組合物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了包含丙型肝炎病毒(HCV)包膜糖蛋白2(E2)的組合物，其中所述HCV E2為基本上單體耗盡的HCV E2。本發(fā)明還提供了誘導HCV免疫應答的方法。
【專利說明】組合物及其制備方法
[0001] 本申請為2013年7月25日提交的名稱為"組合物及其制備方法"的中國專利申 請No. 201180066040. 0的分案申請。本申請要求2010年11月26日提交的美國專利申請 No. 61/417, 317 的優(yōu)先權。

【技術領域】
[0002] 本發(fā)明總體涉及丙型肝炎病毒（HCV)疫苗和診斷組合物。更具體而言，本發(fā)明提 供了含有HCV包膜糖蛋白2(E2)的組合物。所述組合物尤其適用于HCV感染的治療、預防、 診斷和預后。

【背景技術】
[0003] 本說明書中所引用文獻的詳細情況列于本說明書的末尾。
[0004] 本發(fā)明中所參考的任何現(xiàn)有技術不是，且不應被視為承認或以任何形式暗示該現(xiàn) 有技術在任何一個國家構成一部分公知常識。
[0005] 根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，丙型肝炎病毒（HCV)感染全球約1. 7-2. 0億人。雖然政 府試圖提高人們對HCV如何通過感染的針頭和體液傳播的認識，并已實施了預防方案，然 而HCV感染的發(fā)病率不斷提高。約80% HCV感染者為該病毒的攜帶者。在澳大利亞，每年 報道的HCV感染新病例大約為16, 000個，新感染者在注射吸毒人群之間最為普遍。HCV是 最常見的血源性病毒感染，引起的死亡或發(fā)病率占相當大的人口比例。
[0006] 已知HCV感染肝臟和某些免疫細胞。其結果是，HCV導致嚴重的肝臟疾病，如肝纖 維化、肝硬化、脂肪變性和肝細胞癌（肝癌）的頻率高于其他形式的肝炎。HCV是導致肝移 植接受者癌癥的主要原因。通常認為由于該感染的亞臨床特征，使得感染的急性期往往被 忽視，從而80 %的個體發(fā)展成為慢性疾病。慢性感染是由于免疫系統(tǒng)未能產生針對抗病毒 的清除性免疫應答。有6個主要的HCV基因型（1-6)和各種亞型（a、b、c等）。目前，還沒 有HCV疫苗，并且唯一可用于HCV感染的治療是抗病毒藥物?？共《镜乃幬镌O計背后的總 體思路是要找出關鍵的能被失活或抑制的病毒蛋白，或蛋白的一部分。中度或重度纖維化 患者的標準治療選擇包括α-干擾素和利巴韋林的聯(lián)合給藥。α-干擾素和利巴韋林聯(lián)合 給藥的抗病毒效果會導致血液中HCV水平的迅速下降，甚至是在施用單劑量之后。然而，常 規(guī)的α-干擾素治療HCV存在幾個缺點。例如，（i)當α-干擾素治療在經過數(shù)周或數(shù)月 的治療停止后，病毒載量迅速重新建立；（ii)用α-干擾素/利巴韋林治療伴隨有嚴重的 副作用，包括流感樣癥狀，紅細胞或白細胞計數(shù)下降，抑制骨髓細胞，神經精神效應，特別是 抑郁和貧血；（iii)由于α-干擾素在體內迅速吸收和排除，因此有效的治療需要患者堅持 頻繁的劑量給藥方案；及（iv)這種治療的成本高。治療效果隨基因型的不同而異，僅有大 約一半的基因型1或4的患者獲得病毒清除。
[0007] 上述的一些缺點，特別是上述（iii)，可通過使α-干擾素發(fā)生"聚乙二醇化"，使 聚乙二醇分子連接到α-干擾素上而克服。聚乙二醇化的干擾素與利巴韋林聯(lián)合給藥延長 了 α-干擾素的半衰期，有利于減少劑量給藥頻率，從而提高患者的依從性。然而，已證明 這種治療在不到50%接受治療的患者中是有效的。鑒于慢性HCV患者的數(shù)量越來越多，有 必要開發(fā)一種用于預防和治療目的的疫苗。
[0008] 病毒中和抗體的誘導是所有疫苗的重要組成部分。對于HCV而言，HCV糖蛋白 E2是該病毒中和抗體應答的主要靶標。已證明中和抗體對于感染HCV的動物模型和人 體內 HCV 的清除是重要的（Angus and Patel, 2011，Vanwolleghem et al·，2008, Law et al.，2008, Pestka et al.，2007)。由于HCV是一種高度易變的病毒，因此人們希望用以預 防HCV感染的疫苗產生能夠識別各種HCV基因型和亞型的中和抗體。
[0009] HCV的主要細胞受體是CD81(Pileri et al·，1998)。CD81對于所有HCV毒株 進入肝細胞是必須的（Koutsoudakis et al·，2007, Zhang et al·，2004, McKeating et al.，2004, Bartosch et al.，2003, Pileri et al.，1998)。能阻止病毒顆粒與 CD81 發(fā)生 相互作用的抗體可以是中和抗體（Mancini et al.，2009, Law et al.，2008)。在疫苗研 究中，高滴度的E2-CD81抑制抗體與抗HCV保護有關（Youn et al.，2005) (Stamataki et al.，2008)。
[0010] 然而，盡管E2-CD81抑制抗體與黑猩猩體內更好的抗HCV保護作用有關，但它們 并不是中和作用的唯一潛在機制。在其他病毒系統(tǒng)中，中和作用可由作用于融合環(huán)的抗 體（Sultana et al.，2009, Stiasny et al.，2006)和共同受體相互作用來實現(xiàn)（Blish et al.，2008, Lusso et al.，2005)。此外，黃病毒顆粒表面上表位之間的交聯(lián)被認為是中和作 用的主要形式（Kaufmann et al·，2010)。
[0011] HCV糖蛋白E2含有一個由第384-661位氨基酸殘基所跨越的離散的受體結合域 (RBD)。所述RBD可從第661位殘基延伸至E2的胞外結構域的C-末端邊界。E2RBD的異源表 達導致保留了結合⑶81能力的可溶性蛋白的分泌。RBD內有三個可變區(qū)，稱為高變區(qū)1、高 變區(qū)2(HVR2)和基因型間（intergenotypic)可變區(qū)（igVR)。這三個可變區(qū)殘基位于糖蛋白 核心結構域的外側，不直接參與E2的CD81結合位點的形成（McCaffrey et al.，2007) oRBD 中三個可變區(qū)的缺失導致可溶形式糖蛋白的表達，所述糖蛋白可被構象依賴性的抗體識別 并保留了野生型（WT)⑶81的結合水平。這種最小化形式的E2核心結構域稱為Λ123Ε 2661。
[0012] 鑒于用于治療或預防HCV感染的現(xiàn)有療法和實驗療法的缺點，亟需提供能夠在 HCV感染的治療或預防中引起有效免疫應答的組合物，且該組合物能夠形成診斷試劑以檢 測HCV感染并用于監(jiān)測抗HCV治療。
[0013] 發(fā)明概述
[0014] 在本發(fā)明中，除非上下文另有所指，措辭"包含（comprise)"，或變化形式如"包含 (comprises) "或"包含（comprising) "，應理解為隱含包括所述成分或整體，或成分或整體 的組，但不排除任何其他成分或整體，或成分或整體的組。
[0015] 本文中使用的單數(shù)形式"一個/種"（a和an)和"該/所述（the)"包括復數(shù)，除 非上下文另有明確說明。因此,例如，"一種組合物（a composition)"包括單獨的組合物， 以及兩種或兩種以上的組合物；"一種試劑（an agent)"包括一種試劑，以及兩種或兩種以 上的試劑；"該發(fā)明（the invention)"包括該發(fā)明的一個或多個方面等。
[0016] 本發(fā)明提供了一種包含丙型肝炎病毒（HCV)包膜糖蛋白2(E2)的組合物，其中所 述HCV糖蛋白E2(HCV E2)基本上耗盡了 HCV E2單體。本文中使用的短語"基本上耗盡了 E2單體"或"基本上單體耗盡的HCV E2"是指組合物包含不到30 %、29 %、28 %、27 %、26 %、 25%,24%,23%,22%,21 %,20%U9%U8%U7%U6%U5%U4%U3%U2%U1 %> 10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或低于1%的E2單體（按重量計）。
[0017] 在一些實施方案中，單體形式的HCV E2的比例按重量計低于15%、14%、13%、 12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0· 5%或 0· 1%。
[0018] 基本上單體耗盡的HCV E2糖蛋白可來源于重組或合成的方法制備的糖蛋白。 [0019] 在一個具體實施方案中，組合物基本不含單體HCV E2,其含有低于1 %或低于 0. 1% 的單體 HCV E2。
[0020] 在一個相關的方面，基本上單體耗盡的HCV E2組合物富含三聚HCV E2,且該組 合物所包括的組合物制劑具有大于70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、 79 %,80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %, 94%、95%、96%、97%、98%或99%(按重量計）的三聚!10^2糖蛋白。
[0021] 在另一個方面，基本上單體耗盡的HCV E2組合物富含二聚HCV E2,且該組合物 所包括的組合物制劑具有大于 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、 80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %, 95%、96%、97%、98%或99%(按重量計）的二聚HCVE2糖蛋白。
[0022] 在另一個方面，單體耗盡的組合物富含三聚HCV E2或HCV E2的更高級復合體， 且該組合物所包括的組合物制劑具有大于70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、 78 %,79 %,80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %, 93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%(按重量計）的三聚或更高級形式的HCVE2糖蛋 白。
[0023] 在一些實施方案中，E2糖蛋白基本上為HCV E2三聚體。在一個相關的實施方案 中，E2糖蛋白基本上為HCV E2三聚體和更高級的形式。在另一個實施方案中，E2糖蛋白基 本上為更高級形式的HCV E2。
[0024] 基本上包含三聚HCV E2的組合物所包括的組合物制劑具有大于80%、81%、 82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %, 97%、98%或99% (按重量計）的E2三聚體。
[0025] 基本上包含的三聚和更高級形式的HCV E2的組合物所包括的組合物制劑具有大 于 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%或99% (按重量計）的E2三聚體和更高級的形式。
