃素衍生物的應(yīng)用，特別是涉及一種姜黃素衍生物DIMMO在制備自噬誘導(dǎo)劑中的應(yīng)用。姜黃素衍生物DIMMO即(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮((3E,5E)-3-(3,4-dimethoxybenzylidene)-5-[(1H-indol-3-yl)methylene]-1-methylpiperidin-4-one，簡稱DIMMO)。二、

背景技術(shù)：
：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮簡稱DIMMO，其結(jié)構(gòu)式為：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮的分子式為C24H24N2O3，分子量(M)為388.46。姜黃是一種傳統(tǒng)中藥材，是從姜科、天南星科類的植物根莖中提取的一種二酮類化學(xué)成分。姜黃素則是從姜黃中提取的一類酚類色素，是姜黃的主要成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和降血脂等作用。有報(bào)道稱姜黃素能夠有效抑制人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(HEC1B)的增殖，并且可以引起細(xì)胞凋亡。其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制是將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。但姜黃素本身水溶性差，生物利用率較低，限制其廣泛應(yīng)用。自噬(autophagy)是存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種普遍生理現(xiàn)象，由Ashford和Porter在1962年發(fā)現(xiàn)并提出，自發(fā)現(xiàn)以來受到越來越多科研工作者的關(guān)注。自噬分為三類：巨自噬(Macroautophagy)、微自噬(Microautophagy)及分子伴侶介導(dǎo)的自噬(Chaperone-mediatedautophagy,CAM)，這里主要討論巨自噬(以下簡稱“自噬”)。在自噬研究中，尋找能夠有效誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的化學(xué)小分子至關(guān)重要。根據(jù)檢索，關(guān)于姜黃素及姜黃素衍生物的研究以抗腫瘤居多。例如：1、申請(qǐng)?zhí)枮?01010183509.6、名稱為“苯丁酰基姜黃素衍生物及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用”的發(fā)明專利，該專利公開了姜黃素衍生物在抑制肝癌中的作用。2、申請(qǐng)?zhí)枮?01110201683.3、名稱為“姜黃素在制備甲狀腺癌治療劑中的應(yīng)用”的發(fā)明專利，該專利公開了姜黃素可以殺傷甲狀腺癌細(xì)胞并且對(duì)正常甲狀腺細(xì)胞影響較小。3、申請(qǐng)?zhí)枮?01110435234.5，名稱為“姜黃素衍生物C2在抗結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用”的發(fā)明專利，該專利公開了一種姜黃素衍生物比母本姜黃素本身穩(wěn)定，親脂性更強(qiáng)；同時(shí)，姜黃素衍生物C2與母本姜黃素相比對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷毒性，對(duì)正常結(jié)腸細(xì)胞的殺傷作用較小，這為姜黃素衍生物被開發(fā)成新的抗結(jié)腸癌藥物提供了理論基礎(chǔ)。目前，僅有研究表明姜黃素能夠誘導(dǎo)自噬，對(duì)于姜黃素衍生物誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的報(bào)道甚少。三、

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提供一種(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在制備自噬誘導(dǎo)劑中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的一種自噬誘導(dǎo)劑，在癌細(xì)胞和正常細(xì)胞中均有明顯效果。為了解決上述問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：本發(fā)明提供一種(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在制備自噬誘導(dǎo)劑中的應(yīng)用。根據(jù)上述的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在制備自噬誘導(dǎo)劑中的應(yīng)用，所述(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在誘導(dǎo)A549細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬中的應(yīng)用。根據(jù)上述的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在制備自噬誘導(dǎo)劑中的應(yīng)用，所述(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在誘導(dǎo)A549細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬中應(yīng)用的有效濃度為10μM～40μM。本發(fā)明利用的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮(DIMMO)已有論文公開其制備方法。該論文的詳細(xì)信息：期刊名為JOURNALOFCHEMICALRESEARCH，發(fā)表年份為2012年2月(February2012)，題目為“Synthesisandbiologicalevaluationofcurcuminanalogueshavingapiperidonecoreaspotentialantioxidantagents”；作者為JianWang,GangchunSun*,ZhichengLi*,WenpengMaiandJingxiXie(*代表通訊作者)；卷期為Volume36,Number2；頁碼為pp.63-65(3)。