[0026] 基本上包含更高級形式的HCV E2的組合物所包括的組合物制劑具有大于80%、 81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %, 96%、97%、98%或99% (按重量計）的更高級形式的E2。
[0027] 在一些實施方案中，E2糖蛋白基本上為HCV E2二聚體。
[0028] 基本上包含二聚HCV E2的組合物所包括的組合物制劑具有大于80%、81%、 82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %, 97%、98%或99% (按重量計）的E2二聚體。
[0029] 在一些實施方案中，E2糖蛋白基本上為HCV E2二聚體和E2三聚體。
[0030] 在一些實施方案中，本發(fā)明所描述的包含基本上單體耗盡的HCVE2的組合物用于 治療和/或預防HCV感染。
[0031] 本發(fā)明還提供了用于在個體或患者體引起內免疫應答的方法，該方法包括向所述 個體或患者施用有效量的包含基本上單體耗盡的HCV E2的組合物。
[0032] 本發(fā)明還提供了用于免疫個體抗丙型肝炎病毒感染的方法，該方法包括向所述個 體施用包含基本上單體耗盡的HCV E2的組合物。
[0033] 本發(fā)明還提供了一種組合物，特別是一種用于免疫個體抗丙型肝炎病毒感染的包 含基本上單體耗盡的HCV E2的疫苗組合物。
[0034] 在一個相關的實施方案中，本發(fā)明還提供一種用于治療個體的丙型肝炎病毒感染 的方法，該方法包括向所述個體施用包含基本上單體耗盡的HCV E2的組合物。
[0035] 根據(jù)這些實施方案，通常是在足以引起免疫應答的條件下，包括E2特異性抗體的 產生，施用該組合物一段時間。本發(fā)明的組合物可以是單劑量或應用（applications)給 藥。或者，該組合物可包括重復劑量或應用，例如，該組合物可以給藥2、3、4、5、6、7、8、9、10 次或更多次。
[0036] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了 一種用于制備純化的抗基本上單體耗盡的 HCV E2的抗體的方法，包括向個體注射免疫有效量基本上單體耗盡的HCV E2,并分離和純 化產生的抗體。
[0037] 在另一個實施方案中，所述基本上單體耗盡的HCV E2組合物還包含藥學上或生理 上可接受的載體或稀釋劑。
[0038] 在另一個實施方案中，所述基本上單體耗盡的組合物還包含佐劑。在一個示例性 實施方案中，所述佐劑為基于皂苷的佐劑。在一個相關的方面，基于皂苷的佐劑還包括膽固 醇和留醇，其示例性實例是ISC0MATRIX?佐劑。
[0039] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供抗基本上單體耗盡的HCV E2的純化抗體，或與 基本上單體耗盡的HCV E2發(fā)生反應的純化抗體。
[0040] 在一些實施方案中,所產生的抗體包括至少部分中和HCV生命周期的某個重要部 分如侵入宿主細胞或病毒出芽的那些抗體。
[0041] 本發(fā)明還涉及基本上單體耗盡的HCV E2在治療或預防HCV感染中的或在制備用 于治療或預防HCV感染的藥物中的應用。
[0042] 本發(fā)明還涉及基本上單體耗盡的HCV E2在診斷或監(jiān)測HCV感染或者監(jiān)測抗HCV 治療中，或在制備用于診斷或監(jiān)測HCV感染或者監(jiān)測抗HCV治療的診斷試劑（如抗體）中 的應用。
[0043] 在其他方面，本發(fā)明還提供了篩選方法，其使用基本上單體耗盡的HCV E2鑒定結 合分子如抗體、抗原結合片段、配體、肽、有機或無機分子。
[0044] 在另一個方面，本發(fā)明提供了包含基本上單體耗盡的HCV E2糖蛋白的試劑盒或者 固體或半固體基底。考慮了本發(fā)明的試劑盒或基底用于診斷、預后、治療或預防應用，以及 用于設計和/或篩選HCV E2結合分子或HCV受體結合分子。所述試劑盒和基底還用于監(jiān) 測抗HCV感染的治療方法的療效。
[0045] 以上概述不是并且不應被視為本發(fā)明所有實施方案的詳盡描述。
[0046] 附圖及表格說明
[0047] 圖1提供的圖表顯示出H77c WT和AHVRl+2+3E 2661_his的制備型尺寸排阻層析 (prepative size-exclusion chromatography)。濃縮的 WT和 AHVRl+2+3E2661_his 蛋白的 制備級TSKG3000SW尺寸排阻曲線分別位于圖的上方和下方。樣品在IXPBS中以2mL/min 的流速運行100分鐘。在大量運行后，在60-160分鐘之間收集2mL級分，并混合相應的級 分，供進一步分析。顯示WT和AHVRl+2+3E 2661-his的解析的單體和二聚體峰。0. Syg/mL 純化的牛血清白蛋白和卵清蛋白提供了所標記的尺寸標準。
[0048] 圖2提供的圖表顯示了不同形式的H77c WT和AHVRl+2+3E2661_his分離的數(shù)據(jù)。 混合級分的分析型TSKG3000SW尺寸排阻曲線，表示制備型尺寸排阻層析曲線的單體和二 聚體峰以及獨立的高級分子量形式（推定的三聚體）。所有樣品以〇. 25mL/min在IXPBS 中整齊運行60分鐘，解析出單體、二聚體和三聚體峰。0. 5μ g/mL牛血清白蛋白和卵清蛋白 提供了所標記的尺寸標準。
[0049] 圖3提供的圖表顯示了不同形式的ConlWT和AHVRl+2+3E 2661_his分離的數(shù) 據(jù)。混合級分的分析型TSKG3000SW尺寸排阻曲線，表示制備型尺寸排阻層析曲線的單 體和二聚體峰以及獨立的高級分子量形式（推定的三聚體）。A.WT E2661-his寡聚體和 B. Λ HVRl+2+3E 2661-his寡聚體。所有樣品以0. 25mL/min在I XPBS中整齊運行60分鐘，解 析出單體、二聚體和三聚體峰。
[0050] 圖4提供的圖表顯示了不同形式的JFHlWT和ΛHVRl+2+3E 2661_his分離的數(shù) 據(jù)?；旌霞壏值姆治鲂蚑SKG3000SW尺寸排阻曲線，表示制備型尺寸排阻層析曲線的單 體和二聚體峰以及獨立的高級分子量形式（推定的三聚體）。A.WT E2661-his寡聚體和 B. Λ HVRl+2+3E 2661-his寡聚體。所有樣品以0. 25mL/min在I XPBS中整齊運行60分鐘，解 析出單體、二聚體和三聚體峰。
[0051] 圖5為缺失單個或多個可變區(qū)序列的純化E2661蛋白的表達曲線。顯示出利用 TSKG3000SWXL柱和HPLC系統(tǒng)進行的來自H77c基因型Ia的各E2661-his可變區(qū)缺失突變體 的分析型尺寸排阻曲線。不同形式的純化的牛血清白蛋白（BSA)和卵清蛋白提供了所示的 尺寸標準標記。
[0052] 圖6顯示出不同形式的H77c WT和AHVRl+2+3E 2661-his的表征。在非還原和還 原（+β -巰基乙醇）條件下，對于 A. WT E2661-his 級分 13-31 和 B. AHVRl+2+3E2661-his 級 分15-33,使用25-200kDa之間的尺寸標準物，對來自制備型尺寸排阻層析的混合級分進行 定量SDS-PAGE分析。根據(jù)分析型尺寸排阻層析曲線，星號（*)所示的級分代表單體和二聚 體峰以及一個獨立的高分子量種類（推定的三聚體）。圖下面的表格顯示了根據(jù)SDS-PAGE 分析所估算的單體、二聚體和三聚體的計算分子量。
[0053] 圖7顯示出不同形式的ConlWT和AHVRl+2+3E2661_his的表征。在非還原和還原 (+ β -巰基乙醇）的條件下，對于 A. WT E2661-his 級分 13-31 和 B. Λ HVRl+2+3E 2661-his 級 分16-34,使用25-200kDa之間的尺寸標準物，對制備型尺寸排阻層析的混合級分進行定量 SDS-PAGE分析。根據(jù)分析型尺寸排阻層析曲線，星號（*)所示的級分代表單體和二聚體峰 以及一個獨立的高分子量形式（推定的三聚體）。在各SDS-PAGE結果下繪制成表格的是 級分的計算分子量，所述級分對應于還原和非還原SDS-PAGE中的單體、二聚體和高分子量 (HMr)種類（推定的三聚體）。
[0054] 圖8顯示出不同寡聚形式的JFHlWT和AHVRl+2+3E2661_his的表征。在非還原和 還原（+ β -巰基乙醇）條件下，對于 A. WT E2661-his 級分 15-32 和 B. Λ HVRl+2+3E 2661-his 級分18-36,使用25-200kDa之間的尺寸標準物，對制備型尺寸排阻層析的混合級分進行定 量SDS-PAGE分析。根據(jù)分析型尺寸排阻層析曲線，星號（*)所示的級分代表單體和二聚體 峰以及一個獨立的高分子量形式（推定的三聚體）。在各SDS-PAGE結果下繪制成表格的是 級分的計算分子量，所述級分對應于還原和非還原SDS-PAGE中的單體、二聚體和高分子量 (HMr)種類（推定的三聚體）。
[0055] 圖9提供的圖表顯示出來自H77c分離株（isolate)的不同形式的WT和 AHVRl+2+3E 2661-his的生物傳感器曲線。從0. lyg/mL開始進行連續(xù)兩倍稀釋的不同蛋白 的生物傳感器曲線。上方圖為WT E2661-his級分，下方圖為AHVRl+2+3E2661-his級分，分別 表示通過分析型尺寸排阻層析測定的三聚體、二聚體和單體峰。垂直條帶表示注射"起始" 和"結束"的位置。圖中顯示了用于1:1化學計算的R max值，而用于2:1結合化學計算的Rmax 值不于括號內。
[0056] 圖10提供的圖表顯示了 H77c(基因型la)、Conl (基因型Ib)和JFHl (基因型 2a)WT和AHVRl+2+3E 2661-his三聚體、二聚體和單體蛋白結合CDSIMBP-LEL113-201的胞外 大環(huán)的比較親和性。對于二聚體和三聚體蛋白采用" I: ILangmuir"結合模型，對于單體 蛋白采用"兩階段（two-state)"（構象變化）模型，得到以摩爾（M)為單位的平均KD值。 除了 Conl和JFHl之外，顯示了三個獨立實驗的平均值和標準誤差，其中η = 1。WT和 AHVRl+2+3E 2661-his蛋白各自KD值的顯著差異（ρ〈0. 05)，用星號（*)表示。
[0057] 圖11提供的圖表數(shù)據(jù)顯示豚鼠免疫血清的滴度曲線，其是針對30μ g或100μ g 劑量的抗同源 H77cA123E2661-his 抗原的單體[A(gpl-1 至 gpl-4)和 B(gp 2-1 至 2-4)]、 二聚體[C (gp 3-1 至 3-4)和 D (gp4-l 至 4-4)]或混合的[E (gp5-l 至 5-4)和 F (gp6-l 至 6-4) ]E2-his組合物產生的。由佐劑ISC0MATRIX?單獨（無抗原）誘發(fā)的豚鼠血清的反應 性示于各圖中的gp 7-1至7-4。
[0058] 圖12提供的圖表為抗同源免疫H77cA123E2661-his抗原的豚鼠血清的抗體平均 滴度。100 μ g混合組中的抗體平均滴度比30 μ g混合組高約0. 51og，比二聚體組高Ilog, 比單體組高21og。
[0059] 圖13以圖形表示來自直接結合酶免疫測定的數(shù)據(jù)，其顯示出免疫血清對WT和 E2661-his的Λ 123形式的混合物的反應性?？贵w滴度是劑量依賴性的，看起來100 μ g優(yōu)于 30 μ g。與用單體蛋白免疫的動物相比，接受混合和二聚體形式的E2661的動物引發(fā)更高的 抗體平均滴度。
[0060] 圖14提供的圖表中的數(shù)據(jù)表示在固相酶試驗中，免疫血清抑制H77c(基因型la) 和JFHl (基因型2a)WT E2661-his蛋白與重組形式的CD81 (MBP-LEL113-201)的胞外大環(huán)的結 合能力。單體E2661-his免疫的動物引發(fā)的E2-CD81抑制抗體的平均滴度最低。用二聚體 形式免疫的動物引發(fā)的H77c E2-CD81抑制抗體的平均滴度高于單體形式。從用含三聚體 混合物免疫的動物獲得的免疫血清引發(fā)的H77c E2-CD81抑制抗體的平均滴度最高。此外， 即使在較低的30 μ g疫苗劑量下，在所有動物中均觀察到應答，這表明含有E2661-his三聚 體的制劑優(yōu)于單獨的二聚E2 661-his。只有從接受30 μ g或100 μ g E2661-his的二聚體或混 合物的動物中獲得的血清實現(xiàn)了對JFH1E2-⑶81與100 μ g混合物組中獲得80%抑制的所 有動物相互作用的80 %抑制。
[0061] 圖15提供的圖表中的數(shù)據(jù)表示豚鼠血清介導H77c HCVpp的同源中和作用的能 力。介導HCVpp中和作用的能力也為劑量和抗原依賴性的；見單體（A和B)、二聚體（C和D) 和混合型（E和F)。接受30 μ g單體的個體顯示出較差的中和HCVpp的能力，其曲線與對照 無抗原組（G)相似。使用直接針對E2的中和單克隆抗體的陽性對照也示于G中（mab24)。
[0062] 圖16提供的圖表表示豚鼠血清對H77c HCVpp的50%中和平均滴度。接受100μ g 混合抗原的個體引發(fā)的中和平均滴度比那些觀察到的接受100 μ g單體、30 μ g二聚體或 100 μ g二聚體的個體更高約10倍。顯示了 25%和75% (盒）、平均值（線）和平均值的 標準誤差。
[0063] 圖17提供的圖表表示免疫血清介導J6-JFHlHCVcc對單體（A和B)、二聚體（C和 D)、混合制劑（E和F)的交叉中和作用的能力。還運行了無抗原對照和針對E2的中和單克 隆抗體（G和H)。接受100 μ g混合抗原的個體顯示出很強的介導交叉中和作用的能力，在 1/40血清稀釋下，實現(xiàn)90%的進入抑制。
[0064] 圖18提供的圖表表示抗J6-JFHlHCVcc的疫苗組的50%中和平均滴度。觀察到對 100 μ g混合組的平均50%中和滴度比30 μ g和100 μ g單體組高出近21og，比二聚體組和 30 μ g混合組高I log。
[0065] 圖19提供了 E2661_his蛋白的代表性凝膠過濾層析譜。在在Superdex 200pg 26/60制備型凝膠過濾柱上運行蛋白，收集到如圖所示的峰1-4。分子量標準物的洗脫時間 示于層析譜的上方。
[0066] 圖20提供了典型的Δ 123E 2661_his蛋白的凝膠過濾層析譜。在在Superdex 200pg 26/60制備型凝膠過濾柱上運行蛋白，收集到如圖所示的峰1-4。分子量標準物的洗脫時間 示于層析譜的上方。
[0067] 圖21提供了表示WT E2661_his峰1-4的混合級分的凝膠過濾分析曲線。在 Superdex 200PC 3. 2/30柱中運行的各凝膠過濾為疊合狀態(tài)，以顯示出它們的相對洗脫。顯 示了分子大小標記物（size marker)。
[0068] 圖22提供了表示A123E2661_his峰1-4的混合級分的凝膠過濾分析曲線。在 Superdex 200PC 3. 2/30柱中運行的各凝膠過濾為疊合狀態(tài)，以顯示出它們的相對洗脫。顯 示了分子大小標記物。
[0069] 圖23提供了峰1-4的還原SDS-PAGE。將3μ g各E2661-his蛋白加入到10μ 1 4Χ還原樣品緩沖液中。將樣品在70°C加熱3分鐘，并加載至4-12% Bis-Tris_Nu PAGE SDS-PAGE凝膠中。向凝膠罐（tank)的中央部位加入500 μ 1抗氧化劑NuPAGE，然后在200V 下運行。BioRad Precision Plus標準物的遷移示于左側。
[0070] 圖24提供了峰1-4的非還原SDS-PAGE。將3 μ g各E2661-his蛋白加入到10 μ 1 4Χ非還原樣品緩沖液中。將樣品在70°C加熱3分鐘，并加載至4-12%Bis-Tris_Nu PAGE SDS-PAGE凝膠中。BioRad Precision Plus標準物的遷移示于左側。
[0071] 圖25提供了峰1-4的蛋白質印跡分析結果。將0. 5μ g峰1-4的E2661-his加入 到4X還原樣品緩沖液中。還原SDS-PAGE分析按照圖23中的描述進行。然后通過濕轉移 (1小時）將E2 661-his變體轉移到PVDF膜上。將膜用含2%脫脂乳的PBS封閉過夜。加入 用含1 %脫脂乳的0.05 % TBS按1:1000稀釋的一級抗Penta-His抗體。洗滌3次后，加入 用含1 %脫脂乳的〇. 05% TBS進行1:2000稀釋的綿羊抗小鼠 IgG HRP (MiIlipore公司）。 洗滌3次后，根據(jù)制造商的說明，采用ECL Plus免疫印跡檢測試劑使印跡顯影并在520nm 處掃描。BioRad Precision Plus標準物的遷移示于左側。
[0072] 圖26提供了峰1-4的蛋白質印跡分析結果。將0. 5 μ g峰1-4的E2661_his加入到 4X還原樣品緩沖液中。還原SDS-PAGE分析按照圖23中的描述進行。然后通過濕轉移（1 小時）將E2 661-his變體轉移到PVDF膜上。將膜用含2%脫脂乳的PBS封閉過夜。加入用 含1 %脫脂乳的0.05% TBS按1:1000稀釋的一級抗HCV E2抗體。洗滌3次后，加入用含 1%脫脂乳的〇. 05% TBS按1:2000稀釋的綿羊抗小鼠 IgG HRP(Millipore公司）。洗滌3 次后，根據(jù)制造商的說明，采用ECL Plus免疫印跡檢測試劑使印跡顯影并在520nm處掃描。 BioRad Precision Plus標準物的遷移示于左側。
[0073] 圖27提供的圖表表示從用峰1-4WT E2661_his中的一種或未分級的混合物免疫的 豚鼠獲得的免疫血清對同源免疫抗原的反應性。用GNA凝集素（0.5 μ g/ml)包被微量滴定 板，然后用2 μ g/ml的峰1-4中的一種或未分級的混合物進行包被。空白位置用BSA封閉， 然后加入經連續(xù)稀釋的免疫血清。用偶聯(lián)有辣根過氧化物酶的抗豚鼠免疫球蛋白檢測結合 的免疫球蛋白，并用TMB底物進行顯色。
[0074] 圖28提供的圖表表示從用峰1-4Λ 123E2661_his蛋白中的一種或未分級的混合物 免疫豚鼠的獲得的免疫血清對同源免疫抗原的反應性。用GNA凝集素（0.5 μ g/ml)包被微 量滴定板，然后用2 μ g/ml的峰1-4中的一種或未分級的混合物進行包被?？瞻孜恢糜肂SA 封閉，然后加入經連續(xù)稀釋的免疫血清。用偶聯(lián)有辣根過氧化物酶的抗豚鼠免疫球蛋白檢 測結合的免疫球蛋白，并用TMB底物進行顯色。
[0075] 圖29提供的圖表表示從用峰1-4Λ 123E2661_his蛋白中的一種或未分級的混合物 免疫的豚鼠獲得的免疫血清對未分級的基因型la H77c WT和A123E 2661-his抗原的反應 性。用GNA凝集素（0. 5 μ g/ml)包被微量滴定板，然后用2 μ g/ml未分級的H77c WT㈧或 Λ 123 (B)E2661-his抗原進行包被?？瞻孜恢糜肂SA封閉，然后加入經連續(xù)稀釋的免疫血清。 用偶聯(lián)有辣根過氧化物酶的抗豚鼠免疫球蛋白檢測結合的免疫球蛋白，并用TMB底物進行 顯色。
[0076] 圖30提供的圖表表示從用峰1-4WT E2661_his蛋白中的一種或未分級的混合物免 疫的豚鼠獲得的免疫血清抑制同源（H77c，A)和異源（JFH1，B)E2 661之間與⑶81結合的能 力。向IOOng未分級的H77c或JFH1E2661蛋白中加入連續(xù)稀釋的免疫血清，然后添加于包被 有MBP-LEL 113^1的酶免疫分析板。用抗His抗體檢測結合的E2661-his，然后用偶聯(lián)有辣根過 氧化物酶的抗兔免疫球蛋白及TMB底物檢測。計算每只動物用于抑制E2 661和MBP-LEL113 之間50%結合所需的抗體稀釋度。
[0077] 圖31提供的圖表表示從用峰1-4Λ 123E2661_his蛋白中的一種或未分級的混合物 免疫的豚鼠獲得的免疫血清抑制同源（H77c，A)和異源（JFH1，B)E2 661之間與⑶81結合的能 力。向IOOng未分級的H77c或JFH1E2661蛋白中加入連續(xù)稀釋的免疫血清，然后添加于包被 有MBP-LEL 113^1的酶免疫分析板。用抗His抗體檢測結合的E2661-his，然后用偶聯(lián)有辣根過 氧化物酶的抗兔免疫球蛋白及TMB底物檢測。計算每只動物用于抑制E2 661和MBP-LEL113 之間50%結合所需的抗體稀釋度。
[0078] 圖32提供的圖表表示Λ 123E 2661_his豚鼠血清防止肝細胞培養(yǎng)物感染同源HCV 的能力。檢測用峰1-4Λ 123E 2661-his蛋白中的一種或未分級的混合物免疫的豚鼠所引發(fā) 的免疫血清中和含有同源H77c E1E2糖蛋白（H77c HCVpp)的假型逆轉錄病毒顆粒的能力。 將熱滅活的免疫血清用DMFlO進行連續(xù)稀釋，并與等體積的H77c HCVpp在37°C下孵育1小 時，然后加入到前一天以3X IO4細胞/孔接種的Huh 7. 5細胞中。4小時后，去掉病毒血清 混合物，并用培養(yǎng)基更換。3天后，用光度計測定細胞裂解液中熒光素酶活性。IC50滴度計 算為抑制50 %病毒感染所需的免疫血清稀釋度（A)，而IC80滴度為抑制80 %病毒感染所需 的免疫血清稀釋度（B)。
[0079] 圖33提供的圖表表示Λ 123E 2661_his豚鼠血清防止肝細胞培養(yǎng)物感染異源HCV毒 株的能力。檢測用峰l-4A123E2 661-his蛋白中的一種或未分級的混合物免疫的豚鼠所引發(fā) 的免疫血清中和J6/JFH1嵌合細胞培養(yǎng)物（HCVcc)基因型2a的能力。將熱滅活的免疫血 清用DMF10+NEAA進行連續(xù)稀釋，并與等體積的3. 16TCID5(l/ml HCVcc于37°C混合20分鐘。 將血清/病毒混合物施加到前一天以8X IO3細胞/孔接種的Huh 7. 5細胞中，并于37°C孵 育5小時。去掉血清/病毒混合物，并用PBS洗滌4次，然后加入DMF10+NEAA并孵育44小 時。使用海腎熒光素酶底物和光度計測定組織培養(yǎng)液中的熒光素酶活性。IC50滴度計算為 抑制50%病毒復制所需的免疫血清稀釋度（A)，而IC80滴度為抑制80%病毒復制所需的免 疫血清稀釋度（B)。