實(shí)驗(yàn)證明：下面結(jié)合(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮的藥理實(shí)驗(yàn)及結(jié)果，證明(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的效果，即在制備自噬誘導(dǎo)劑中的應(yīng)用。血管內(nèi)皮細(xì)胞及A549細(xì)胞的制備：以常規(guī)方法培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞及A549細(xì)胞，選取生長狀態(tài)良好的、且處于對(duì)數(shù)生長期的血管內(nèi)皮細(xì)胞及A549細(xì)胞備用。結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)，以觀察(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的效果。實(shí)驗(yàn)1、倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)：實(shí)驗(yàn)方法：1)細(xì)胞接種：將細(xì)胞按一定密度傳到24孔板中；2)加藥：種板24h后，吸去舊培養(yǎng)液，每次采用1mL、1×PBS洗2遍；3)24孔板中每孔分別加入1mL濃度為1μM、5μM、10μM、20μM、40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮藥物溶液；4)加藥處理后置于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并拍照。按下列實(shí)驗(yàn)分組處理血管內(nèi)皮細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。溶劑對(duì)照組：40μM的二甲基亞砜(DMSO)孵育細(xì)胞0.5、1、3、6小時(shí)，細(xì)胞形態(tài)正常。(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮處理組：分別用1μM、5μM、10μM、20μM、40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮孵育細(xì)胞0.5、1、3、6、24小時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴性的空泡化。按下列實(shí)驗(yàn)分組處理A549細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。溶劑對(duì)照組：40μM的二甲基亞砜(DMSO)孵育細(xì)胞3、6、12或24小時(shí)，細(xì)胞形態(tài)正常。(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮處理組：分別用1μM、5μM、10μM、20μM、40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮孵育A549細(xì)胞3、6、12或24小時(shí)，與對(duì)照組相比，細(xì)胞趨圓變亮。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：用不同濃度的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮處理A549細(xì)胞3、6、12、或24小時(shí)，細(xì)胞明顯產(chǎn)生空泡化，并呈時(shí)間和濃度的依賴性，同時(shí)細(xì)胞在高濃度時(shí)細(xì)胞趨圓變亮(詳見附圖1)。不同濃度的姜黃素衍生物(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮處理血管內(nèi)皮細(xì)胞0.5、1、3、6、24小時(shí)，相比對(duì)照組細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴的明顯空泡化，引起細(xì)胞自噬(詳見附圖2)。實(shí)驗(yàn)2、熒光顯微鏡觀察吖啶橙染色后觀察細(xì)胞酸性小泡聚集：實(shí)驗(yàn)方法：1)接種細(xì)胞及加藥處理同實(shí)驗(yàn)1；2)加藥處理時(shí)間結(jié)束后棄各孔中原有培養(yǎng)液，采用700μL、1×PBS洗細(xì)胞2次；3)加入1×吖啶橙染液700μL染色40s；4)時(shí)間到，棄去吖啶橙染液，1×PBS清洗細(xì)胞2次；5)加入1×PBS700μL，置于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照；6)先在白光下找到細(xì)胞，然后換為藍(lán)光，在藍(lán)光激發(fā)下細(xì)胞核為綠色，酸性膜泡為紅色；7)PS處理和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。按下列實(shí)驗(yàn)分組處理血管內(nèi)皮細(xì)胞，吖啶橙染色后熒光顯微鏡下觀察酸性小泡聚集。溶劑對(duì)照組：40μM的二甲基亞砜(DMSO)孵育細(xì)胞0.5、1、3、6小時(shí)，未觀察到明顯的酸性小泡聚集。(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮處理組：分別用1μM、5μM、10μM、20μM、40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮孵育細(xì)胞0.5、1、3、6、24小時(shí)，吖啶橙染色后熒光顯微鏡下觀察到明顯的酸性小泡聚集且呈濃度和時(shí)間依賴性。按照實(shí)驗(yàn)1中實(shí)驗(yàn)分組處理A549細(xì)胞3、6、12或24小時(shí)，吖啶橙染色40秒，激光掃描熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞酸性小泡聚集情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮顯著誘導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)酸性小泡的聚集，并且呈現(xiàn)濃度和時(shí)間的依賴性(詳見附圖3、4)。