[0080] 圖34提供的圖表表示在酶免疫測定中WT E2661-his免疫血清對未分級的H77c WT 和Λ 123E 2661抗原的反應性。用GNA凝集素（0. 5 μ g/ml)包被微量滴定板，然后用2 μ g/ml 未分級的H77c WT(A)或Λ123(Β)Ε2661抗原進行包被?？瞻孜恢糜肂SA封閉，然后加入經 連續(xù)稀釋的免疫血清。用偶聯(lián)有辣根過氧化物酶的抗豚鼠免疫球蛋白檢測結合的免疫球蛋 白，用TMB底物進行顯色。
[0081] 圖35提供的圖表表示在酶免疫測定中從用峰1-4H77C WTE2661-his蛋白中的一種 或未分級的E2661-his混合物免疫的豚鼠獲得的免疫血清對異源JFHlWT和Λ 123E 2661-his 抗原的反應性。用GNA凝集素（0. 5 μ g/ml)包被微量滴定板，然后用2 μ g/ml未分級的 JFHlWT(A)或Λ 123⑶E2661-his抗原進行包被。空白位置用BSA封閉，然后加入經連續(xù)稀 釋的免疫血清。用偶聯(lián)有辣根過氧化物酶的抗豚鼠免疫球蛋白檢測結合的免疫球蛋白，用 TMB底物進行顯色。
[0082] 圖36提供的圖表表示野生型E2661_his豚鼠血清防止肝細胞培養(yǎng)物感染同源HCV 的能力。檢測由用峰1-4WT E2661-his蛋白中的一種或未分級的混合物免疫的豚鼠引發(fā)的免 疫血清中和含有同源H77c E1E2糖蛋白（H77c HCVpp)的假型逆轉錄病毒顆粒的能力。將 熱滅活的免疫血清在DMFlO中進行連續(xù)稀釋，并與等體積的H77c HCVpp在37°C下孵育1小 時，然后加入到前一天以3X104個細胞/孔接種的Huh 7.5細胞中。4小時后，去掉病毒血 清混合液，并用培養(yǎng)基更換。3天后，用光度計測定細胞裂解液中熒光素酶的活性。IC50滴 度計算為抑制50 %病毒感染所需的免疫血清稀釋度（A)，而IC80滴度則為抑制80 %病毒感 染所需的免疫血清稀釋度（B)。
[0083] 圖37提供的圖表表示WT E2661_his免疫血清防止肝細胞培養(yǎng)物感染異源HCV毒 株的能力。檢測由用峰1-4WT E2661-his蛋白中的一種或未分級的混合物免疫的豚鼠引發(fā) 的免疫血清中和J6/JFH1嵌合細胞培養(yǎng)物（HCVcc)基因型2a病毒的能力。將熱滅活的免 疫血清在DMF10+NEAA中進行連續(xù)稀釋，并與等體積的3. 16TCID5(l/ml HCVcc于37°C混合20 分鐘。將血清/病毒混合物加入到前一天以8X IO3個細胞/孔接種的Huh 7. 5細胞中，于 37°C孵育5小時。移出血清/病毒混合液，并用PBS洗滌4次，然后加入DMF10+NEAA并孵 育40小時。使用海腎熒光素酶底物和光度計測定組織培養(yǎng)液中熒光素酶的活性。IC50滴 度計算為抑制50%病毒復制所需的免疫血清稀釋度（A)，而IC80滴度則為抑制80%病毒復 制所需的免疫血清稀釋度（B)。
[0084] 圖38提供的圖表表示在酶免疫測定中，WT E2661_his免疫血清對異源Conl (基因 型Ib)野生型和Λ 123E 2661-his抗原的反應性。用GNA凝集素（0. 5μ g/ml)包被微量滴定 板，然后用2 μ g/ml未分級的ConlWT(A)或Λ 123 (B) E2661-his混合物進行包被?？瞻孜恢?用BSA封閉，然后加入連續(xù)稀釋的免疫血清。用偶聯(lián)有辣根過氧化物酶的抗豚鼠免疫球蛋 白檢測結合的免疫球蛋白，用TMB底物進行顯色。
[0085] 圖39提供的圖表表示在酶免疫測定中，Λ 123E 2661_his免疫血清對異源Conl (基 因型lb)WT和Λ 123E2661-his抗原的反應性。用GNA凝集素（0. 5μ g/ml)包被微量滴定板， 然后用2μ g/ml未分級的ConlWT(A)或Λ 123⑶E2661-his混合物進行包被。空白位置用 BSA封閉，然后加入連續(xù)稀釋的免疫血清。用偶聯(lián)有辣根過氧化物酶的抗豚鼠免疫球蛋白檢 測結合的免疫球蛋白，用TMB底物進行顯色。
[0086] 圖40提供的圖表表示在酶免疫測定中，Λ 123E 2661_his免疫血清對異源JFHl (基 因型2a) WT和Λ 123E2661-his抗原的反應性。用GNA凝集素（0. 5 μ g/ml)包被微量滴定板， 然后用2μ g/ml未分級的JFHlWT(A)或Λ 123⑶E2661-his混合物進行包被?？瞻孜恢糜?BSA封閉，然后加入連續(xù)稀釋的免疫血清。用偶聯(lián)有辣根過氧化物酶的抗豚鼠免疫球蛋白檢 測結合的免疫球蛋白，用TMB底物進行顯色。
[0087] 表1列出了豚鼠疫苗受試組（1至7)和抗原類型、抗原量、佐劑及各組中以與實施 例3所述相同方式接受免疫的個體數(shù)量。

【具體實施方式】
[0088] 本發(fā)明不限定特定的試劑篩選方法，因此試劑的具體配方和各種醫(yī)療方法，因為 它們可以變化。
[0089] 除非另有定義，本發(fā)明中使用的所有技術和科學術語與本發(fā)明所屬領域的 普通技術人員所通常理解的具有相同的含義。任何與本發(fā)明中所述的那些相類似或 相同的材料和方法，都可用于實施或驗證本發(fā)明。對于本領域的定義和術語以及本 領域技術人員已知的其他方法，特別是從業(yè)人員可參考Sambrook et al. ,1989(同 上),Coligan et al. , Current Protocols In Protein Science, John Wiley & Sons, Inc. , 1995-1997,特別是第 1、5 和 6 章，和 Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 47,John Wi ley & Sons,New York, 1999 ； Colowick and Kaplan,eds. , Methods In Enzymologyj Academic Press,Inc. ；Weir and Blackwell,eds. , Handbook of Experimental Immunology，Vols. I-IV，Blackwell Scientific Publications，1986 ;Joklik ed. , Virology, 3rd Edition, 1988 ；Fields and Knipe，eds，F(xiàn)undamental Virology, 2nd Edition,1991 ；Fields et al. , eds, Virology, 3rd Edition，Lippincott-Raven，Philadelphia，Pa, 1996。
[0090] 本發(fā)明提供了一種包含丙型肝炎病毒（HCV)包膜糖蛋白2(E2)的組合物，其中基 本上耗盡了所述HCV E2糖蛋白的HCV E2單體。本發(fā)明中使用的短語"基本上耗盡E2單 體"或"基本上單體耗盡的HCVE2"是指組合物包含低于30%、29%、28%、27%、26%、25%、 24%,23%,22%,21 %,20%U9%U8%U7%U6%U5%U4%U3%U2%U1 %>!0%> 9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或低于1%的E2單體（按重量計）。
[0091] 術語"HCV E2糖蛋白"、"E2糖蛋白"、"E2二聚體"、"E2三聚體"或"E2"、"E2單體"、 "HCV E2"等，包括來自HCV任何基因型或分離株（isolate)的E2糖蛋白。該術語還包括非 天然存在的變體，包括全長E2糖蛋白的某些部分，包括例如介導受體結合或介導一個或多 個識別構象和/或其他表位的抗體的中和抗體結合的部分，或調解E1E2二聚體形成的那些 部分。
[0092] 在一些實施方案中，單體形式的HCV E2比例按重量計低于15%、14%、13%、 12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0· 5%或 0· 1%。
[0093] 基本上單體耗盡的HCV E2糖蛋白可以是通過重組或合成方法制備的糖蛋白。
[0094] 在一個具體實施方案中，組合物基本不含單體HCV E2,其含有低于1 %或低于 0. 1% 的單體 HCV E2。
[0095] 在另一個方面，基本上單體耗盡的HCV E2組合物富含HCV E2的三聚和更高級的 形式，且該組合物所包括的組合物制劑具有大于70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、 77 %,78 %,79 %,80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %, 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%(按重量計）的三聚和高級形式的HCVE2 糖蛋白。
[0096] 本發(fā)明中使用的短語HCV E2糖蛋白的"高級形式"是指E2蛋白具有4個或4個 以上的E2蛋白亞單位的形式。已知這種形式為四聚體（4)、五聚體（5)、六聚體￠)、七聚體 (7)、八聚體（8)、九聚體（9)、十聚體（10)聚體（11)、十二聚體（12)、十三聚體（13)、 十四聚體（14)、十五聚體（15)、十六聚體（16)、十七聚體（17)、十八聚體（18)、十九聚體 (19)、二十聚體（20)、21_聚體（mer)、22-聚體、23-聚體等。
[0097] 在一個相關的方面，基本上單體耗盡的HCV E2組合物富含三聚HCV E2,且該組 合物所包括的組合物制劑具有大于70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、 79 %,80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %, 94%、95%、96%、97%、98%或99%(按重量計）的三聚!10^2糖蛋白。
[0098] 在另一個方面，基本上單體耗盡的HCV E2組合物富含二聚HCVE2,且該組合物所 包括的組合物制劑具有大于 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、 80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %, 95%、96%、97%、98%或99%(按重量計）的二聚HCVE2糖蛋白。
[0099] 在另一個方面，所述組合物基本上包含HCV E2三聚體。在另一個方面，所述組合 物基本上包含HCV E2三聚體和更高級的形式。在另一個方面，所述組合物基本上包含HCV E2的更高級形式。
[0100] 基本上包含三聚HCV E2的組合物所包括的組合物制劑具有大于80%、81%、 82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %, 97%、98%或99% (按重量計）的E2三聚體。
[0101] 基本上包含HCV E2的三聚體和更高級形式的組合物所包括的組合物制劑具有大 于 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%或99% (按重量計）的E2三聚體和更高級形式。
[0102] 基本上包含HCV E2的更高級形式的組合物所包括的組合物制劑具有大于80%、 81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %, 96%、97%、98%或99% (按重量計）的E2的更高級形式。
[0103] 測定制劑中各E2單體、二聚體和三聚體及高級形式的重量百分比或比例的方法 如所描述的或為本領域技術人員所已知的。
[0104] 在一個實施方案中，E2糖蛋白基本上為HCV E2三聚體或更高級的形式。
[0105] 包含HCV E2三聚體或更高級形式的組合物所包括的組合物制劑具有大于約 80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %, 95%、96%、97%、98%或99% (按重量計）的E2三聚體和更高級的形式。
[0106] 在一些實施方案中，E2糖蛋白基本上為HCV E2三聚體。
[0107] 基本上包含HCV E2三聚體的組合物所包括的組合物制劑具有大于約80%、81 %、 82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %, 97%、98%或99% (按重量計）的E2三聚體。
[0108] 在一些實施方案中，E2糖蛋白基本上為HCV E2二聚體。
[0109] 基本上包含HCV E2二聚體的組合物所包括的組合物制劑具有大于約80%、81 %、 82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %, 97%、98%或99% (按重量計）的E2二聚體。
[0110] 在一些實施方案中，E2糖蛋白基本上為HCV E2二聚體和E2三聚體。包含基本上 HCV E2二聚體和三聚體形式組合物所包括的制劑具有大于70%、75%、80%、85%、90%、 95%、97%或99% (按重量計）的E2二聚體和三聚體，和/或所包括的制劑具有低于30%、 29%,28%,27%,26%,25%,24%,23%,22%,21 %,20%U9%U8%U7%U6%U5%, 14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或低于1%的E2單 體（按重量計）。
[0111] 在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物可通過消耗HCV E2糖蛋白混合物中的單體或 通過富集二聚和/或三聚E2和/或更高級的形式而獲得。在一些實施方案中，消耗單體和 /或富集二聚體和/或三聚體E2和/或更高級形式。
[0112] 在另一個實施方案中，基本上單體耗盡的HCV E2組合物還包含藥學上或生理上可 接受的載體或稀釋劑。
[0113] 在另一個實施方案中，所述基本上單體耗盡的組合物還包含佐劑。如果作為與一 種或多種佐劑的混合物給藥，可增強個體對免疫原的應答。免疫佐劑通常以下述方式中的 一種或多種發(fā)揮作用：（1)免疫調節(jié)（2)增強呈遞（3)產生CTL(4)靶向；和/或（5)產生 C：庫（depot generation)。示例性佐劑包括：粒狀或非粒狀佐劑、完全弗氏佐劑（CFA)、 鋁鹽、乳劑、ISCOMS、LPS衍生物如MPL以及其衍生物如3D，來自于分枝桿菌的蛋白如胞 壁酰二肽或三肽，特別是來自皂樹（Quillaja saponaria)的皂苷，如QS21和ISC0PREP? 皂苷，ISC0MATRIX?佐劑，以及肽如胸腺素 α?。有關佐劑的詳細說明可參見Cox and Coulter，''Advances in Adjuvant Technology and Application"，in Animal Parasite Control Utilizing Biotechnology，Chapter 4, Ed. Young, W. K. , CRC Press 1992, and in Cox and CoulterjVaccine 15 (3):248-256,1997〇
[0114] 可按照常規(guī)藥物配置技術來方便地制備藥物組合物。參見例如， Remington's Pharmaceutical Sciences(雷明頓藥物學），18th Ed.，Mack Publishing, Company, Easton, PA, U. S. A.，1990。除了一種活性物質之外，這些組合物還可 包含藥學上可接受的賦形劑、載體、緩沖液、穩(wěn)定劑或本領域中公知的其他材料。這樣的材 料應該是無毒的，且不應該干擾活性成分的功效。所述載體可以采用各種各樣的形式，這取 決于給藥如靜脈內、口服或非腸道給藥所需的制劑形式。
[0115] HCV E2糖蛋白的一個示例性形式是包含基因型H771a(E2661)的第384-661位氨 基酸的E2糖蛋白的受體結合部分或來自其他另一 HCV基因型的相應部分。
[0116] 在一些實施方案中，HCV E2糖蛋白所包含的氨基酸序列或結構基本上與天然存在 的HCV變體相似。例如，E2蛋白可基本上與本領域中已知的一種或多種分離株，如JFH-1、 C0Nl、H77c或ED43分離株的氨基酸序列相似，或它們可基本上與由基因型1-6中的一種或 其片段所表達的E2糖蛋白中的一種或多種相似。
[0117] 在其他實施方案中，HCV E2糖蛋白是天然存在的HCV E2糖蛋白的變體，其結合宿 主細胞受體和/或包含通過中和表位或構象表位而識別的一個或多個表位。變體的一種形 式為天然存在的毒株（strain)或其非培養(yǎng)變體的截短形式或片段。示例性片段包括受體 結合結構域。其他修飾的HCV E2糖蛋白包括它們的突變體、類似物或衍生物。
[0118] 可選地或另外，在一些實施方案中，HCV E2糖蛋白在一個或多個可變區(qū)中包含突 變，如缺失突變。示例性突變公開于國際公開W02008/022401，其通過引用全文并入于此。 如本發(fā)明中所確定的，包含或缺少三個可變區(qū)的E2糖蛋白能夠形成功能性受體結合二聚 體和/或三聚體，并抑制病毒進入受納的宿主細胞。
[0119] 在一個實施方案中，E2蛋白為E2661 A123(AHVR123,在本發(fā)明中又稱Λ123、 D123、AHVRl+2+3、D123E2661-his、D123E 2661、Λ 123E 2661 和 Λ 123E2661-his)。在一些實施方 案中，Ε2661 Λ123Ε2包含HCV H77c的第384-661位氨基酸，其中可變區(qū)1和2及igVR(3) 被短連接體基序（ΛHVR123)替代。本發(fā)明的其他實施方案所包括的HCV E2蛋白具有缺失 或被短連接體取代的HVRUHVR2或igVR的任何組合?？蓪⑺鼈兒喎Q為Λ 1、Λ 1，2 ( Λ 12)、 Λ 2、Λ 2, 3 ( Λ 23)、Λ 3 和 Λ 1，3 ( Λ 13)。
[0120] 本發(fā)明還提供了用于在個體或患者體內引起免疫應答的方法，該方法包括向所述 個體或患者施用有效量的包含基本上單體耗盡的HCV Ε2的組合物。本發(fā)明還考慮了一種 組合物，特別是一種用于免疫個體抗丙型肝炎病毒感染的包含基本上單體耗盡的HCV Ε2的 疫苗組合物。
[0121] 本發(fā)明中使用的術語"疫苗"是指包含至少一種可在個體內誘導免疫應答的免疫 活性成分以及可能但非必需的一種或多種增強所述活性成分免疫活性的附加組分（例如 佐劑）的藥物組合物。疫苗還可包含對藥物組合物而言典型的其他成分。疫苗的免疫活性 成分包含基本上單體耗盡的HCV Ε2組合物。在本發(fā)明中，術語"疫苗"和"疫苗組合物"可 以互換使用。
[0122] 本發(fā)明中述及的"個體"是指人或動物，包括實驗室或本領域接受的試驗或載體動 物（vehicle aminal)。"患者"包括需要接受治療或預防的人類個體。
[0123] 在一些實施方案中，提供了用于免疫個體抗HCV感染的組合物，特別是疫苗組合 物，包含基本上二聚或基本上三聚HCV E2,或二聚和三聚HCV E2糖蛋白的混合物，或HCV E2 的三聚和更高級形式的混合物，或HCV E2的二聚、三聚和更高級形式的混合物或HCVE2的 更高級形式。
[0124] 在另一個方面，本發(fā)明提供了包含基本上二聚或三聚和/或更高級形式的HCV E2 糖蛋白的組合物，用于在人或動物中引發(fā)抗體和/或細胞免疫應答。
[0125] 由真核細胞表達的重組HCV E2糖蛋白通常以單體、二聚體、三聚體和更高級形式 的混合物形式存在。HCV E2可在真核或原核細胞中表達。真核細胞包括本領域已知的哺乳 動物細胞、植物細胞、酵母細胞和昆蟲細胞。將宿主細胞培養(yǎng)一段時間其足以使宿主細胞表 達重組蛋白，更優(yōu)選地，將蛋白分泌至宿主細胞生長的培養(yǎng)基中，從而制備所述蛋白。
[0126] "重組宿主細胞"、"宿主細胞"、"細胞"、"細胞系"、"細胞培養(yǎng)物"，和其他表示作為 單細胞培養(yǎng)的原核微生物或真核細胞系的類似術語，可以互換使用，并指可以或已經用作 重組載體或其他轉移DNA的受體且包括已被轉染的原始細胞的后代的細胞。
[0127] 合適的哺乳動物細胞系包括但不限于：BHK、VERO、HT1080、293、293T、293F、RD、 COS-7、CHO、Jurkat、HUT、SUPT、C8166、M0LT4/ 克隆 8、MT-2、MT-4、H9、PM1、CEM、骨髓瘤細 胞（如SB20細胞）和CEMX174,可以從例如ATCC獲得。其他宿主細胞包括但不限于酵母， 例如巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris)，或昆蟲細胞，如Sf9細胞。
[0128] 通過分子克隆到含有適當?shù)膯幼雍推渌m當?shù)霓D錄調控元件的表達載體中， 并轉入原核或真核宿主細胞中從而產生重組蛋白，可以重組表達合成的DNA。此類操作技 術描述于 Sambrook et al. , Molecular Cloning:A Laboratory Manual (2nd ed.)(分子 克?。簩嶒炇沂謨裕?Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY, 1989; Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, Green Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York, 1988。