實(shí)驗(yàn)3、蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)LC3蛋白表達(dá)量變化：細(xì)胞總蛋白提取：1)取出細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，加入4℃預(yù)冷的PBS清洗兩次；2)將培養(yǎng)皿內(nèi)PBS吸干，每個(gè)小皿加入50μL蛋白裂解液；3)冰上裂解10min；4)用細(xì)胞刮將裂解后的細(xì)胞刮下，轉(zhuǎn)移至0.5mL離心管中；5)100℃變性5min；6)取出5μL測(cè)蛋白濃度，其余分裝后-20℃保存。Bradford比色法測(cè)定總蛋白濃度：1)取6只5mL小試管，分別加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA：0、3、6、9、12和15μg，加蒸餾水補(bǔ)足到100μL；2)取2uL待測(cè)樣品，加水補(bǔ)足到100μL；3)每管加入1.9mL考馬斯亮藍(lán)(G-250)染料溶液，振蕩混勻；4)加入96孔板，根據(jù)情況每組4個(gè)平行以上，每孔100μL；5)酶標(biāo)儀檢測(cè)590nm的吸光值(以含0μgBSA的一組孔調(diào)零)；6)利用Excel軟件繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)在0.96以上可用；7)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定待測(cè)樣品的濃度。蛋白質(zhì)印跡法：1)制膠：15％分離膠，5％濃縮膠；2)蛋白樣品100℃變性5min，上樣10μg；3)恒壓60v進(jìn)膠，當(dāng)溴酚藍(lán)/蘭前沿剛進(jìn)入分離膠后，恒壓100v跑膠；4)據(jù)目標(biāo)蛋白分子量將膠進(jìn)行適當(dāng)剪切；5)用轉(zhuǎn)移槽恒流轉(zhuǎn)膜，LC3用0.22μm孔徑PVDF膜轉(zhuǎn)1.5h，內(nèi)參用0.45μm孔徑PVDF膜轉(zhuǎn)3h；6)用含8％脫脂奶粉的PBST溶液在室溫下封閉1h；7)用一抗稀釋液稀釋目的蛋白的單克隆一抗，一抗應(yīng)用液與相應(yīng)的PVDF膜在4℃孵育過夜；8)用PBST溶液浸泡膜3次，每次10min；9)用PBS緩沖液浸泡膜1次，10min；10)用PBS緩沖液稀釋二抗(1：5000)，室溫孵育1h；11)用PBST緩沖液浸泡膜3次，每次10min；12)用PBS緩沖液浸泡膜1次，10min；13)用ECL顯色法在暗盒中顯色；14)處理并分析結(jié)果。按下列實(shí)驗(yàn)分組處理血管內(nèi)皮細(xì)胞，提取總蛋白，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)LC3蛋白表達(dá)情況。溶劑對(duì)照組：40μM的二甲基亞砜(DMSO)每個(gè)小皿加3mL孵育細(xì)胞1小時(shí)。(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮處理組：分別用1μM、5μM、10μM、20μM、40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮每個(gè)小皿加3mL孵育血管內(nèi)皮細(xì)胞1小時(shí)。按下列實(shí)驗(yàn)分組處理A549細(xì)胞，提取總蛋白，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)LC3蛋白表達(dá)情況。溶劑對(duì)照組：40μM的二甲基亞砜(DMSO)每個(gè)小皿加3mL孵育細(xì)胞24小時(shí)。(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮處理組：分別用1μM、5μM、10μM、20μM、40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮每個(gè)小皿加3mL孵育A549細(xì)胞24小時(shí)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：處理組細(xì)胞中LC3蛋白表達(dá)隨濃度增多明顯增多，細(xì)胞出現(xiàn)了自噬現(xiàn)象(詳見附圖5、6)。(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在誘導(dǎo)A549細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中具有的明顯作用，為制備自噬誘導(dǎo)劑的開發(fā)提供了誘人前景。四、附圖說明：圖1是倒置相差顯微鏡下，溶劑對(duì)照組和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組處理3、6、12、24小時(shí)后的非小細(xì)胞腫瘤A549細(xì)胞。圖1中：A(3小時(shí))、G(6小時(shí))、M(12小時(shí))、S(24小時(shí))為溶劑對(duì)照組；B(3小時(shí))、H(6小時(shí))、N(12小時(shí))、T(24小時(shí))為1μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組；C(3小時(shí))、I(6小時(shí))、O(12小時(shí))、U(24小時(shí))為5μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組；D(3小時(shí))、J(6小時(shí))、P(12小時(shí))、V(24小時(shí))為10μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組；E(3小時(shí))、K(6小時(shí))、Q(12小時(shí))、W(24小時(shí))為20μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組；F(3小時(shí))、L(6小時(shí))、R(12小時(shí))、X(24小時(shí))為40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組。圖2是倒置相差顯微鏡下，溶劑對(duì)照組和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組處理0.5、1、3、6、24小時(shí)后的血管內(nèi)皮細(xì)胞。圖2中：A(0.5小時(shí))、G(1小時(shí))、M(3小時(shí))、S(6小時(shí))、Y(24小時(shí))為溶劑對(duì)照組；B(0.5小時(shí))、H(1小時(shí))、N(3小時(shí))、T(6小時(shí))、Z(24小時(shí))為1μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組；C(0.5小時(shí))、I(1小時(shí))、O(3小時(shí))、U(6小時(shí))、α(24小時(shí))為5μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組；D(0.5小時(shí))、J(1小時(shí))、P(3小時(shí))、V(6小時(shí))、β(24小時(shí))為10μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組；E(0.5小時(shí))、K(1小時(shí))、Q(3小時(shí))、W(6小時(shí))、γ(24小時(shí))為20μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組；F(0.5小時(shí))、L(1小時(shí))、R(3小時(shí))、X(6小時(shí))、Δ(24小時(shí))為40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組。圖3是吖啶橙染色，熒光顯微鏡下溶劑對(duì)照組和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組處理3、6、12、24小時(shí)后的非小細(xì)胞腫瘤A549細(xì)胞。圖3中：A(3小時(shí))、G(6小時(shí))、M(12小時(shí))、S(24小時(shí))為溶劑對(duì)照組；B(3小時(shí))、H(6小時(shí))、N(12小時(shí))、T(24小時(shí))為1μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組；C(3小時(shí))、I(6小時(shí))、O(12小時(shí))、U(24小時(shí))為5μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組；D(3小時(shí))、J(6小時(shí))、P(12小時(shí))、V(24小時(shí))為10μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組；E(3小時(shí))、K(6小時(shí))、Q(12小時(shí))、W(24小時(shí))為20μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組；F(3小時(shí))、L(6小時(shí))、R(12小時(shí))、X(24小時(shí))為40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組。圖4是吖啶橙染色，熒光顯微鏡下溶劑對(duì)照組和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組處理0.5、1、3、6、24小時(shí)后的血管內(nèi)皮細(xì)胞。圖4中：A(0.5小時(shí))、G(1小時(shí))、M(3小時(shí))、S(6小時(shí))、Y(24小時(shí))為溶劑對(duì)照組；B(0.5小時(shí))、H(1小時(shí))、N(3小時(shí))、T(6小時(shí))、Z(24小時(shí))為1μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組；C(0.5小時(shí))、I(1小時(shí))、O(3小時(shí))、U(6小時(shí))、α(24小時(shí))為5μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組；D(0.5小時(shí))、J(1小時(shí))、P(3小時(shí))、V(6小時(shí))、β(24小時(shí))為10μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組；E(0.5小時(shí))、K(1小時(shí))、Q(3小時(shí))、W(6小時(shí))、γ(24小時(shí))為20μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組；F(0.5小時(shí))、L(1小時(shí))、R(3小時(shí))、X(6小時(shí))、Δ(24小時(shí))為40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組。圖5在A549細(xì)胞中蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果。圖6在血管內(nèi)皮細(xì)胞中蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果。五、具體實(shí)施方式：以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例1：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在促進(jìn)非小肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞自噬中的應(yīng)用。非小肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞的制備：以常規(guī)方法培養(yǎng)非小肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞，選取生長狀態(tài)良好的、且處于對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞備用。將所培養(yǎng)的細(xì)胞分為溶劑對(duì)照組和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組。