[0129] 例如，用于在酵母中表達的構建體優(yōu)選含有合成的基因，同時與相關的轉錄和翻 譯調控序列可操作地連接，如啟動子（如GAL10、GAL7、ADH1、TDH3或PGK)，和終止序列（如 釀酒酵母（S. cerevisiae) ADHl終止子）。酵母可以選自下組：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、漢遜酵母（Hansenula polymorpha)、巴斯得畢赤酵母（Pichia pastoris)、脆 壁克魯維酵母（Kluyveromyces fragilis)、乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces Iactis)和 粟酒裂殖酵母菌（Schizosaccharomyces pombe)。參見 Yeast Genetics:Rose et al·，A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. ,1990。本領域已知可以對在酵母中表達的核酸分子進行密碼子優(yōu)化（見Sharp and Cowe，Yeast, 7:657-678, 1991)。對于任何給定的細胞類型，本領域的普通技術人員可以按 照有關表達載體的本說明書的教導和本領域已知的信息來選擇合適的載體和調控元件。
[0130] 可用于在宿主細胞系中克隆和表達的載體是本領域公知的，并且包括但不限于： 用于在哺乳動物細胞系或酵母（真菌）細胞中克隆和表達的載體，用于在細菌細胞系中克 隆和表達的載體，用于在噬菌體中克隆和表達的載體，以及用于在昆蟲細胞系中克隆和表 達的載體。可使用標準的蛋白純化方法回收所表達的蛋白。
[0131] 翻譯調控兀件參見 M. Kozak (e. g.，Kozak, Mamm Genome, 7 (8) : 563-74, 1996 ;Kozak ，Biochimie. ,76(9):815-21, 1994 ;Kozak，J Cell Biol, 108(2):229-241, 1989 ;Kozak and Shatkin，Methods Enzymol，60:360-375, 1979)。
[0132] 可以使用以下文獻所述的標準方法方便地制備重組糖蛋白，例如，Sambrook, et al.，1989 (同上），特別是第 13、16 和 17 章 ；Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons Inc, 1994,特別是第 10 和 16 章；以及 Coligan et al. ,1995-1997(同上），特別是第1、5和6章。多肽或多核苷酸可以通過化學合成 來合成，例如，使用溶液合成或固相合成，其描述于Atherton and Shephard, Peptide Synthesis. In Nicholson ed. , Synthetic Vaccines, published by Blackwell Scientific Publications, and in Roberge et al·，Science, 269 (5221) :202-204, 1995 第 9 章中。
[0133] 本發(fā)明還提供了一種用于免疫個體抗丙型肝炎病毒感染的方法，該方法包括向所 述個體施用包含基本上單體耗盡的HCV E2的組合物。
[0134] 在一個相關的實施方案中，本發(fā)明還提供了一種用于治療個體的丙型肝炎病毒感 染的方法，該方法包括向所述個體施用包含基本上單體耗盡的HCV E2的組合物。
[0135] 本發(fā)明還提供了一種在個體或患者體中引發(fā)體液或細胞介導的免疫應答的方法， 該方法包括向所述個體或患者施用有效量的包含基本上單體耗盡的HCV E2的組合物。
[0136] 根據(jù)這些實施方案，通常是在足以引發(fā)免疫應答的條件下，包括產生E2特異性抗 體，施用一段時間的所述組合物。本發(fā)明的組合物可以作為單劑量或應用（applications) 施用?；蛘撸摻M合物可包括重復劑量或應用，例如，該組合物可以施用2、3、4、5、6、7、8、9、 10次或更多次。
[0137] 本發(fā)明所考慮的接種治療方案的實例如下：初次接種后，個體一般在2至4周的間 隔，例如3周間隔后接受加強免疫（boost)，隨后任選地重復加強免疫。在本發(fā)明的一個具 體實施方案中，提供單劑量的接種計劃，由此單劑量的該組合物足以提供抗丙型肝炎的保 護，從而在初次接種后無需任何加強免疫。
[0138] 在一些實施方案中，所產生的抗基本上單體耗盡的HCV E2抗體，包括那些至少部 分中和HCV生命周期的某個重要部分，如宿主細胞入侵或病毒出芽的那些抗體。本發(fā)明還 涉及基本上單體耗盡的HCV E2在用于治療或預防HCV感染或在制備用于治療或預防HCV 感染的藥物中的應用。本發(fā)明還包括人源化和去免疫抗體。術語"制備"包括生產或篩選。
[0139] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種在個體或患者中引發(fā)體液或細胞介導的 免疫應答的方法，該方法包括向所述個體施用有效量的包含基本上二聚和/或三聚和/或 更高級形式的HCV E2的組合物。
[0140] 在一個相關的實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于治療個體的丙型肝炎感染或免 疫個體抗丙型肝炎感染的方法，該方法包括向所述個體施用有效量的包含基本上二聚和/ 或三聚和/或更高級形式的HCVE2的組合物。
[0141] 在一些實施方案中，本發(fā)明提供了一種篩選治療抗體或其他治療結合劑的方法， 包括篩選這樣的抗體或試劑，其（i)能夠結合一種或多種二聚或三聚或更高級形式的HCV E2,和/或（ii)不結合單體HCV E2。
[0142] 本發(fā)明中使用的術語"有效量"包括"治療有效量"和"預防有效量"，表示在一些 個體中提供所需治療、預防或生理效應的本發(fā)明的組合物足夠量，無論是以單劑量或是作 為連續(xù)或緩釋系統(tǒng)的一部分。不良影響，例如副作用，有時會隨著治療效果出現(xiàn)；因此，從業(yè) 人員在確定一個適當?shù)?有效量"時平衡潛在的益處及潛在的風險。所需的組合物的確切 量可由不同個體而異，取決于個體的種類、年齡和總體條件、給藥方案等。因此，不可能指定 確切的"有效量"。然而，在任何個別情況下，合適的"有效量"可以由本領域普通技術人員 采用常規(guī)的技能或實驗來確定。本領域的普通技術人員將能夠根據(jù)如事先施用的組合物或 其他試劑、個體的體重、個體癥狀的嚴重程度或感染群體癥狀的嚴重程度、病毒負載以及具 體的組合物或選擇的給藥途徑等因素來確定所需的用量。
[0143] 術語"治療"是指對于至少一些個體的一種或多種HCV癥狀或發(fā)展成為HCV晚期 癥狀的風險或發(fā)生HCV傳播風險的可測量的或統(tǒng)計學上顯著的改善。
[0144] 術語"預防（prevention) "和"預防（prophylaxis) "等可互換使用，包括向未知 將感染HCV的個體施用本發(fā)明的組合物，以預防或減輕后續(xù)感染或降低感染的風險或降低 HCV感染相關病癥或病癥的病征的嚴重性或發(fā)作。
[0145] 疫苗組合物給藥一般是出于預防目的。該組合物的預防給藥是為了預防或減輕任 何后續(xù)感染。"藥學上可接受"的組合物是能夠被受試患者耐受的組合物。考慮了施用有效 量的疫苗。"有效量"是指實現(xiàn)所需生物效應的足夠的量，如誘導足夠的體液或細胞免疫。 這可能取決于疫苗的種類、受體的年齡、性別、健康和體重。所需生物效應的實例包括但不 限于：沒有癥狀產生，癥狀減輕，組織或鼻腔分泌物中的病毒滴度下降，抗丙型肝炎病毒感 染的完全保護，抗丙型肝炎病毒感染的部分保護。
[0146] 在一些實施方案中，如果本發(fā)明的疫苗或組合物的存在導致受試患者生理機能的 可檢測的變化，所述變化增強抗至少一種感染性丙型肝炎病毒株的至少一個初次或再次體 液或細胞免疫應答或顯示出所述應答的增強，則本發(fā)明的疫苗或組合物是生理學上顯著 的。施用疫苗組合物以防止病毒感染。"保護"不一定是絕對的，即，如果與對照群體或患者 組相比，統(tǒng)計學上有顯著改善，則丙型肝炎感染不必完全預防或根除。保護可能是限于降低 丙型肝炎病毒感染的嚴重性或癥狀的迅速發(fā)作。
[0147] 在一個實施方案中，在感染發(fā)生之前（以預防或減低預期的感染）或在感染發(fā)生 之后，將本發(fā)明的疫苗組合物提供給個體，從而防止病毒感染。在一些實施方案中，在感染 前或感染發(fā)作后將本發(fā)明的疫苗組合物提供給個體，以減低病毒在個體間的傳播。
[0148] 還應當理解，本發(fā)明的組合物可作為唯一的活性藥劑給藥，或與一種或多種藥劑 組合使用，用于治療或預防丙型肝炎感染或與HCV感染有關的癥狀。與組合物聯(lián)合給藥的 其他試劑或本發(fā)明的組合物的組合包括，用于治療由HCV感染引發(fā)的疾病或通過直接或間 接機制抑制HCV病毒的復制。這些藥劑包括但不限于：宿主免疫調節(jié)劑（例如，α -干擾素、 聚乙二醇化的α-干擾素、復合干擾素、β-干擾素、Y-干擾素、CpG寡核苷酸等）；抑制宿 主細胞功能的抗病毒化合物，如肌苷一磷酸脫氫酶（例如，利巴韋林等）；調節(jié)免疫功能的 細胞因子（如白細胞介素2、白細胞介素6和白細胞介素12);增強1型輔助性T細胞應答 的化合物；干擾RNA ;反義RNA ;包含HCV抗原或針對HCV抗原佐劑組合的疫苗；與宿主細胞 成分發(fā)生相互作用的試劑，其通過抑制啟動HCV病毒復制的翻譯步驟的內部核糖體進入位 點（IRES)從而阻斷病毒蛋白合成，或用靶向膜蛋白家族的病毒膜蛋白如HCV Ρ7等的試劑 來阻止病毒粒子成熟和釋放；以及任何試劑或試劑組合，所述試劑通過靶向病毒基因組中 參與病毒復制的其他蛋白來抑制HCV復制，和/或干擾其他病毒靶標的功能如NS3/NS4A蛋 白酶抑制劑、NS3解旋酶抑制劑、NS5B聚合酶抑制劑、NS4A蛋白抑制劑和NS5A蛋白抑制劑。
[0149] 根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明的藥物組合物還包含HCV生命周期中靶標的其他抑 制劑，所述革巴標包括但不限于：解旋酶、聚合酶、金屬蛋白酶、NS4A蛋白、NS5A蛋白和內部核 糖體進入位點（IRES)。
[0150] 給藥通常是在足以引起免疫應答的條件下，包括產生E2特異性抗體或細胞免疫 應答，持續(xù)一段時間。免疫原性組合物可采用便利的方式進行給藥，例如，通過肺、口服、靜 脈（其為水溶性的）、腹膜內、肌內、皮下、皮內、鞘內或栓劑途徑或植入（例如，使用緩釋制 劑）。給藥可以是全身或局部，盡管全身給藥更方便?？紤]的其他給藥途徑為通過貼劑、細 胞轉移（cellular transfer)、植入、舌下、眼內、局部、口服、直腸、陰道、鼻或透皮。
[0151] 本發(fā)明中使用的"免疫應答"是指身體作為一個整體對本發(fā)明組合物存在的反應， 包括針對該組合物產生抗體和發(fā)展免疫力。因此，對抗原的免疫應答還包括針對目標抗原 在個體中形成體液和/或細胞免疫應答。"體液免疫應答"受漿細胞所產生的抗體介導。"細 胞免疫應答"是T淋巴細胞和/或其他白細胞所介導的免疫應答。
[0152] 本發(fā)明中使用的"抗體滴度"可以被定義為對于每個個體，導致比免疫前的樣品更 大的值的免疫后血清的最高稀釋度。
[0153] 本發(fā)明的實施方案還提供用于評價對從基本上單體耗盡的HCVE2中分離出的組 分的免疫應答的試驗。該試驗可包括體內試驗，如測定抗體應答和遲發(fā)型超敏反應試驗。在 一個實施方案中，測定抗體應答的試驗主要是測定B細胞功能以及B-細胞/T-細胞之間相 互作用。對于抗體應答試驗，可比較抗原激發(fā)后血液中的抗體滴度?？筛鶕?jù)抗體的類型進 行級別定量，例如，IgG、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA或IgD。此外，可通過測定無抗原 刺激下血液中的抗體和淋巴細胞水平來評價免疫系統(tǒng)的發(fā)展。
[0154] 所述試驗還可包括體外實驗。體外實驗可包括測定細胞分裂能力，或幫助其他細 胞分裂的能力，或釋放淋巴因子和其他因子的能力，表達激活標志物的能力以及裂解靶細 胞的能力?？稍隗w外實驗中比較小鼠和人的淋巴細胞。在一個實施方案中，對類似來源的 淋巴細胞，如外周血細胞、脾細胞或淋巴結細胞進行比較。然而，比較不同來源的淋巴細胞 是可能的，如非限制性的例子是，人類的外周血細胞和小鼠的脾細胞。對于體外試驗，細胞 可以是純化的（如B細胞、T細胞和巨噬細胞），或保持它們的天然狀態(tài)（例如，脾細胞或淋 巴結細胞）。純化可以采用能夠達到期望結果的任何方法?？墒褂糜薪z分裂原或特異性抗 原進行體外試驗來測定細胞的增殖能力。可使用混合的淋巴細胞反應（MLR)試驗來測定細 胞在特定抗原存在下的分裂能力?？蓹z測培養(yǎng)細胞的上清液來定量細胞分泌特定淋巴因子 的能力。從培養(yǎng)物中移走細胞，并測試它們表達激活抗原的能力。這可通過如同在利用抗 體或配體以及探針的非限制性實例中一樣的任何合適方法進行，所述抗體或配體結合激活 抗原，所述探針結合編碼所述激活抗原的RNA。
[0155] 此外，在一個實施方案中，可進行細胞表型檢測試驗來確定某些類型的細胞頻率。 可進行外周血白細胞計數(shù)來確定血液中淋巴細胞或巨噬細胞的數(shù)量?？贵w可用于篩選外周 血淋巴細胞，以確定表達某些抗原的細胞百分比，如測定⑶4細胞計數(shù)和⑶4/⑶8的比值的 非限制性實例中一樣。
[0156] 根據(jù)這些實施方案，一般在足以引起免疫應答的條件下，包括E2特異性抗體或 細胞免疫應答的產生，施用所述組合物一段時間。本發(fā)明的組合物可作為單劑量或應用 (applications)給藥。另外，該組合物可包括重復劑量或應用，例如，該組合物可以施用2、 3、4、5、6、7、8、9、10 次或更多次。
[0157] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于制備抗基本上單體耗盡的HCV E2組 合物的抗體的方法，包括向個體注射免疫有效量的基本上單體耗盡的HCV E2組合物，并分 離和純化所產生的抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了純化的針對基本上單體耗盡 的HCVE2而產生的抗體。
[0158] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了針對基本上單體耗盡的HCVE2形式而產生的 抗體。在一些實施方案中，抗體對存在于三聚或二聚或更高級形式，或HCV E2糖蛋白的三 聚和二聚形式，或HCV E2糖蛋白的三聚和更高級形式中的表位是特異的，并能夠區(qū)分HCV E2的單體、二聚、三聚和更高級形式，或者區(qū)分HCV E2的二聚/三聚形式。
[0159] 抗體可以是多克隆或單克隆的。另外，篩選的抗體可用于診斷、預后、治療、預防和 篩選目的，通常使用的標準是相關領域的技術人員已知的。
[0160] 術語"抗體（antibody) "、"抗體（antibodies) "包括多克隆抗體和單克隆抗體和 來自于單克隆抗體的各種形式，包括但不限于：全長抗體（例如，具有完整Fc區(qū)），抗原結 合片段，包括例如Fv、Fab、Fab'和F (ab'）2片段；以及使用重組方法產生的抗體來源的多 肽，如單鏈抗體。本發(fā)明中使用的術語"抗體（antibody)"和"抗體（antibodies)"是指例 如在轉基因動物中或通過噬菌體展示所產生的人抗體，以及抗體、人或人源化抗體、靈長類 源化抗體或去免疫抗體。還包括治療上可接受的其他形式的抗體和它們的抗原結合片段， 例如來自于軟骨海洋動物或駱駝的單結構域抗體，或基于這些抗體的庫?？贵w片段或其修 飾形式的篩選還要考慮到所述抗體片段或其修飾形式對所述抗體或其片段的半衰期的任 何影響。
[0161] 在一些實施方案中，提供了抗體與藥學上或藥理學上可接受的載體、稀釋劑或賦 形劑。
[0162] 在另一些實施方案中，篩選出用于診斷或預后的抗體。在一些實施方案中，提供了 包含抗HCV E2糖蛋白三聚體或抗二聚體或抗更高級形式的抗體的試劑盒。
[0163] "藥學上可接受的載體和/或稀釋劑"是指由這樣的材料構成的藥物媒介，所述材 料不是在其他方面不良的，即所述材料自身或與活性組合物一起不會引起主要不良反應。 載體可以包括所有的溶劑、分散介質、包被物、抗細菌和抗真菌劑，用于調節(jié)張力、提高或 降低吸收或清除速率的試劑，維持pH值的緩沖液，螯合劑，膜或屏障跨越劑（membrane or barrier crossing agent)。藥學上可接受的鹽是指不是在其他方面不良的鹽。所述試劑 或包含所述試劑的組合物可以以藥學上可接受的非毒性鹽的形式施用，如酸加成鹽或金屬 配合物。
[0164] 對于口服給藥，可以將組合物配制成固體或液體制劑，如膠囊劑、丸劑、片劑、錠 齊IJ、粉劑、懸浮劑或乳劑。在制備口服劑型的組合物時，可以采用任何常用的藥物介質，例 如，在口服液體制劑（如懸浮劑、酏劑和溶液）的情況下，使用水、乙二醇、油、醇、調味劑、防 腐劑、著色劑、懸浮劑等，或者在口服固體制劑（如粉劑、膠囊和片劑）的情況下，使用載體 如淀粉、糖、稀釋劑、造粒劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑等。由于其易于給藥，片劑和膠囊代表 最有利的口服劑量單位形式，在這種情況下，顯然使用固體藥物載體。片劑可含有粘合劑如 黃蓍膠、玉米淀粉或明膠，崩解劑如藻酸，以及潤滑劑如硬脂酸鎂。如果需要，可采用標準技 術對片劑進行糖包衣或腸溶包衣?？蓪⒒钚越M合物包入膠囊中，使其穩(wěn)定地通過胃腸道。例 如，參見國際專利公開WO 96/11698。
[0165] 對于非腸道給藥，可將該組合物溶解于載體中，并作為溶液或懸浮劑給藥。對于經 粘膜或經皮（包括貼劑）遞送，使用本領域中已知的適當?shù)臐B透劑遞送所述組合物。對于吸 入，遞送使用任何便利的系統(tǒng)，如干粉氣霧劑、液體遞送系統(tǒng)、噴氣噴霧器、推進劑系統(tǒng)。例 如，所述制劑可以以氣溶膠或噴霧形式施用。所述組合物也可以是持續(xù)遞送或緩釋模式遞 送。例如，能夠持續(xù)遞送的可生物降解的微球或膠囊或其他聚合物構型可包括于所述制劑 中。可以修飾制劑來改變藥代動力學和生物分布。對于藥代動力學的一般討論,參見例如， Remington's Pharmaceutical Sciences (雷明頓藥物學），1990 (同上）。在一些實施方案 中，可將所述制劑整合至單層或雙層脂質中，如脂質體或微膠粒?？梢允褂帽绢I域中已知的 靶向療法，來將所述藥劑更特異地遞送到特定類型的細胞或組織。
[0166] 所施用活性劑的實際用量、給藥速率和時程應取決于疾病的性質和嚴重程度。治 療處方，對例如劑量、時間等的決定，是在普通從業(yè)人員或專家的責任內，并考慮到個體患 者的疾病狀況、遞送位點、給藥方法及從業(yè)人員所知的其他因素。技術和操作的實例可見于 Remington's Pharmaceutical Sciences (雷明頓藥物學），1990 (同上）。
[0167] 可以制備的緩釋制劑對于誘導免疫應答特別方便。緩釋制劑的實例包括含有所述 多肽的固體疏水性聚合物的半透性基底，所述基底是成型制品的形式，例如，膜或微膠囊。 緩釋基底的實例包括：聚酯、水凝膠（例如，聚（2-羥乙基-甲基丙烯酸酯）或聚（乙烯 醇））、聚乳酸、L-谷氨酸與乙基-L-谷氨酸的共聚物、非降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的 乳酸-乙醇酸共聚物，以及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。盡管聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳 酸-羥基乙酸，能夠在100天內釋放分子，然而某些水凝膠可在較短時間內釋放蛋白質。可 以使用脂質體，為?。s200-800埃）單層脂質類型的脂質體，其中脂質含量比膽固醇高出 約30%，可調整所選擇的比例以用于最佳治療。
[0168] 可以通過修飾巰基殘基，從酸性溶液中冷凍干燥，控制水分含量，使用適當?shù)奶砑?齊IJ，以及開發(fā)具體聚合物基底組合物來穩(wěn)定蛋白質。可使用本領域中已知的技術，包括，例 如，通過連接其他成分，如聚乙二醇（PEG)基團，延長蛋白質在體內的半衰期。
[0169] 考慮了本領域所公開的初免-加強免疫（Prime-boost immunization)策略。例 如，參見國際公開W0/2003/047617。因此，組合物可以是疫苗、引劑發(fā)或加強劑（boosting agent)的形式。
[0170] 在另一個方面，本發(fā)明提供了利用基本上單體耗盡的HCV E2的篩選方法。涉及基 本上單體耗盡的HCV E2的篩選方法旨在鑒定結合分子。通常使用本領域公認的方法分離 和篩選結合分子，如抗體或抗原結合片段、配體、肽、有機或無機分子。
[0171] 本發(fā)明還提供了基本上單體耗盡的HCV E2在診斷或監(jiān)測HCV感染或者監(jiān)測抗HCV 療法中或者在制備用于診斷或監(jiān)測HCV感染或者監(jiān)測抗HCV療法的診斷試劑中的應用。
[0172] 本發(fā)明提供了用于制備純化的針對基本上單體耗盡的HCV E2組合物的抗體的方 法，該方法包括向個體施用基本上單體耗盡的HCVE2糖蛋白或編碼所述糖蛋白的核酸，從 中篩選出能夠結合基本上單體耗盡的HCV E2,尤其是阻斷受體結合的抗體。在一些實施方 案中，測試抗體或抗原結合片段中和病毒活性的能力，如降低病毒的傳染性、病毒出芽或病 毒載量的能力。
[0173] 本發(fā)明考慮了篩選方法，該方法包括：使假定的相互作用化合物與基本上單體耗 盡的HCV E2糖蛋白接觸，并確定假定的相互作用化合物與E2組合物之間相互作用的結合 特點，或它與HCV受體如CD81或被HCV結合的宿主其他部位結合的能力。
[0174] 本發(fā)明所考慮的方法包括將來自于個體的樣品與基本上單體耗盡的HCV E2糖蛋 白接觸，并測定樣品組分與HCV E2糖蛋白之間的相互作用。在一些實施方案中，可使用來 自于不同HCV基因型的不同二聚體和/或三聚體或單體耗盡的E2糖蛋白的組合（arrays)。 在一些實施方案中，所述樣品是包含抗體的樣品，如血液樣品。
[0175] 在一些實施方案中，樣品來自于感染的個體。對照樣品包括來自于未感染的個體。 樣品可以來自于個體的任何部位。方便的樣品包括血液、血清、血漿、尿液、痰液等。適當?shù)?試驗是本領域技術人員已知的，包括ELISA、RIA和EIA類試驗以及競爭性試驗。個體試驗 特別適用于血清學監(jiān)測。