溶劑對(duì)照組細(xì)胞用濃度為40μM的DMSO孵育3、6、12或24小時(shí)；(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用不同濃度的(1μM、5μM、10μM、20μM、40μM)(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮孵育3、6、12或24小時(shí)；每隔3小時(shí)于倒置相差顯微鏡下觀察，分別在3、6、12和24小時(shí)，記錄細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：對(duì)照組和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組處理A549細(xì)胞3h，細(xì)胞形態(tài)無肉眼可見變化；但(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮不同濃度處理組細(xì)胞隨著時(shí)間增加明顯產(chǎn)生空泡化，并且細(xì)胞在高濃度時(shí)明顯趨圓變亮；在24小時(shí)，40μM處尤為明顯。(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮促進(jìn)細(xì)胞空泡化，表明(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮促進(jìn)非小肺癌細(xì)A549自噬(詳見附圖1)。實(shí)施例2：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在促進(jìn)非小肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞自噬中的應(yīng)用非小肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞的制備：以常規(guī)方法培養(yǎng)非小肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞，選取生長狀態(tài)良好的、且處于對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞備用。將所培養(yǎng)的細(xì)胞分為溶劑對(duì)照組和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組。溶劑對(duì)照組細(xì)胞用濃度為40μM的DMSO孵育3、6、12或24小時(shí)；(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用不同濃度的(1μM、5μM、10μM、20μM、40μM)(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮孵育3、6、12或24小時(shí)。吸棄各孔中原有培養(yǎng)液，1×PBS清洗細(xì)胞1次，0.1mg/mL吖啶橙染液染色40s，1×PBS再次清洗，在倒置熒光顯微鏡下觀察酸性膜泡，先在白光下找到細(xì)胞，然后換為藍(lán)光，在藍(lán)光激發(fā)下細(xì)胞核為綠色，酸性膜泡為紅色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮明顯誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生酸性膜泡，在24小時(shí)，40μM處尤為明顯。(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生酸性膜泡，表明(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮促進(jìn)非小肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞自噬(詳見附圖3)。實(shí)施例3：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在促進(jìn)非小肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞自噬中的應(yīng)用。非小肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞的制備：以常規(guī)方法培養(yǎng)非小肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞，選取生長狀態(tài)良好的、且處于對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞備用。將所培養(yǎng)的細(xì)胞分為溶劑對(duì)照組和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組。溶劑對(duì)照組細(xì)胞用濃度為40μM的DMSO孵育24小時(shí)；(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用不同濃度的(1μM、5μM、10μM、20μM、40μM)(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮孵育24小時(shí)。孵育細(xì)胞24小時(shí)后，用蛋白裂解液提取蛋白，考馬斯亮藍(lán)G-250測(cè)得蛋白濃度，接著蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：隨著(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮濃度的增加(1、5、10、20、40μM)與對(duì)照組相比LC3-Ⅱ的表達(dá)量逐漸增高，LC3-Ⅰ的表達(dá)量逐漸降低；在40μM處尤為明顯。(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮誘導(dǎo)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量的增多，表明(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮促進(jìn)非小肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞自噬。實(shí)施例4：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬中的應(yīng)用。血管內(nèi)皮細(xì)胞的制備：以常規(guī)方法培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞，選取生長狀態(tài)良好的、且處于對(duì)數(shù)生長期的血管內(nèi)皮細(xì)胞備用。將所培養(yǎng)的細(xì)胞分為溶劑對(duì)照組和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組。溶劑對(duì)照組細(xì)胞用濃度為40μM的DMSO孵育0.5、1、3、6或24小時(shí)；(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用不同濃度的(1μM、5μM、10μM、20μM、40μM)(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮孵育0.5、1、3、6或24小時(shí)；于倒置相差顯微鏡下觀察，在0.5、1、3、6和24小時(shí)，記錄細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：對(duì)照組和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組處理血管內(nèi)皮細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)無肉眼可見變化；但(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮不同濃度處理組細(xì)胞隨著時(shí)間增加明顯產(chǎn)生空泡化，并且細(xì)胞在高濃度時(shí)明顯趨圓變亮；在24小時(shí)，40μM處尤為明顯。(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮促進(jìn)細(xì)胞空泡化，表明(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬(詳見附圖3)。實(shí)施例5：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬中的應(yīng)用。血管內(nèi)皮細(xì)胞的制備：以常規(guī)方法培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，選取生長狀態(tài)良好的、且處于對(duì)數(shù)生長期的血管內(nèi)皮細(xì)胞備用。將所培養(yǎng)的細(xì)胞分為溶劑對(duì)照組和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組。溶劑對(duì)照組細(xì)胞用濃度為40μM的DMSO孵育3、6、12或24小時(shí)；(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用不同濃度的(1μM、5μM、10μM、20μM、40μM)(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮孵育0.5、1、3、6或24小時(shí)。吸棄各孔中原有培養(yǎng)液，1×PBS清洗細(xì)胞1次，0.1mg/mL吖啶橙染液染色40s，1×PBS再次清洗，在倒置熒光顯微鏡下觀察酸性膜泡，先在白光下找到細(xì)胞，然后換為藍(lán)光，在藍(lán)光激發(fā)下細(xì)胞核為綠色，酸性膜泡為紅色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮明顯誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生酸性膜泡；在24小時(shí)，40μM處尤為明顯。(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生酸性膜泡，表明(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬(詳見附圖4)。實(shí)施例6：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬中的應(yīng)用。血管內(nèi)皮細(xì)胞的制備：以常規(guī)方法培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞，選取生長狀態(tài)良好的、且處于對(duì)數(shù)生長期的血管內(nèi)皮細(xì)胞備用。將所培養(yǎng)的細(xì)胞分為溶劑對(duì)照組和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組。溶劑對(duì)照組細(xì)胞用濃度為40μM的DMSO孵育1小時(shí)：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用不同濃度(1μM、5μM、10μM、20μM、40μM)的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮孵育1小時(shí)。孵育細(xì)胞1小時(shí)后，用蛋白裂解液提取蛋白，考馬斯亮藍(lán)G-250測(cè)得蛋白濃度，接著蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：隨著(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮濃度的增加(1、5、10、20、40μM)與對(duì)照組相比LC3-Ⅱ的表達(dá)量逐漸增高，在40μM處尤為明顯。(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮誘導(dǎo)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量的增多，表明(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬。實(shí)施例1～3是(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在促進(jìn)非小肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞自噬中的應(yīng)用；實(shí)施例4～6是(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬中的應(yīng)用。