[0176] 在另一個方面，本發(fā)明提供包含基本上單體耗盡的HCV E2糖蛋白的試劑盒或固體 或半固體基底（substrate)。本發(fā)明所考慮試劑盒或基底用于診斷、預后、治療或預防，以及 用于設計和/或篩選HCV E2結合分子或HCV受體結合分子。所述試劑盒和基底也可用于 監(jiān)測抗HCV感染的治療方法的效果。在一些實施方案中，所述試劑盒或基底在另一部分中 還包含基本上為單體的HCV E2。
[0177] 包含基本上為單體HCV E2的組合物所包括的制劑具有大于80%、85%、90%、 95%、97%或99%(按重量計）的單體E2。
[0178] 在一些實施方案中，包含基本上單體耗盡的HCV E2糖蛋白的試劑盒可方便地用于 (或用在）病毒感染的診斷或預后，或病原體的監(jiān)測或血清學監(jiān)測試劑盒，并任選地包括包 裝、說明書和各種其他成分，如緩沖液、基底、抗體或配體、對照抗體或配體，以及檢測試劑。
[0179] 在一些實施方案中，使用抗三聚體和抗二聚體和抗更高級形式的HCV E2特異性抗 體。
[0180] 術語"分離的"和"純化的"是指物質基本上或實質上不含在自然狀態(tài)下通常與其 伴隨的組分。例如，"分離的核酸分子"是指這樣的核酸或多核苷酸，其分離自在天然存在的 狀態(tài)下位于其側翼的序列，例如，從通常與其相鄰的序列上移出的DNA片段。特別是，分離 的HCVE2包括從天然細胞環(huán)境中和從與細胞的其他成分結合狀態(tài)下在體外分離和/或純化 蛋白。在沒有限制的情況下，分離的核酸、多核苷酸、肽或多肽可以指通過純化分離的天然 序列，或指通過重組或合成的方法產生的序列。在一些實施方案中，純化的基本上單體耗盡 的HCV E2的純度為至少95 % -99 %。
[0181] 提到變體包括其部分、衍生物及化學類似物。所考慮的化學類似物包括側鏈的修 飾，在合成過程中摻入非天然氨基酸和/或它們的衍生物，以及使用接頭或交聯(lián)接頭，或其 他方法，尤其是強加構象限制的方法。
[0182] 通過以下非限制性的實施例對本發(fā)明進行進一步描述。實施例中所使用的材料和 方法提供如下。
[0183] 蛋白純化和尺寸排阻層析：哺乳動物表達的E2蛋白
[0184] 從三個不同分離株中制備出兩種形式的E2糖蛋白，使用293E細胞，在哺乳動物 表達系統(tǒng)中表達野生型E2 661-his構建體（WT-his，WT E2661-his)及缺少三個可變區(qū)的經修 飾的E2661-his(HVR123-his)。WT-his描述于WO 2008/022401中?；蛘?，也可用昆蟲系統(tǒng) 或酵母表達系統(tǒng)來產生E2糖蛋白。除非另有說明，提到WT和缺少三個可變區(qū)的經修飾的 E2661-his是指HCV的H77c (基因型la)毒株的E2序列。
[0185] 根據(jù)制造商的建議，用以Ni-MAC緩沖液A平衡的Ni-S印harose 6Fast_Flow樹脂 (GE Healthcare)純化組織培養(yǎng)上清液，并用Ni-MAC緩沖液B洗脫結合的蛋白。含蛋白的級 分按照Bradford法（BioRad公司）進行檢測，并使用HiPrep26/10脫鹽柱（GE Healthcare) 和AKTA Explorer快速液體蛋白層析系統(tǒng)（FPLC, GE Healthcare)進行緩沖液更換到磷酸 鹽緩沖鹽溶液（1XPBS ;10mM NaPO4, 150mM NaCl，pH 7· 3)中。
[0186] 為了分離出不同形式的E2661/5_his(JFHl株一在所述JFHl株中，有貢獻額外 的4個氨基酸殘基的插入，因此E2胞外區(qū)的末端實際上是位于第665位的殘基），使用 AKTA Explorer FPLC 系統(tǒng)和用 IXPBS 平衡的 TSKG3000swXL 柱（21. 5_X60cm, TOSOH Biosciences, 200mL柱體積（CV))進行制備型尺寸排阻層析。最大注射體積為2mL,在 加樣之前，根據(jù)制造商的建議，用截留分子量（MWCO)為10, 000道爾頓（Da)的過濾單元 (Amicon)將純化的蛋白濃縮至約10mg/mL。由于在該濃度下從溶液中沉淀出蛋白，因此從 pH值7. 3-6. 8滴定緩沖液，以避開這些蛋白的預測等電點（pi) (ProtParam)。以2mL/min 的平均流量運行樣品，在60-160mLs之間收集2mL級分。合并多個運行收集的級分，得到 0.1-lmg/mLo
[0187] 使用Waters高效液相色譜系統(tǒng)（HPLC，Alliance)和最大負荷容積為0· 2mL的小 TSKG3000swxl柱（TOSOH, 7. 8mmX30cm，15mLCV)，進行分析型尺寸排阻色譜分析。為了達到 最大分辨率，以〇. 25mL/min的流量在IXPBS中進行試驗60分鐘。利用這種方法，在室溫 下對峰值單體和二聚體級分進行超過72小時的穩(wěn)定性分析，每24小時編程運行程序，包括 在0分鐘的參照樣品。以0.5mg/mL純化的牛血清白蛋白和卵清蛋白（GE Healthcare)作 為尺寸標準對照。
[0188] 使用NanoDrop(Thermo Scientific)，通過280nm處的吸光度對蛋白進行定量。使 用根據(jù)ProtParam(Expasy)由氨基酸序列測得的理論消光系數(shù)（ε)來調整濃度。
[0189] 為了分離出四種不同的WT和A123E2661_his蛋白級分，進行Ni瓊脂糖高效色譜。 將蛋白溶于含20mM磷酸鈉、0.5M NaCUlOmM咪唑（低UV)pH7.4的結合緩沖液中，然后裝 載至 5mL HisTrap HP 柱（GE Healthcare)中。用 20mM 磷酸鈉、0.5M NaCl、25mM 咪唑（低 UV)pH 7. 4進行預洗脫步驟，并用20mM磷酸鈉、0. 5M NaCl、500mM咪唑（低UV)pH 7. 4進行 洗脫。然后在Superdex 200pg 26/60柱（GE Healthcare)中進行尺寸排阻層析。合并選 出的級分，用〇. 22 μ m過濾。
[0190] 使用與上述Ni瓊脂糖色譜相同的方法，制備各種蛋白的未分級的混合物，但不進 行尺寸排阻。在從Ni瓊脂糖洗脫后，旋即在HiPr印26/10脫鹽柱（GE Healthcare)中對樣 品進行脫鹽。
[0191] 細菌表達的蛋白
[0192] 由麥芽糖結合蛋白（MBP)連接至第113-201位殘基之間的⑶81大胞外環(huán)（LEL) (MBP-LEL 113H)構成的嵌合體的表達和純化，先前已有描述（Drummer et al. ,Biochem Biophys Res Commun 328:251-257,2005 ;Drummer et al.，J Virol 76:11143-7,2002)。所 述⑶81-LEL的二聚體形式已被廣泛用于表征E2-⑶81相互作用，并已經證明是極好的天然 CD81的模擬物，并可與Claudin-I的第一胞外環(huán)（ECl)相互作用（Harris et al·，J Biol Chem 285:21092-102,2010)。此外，它反映出在hCD81-LEL晶體結構中觀察到的同型二聚 體以及細胞相關的全長CD81之間的同型相互作用。
[0193] CD81MBP-LEL113.WT 和 F186S 轉化的 BL21DE3 細胞（Invitrogen)培養(yǎng)于添加有 鹽和氨芐青霉素的"極品肉湯"（TB)培養(yǎng)基中。
[0194] 用0. ImM異丙基β-D-I-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)，在室溫下誘導蛋白表達4 小時，收獲細胞，洗滌并儲存于_80°C。在S-緩沖液中通過超聲處理分離可溶性蛋白，以 20, OOO Xg離心澄清，并用0· 45 μ m濾器過濾。使用直鏈淀粉樹脂（New England Biolabs), 根據(jù)制造商的說明書，對蛋白進行親和純化。采用Bradford試驗（BioRad)測定用IOmM麥 芽糖洗脫的蛋白陽性級分。使用AKTA FPLC和用S-緩沖液平衡的Superdex 200pg 16/20 柱（GE Healthcare),通過尺寸排阻層析分離出所述二聚體和單體蛋白。使用HR Superdex 200柱（GE Healthcare)和AKTA FPLC進行尺寸排阻層析分析證實了單一的二聚體峰的分 離。使用30, OOODa MWCO過濾單元（Amicon)濃縮蛋白，并按上述方法進行定量。
[0195] 聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE)
[0196] 采用預制的4-12% Nu-PAGE (Novex)，使用預染色的Precision-Plus尺寸標準標 記（Bio-Rad)對純化的E2661-his蛋白進行分析。根據(jù)需要，在非還原或還原條件下進行 操作，并用考馬斯亮藍溶液（0.1%?八考馬斯亮藍1?-250?1 〇-1^(1)，5%￥八冰醋酸，50% v/v甲醇）染色觀察。用10% (v/v)甲醇和10% (v/v)醋酸對凝膠進行脫色，用Odyssey LI-COR熒光掃描儀和定量軟件對考馬斯亮藍染色的蛋白的遷移進行分析。
[0197] 利用加入10μ L 4X還原/非還原樣品緩沖液（Invitrogen)中的3μ g的各 HCV-His變體，對WT和Λ 123E 2661-his蛋白的四種不同的級分以及未分級的混合物進行分 析。將樣品在70°C加熱3分鐘，并裝載至4% -12%的Bis-Tris Nu-PAGE SDS-PAGE凝膠 中。對于還原凝膠而言，向凝膠罐（tank)的中央部位加入500 μ L抗氧化劑Nu-PAGE，然后 施加200V電壓。
[0198] 蛋白質印跡分析
[0199] 利用加入4X還原樣品緩沖液（Invitrogen)中的0· 5μ g的各HCV-His變體，對 WT和Λ 123E 2661-his蛋白的四種不同的級分以及未分級的混合物進行分析。還原SDS-PAGE 按上述操作進行。然后通過濕轉移（1小時）將上述蛋白轉移至PVDF膜中。將所述膜用 含2%脫脂牛奶的PBS溶液封閉過夜。加入用含1%脫脂牛奶的0.05% TBS按1:1000稀 釋（Penta His&E2)的一抗。在0.05% TBS中洗滌3次，每次10分鐘。加入用含1 %脫脂 牛奶的0. 05% TBS按1:2000稀釋的綿羊抗小鼠 IgG HRP的二抗（Millipore)。在0. 05% TBS中洗滌3次，每次10分鐘。按照制造商的說明書，向所述膜中加入ECL Plus蛋白質印 跡檢測試劑（ECL Plus Western Blotting Detection Reagent, GE,產品編號 RPN2132)，并 在520nm處觀察條帶。
[0200] 質譜分析
[0201] 使用基質輔助激光解吸/電離（MLDI)-飛行時間（TOF)質譜分析（MS)法 MALDI-T0F-MS進行質譜分析。在進行MALDI-T0F-MS分析之前，按照制造商的說明書使用 ZipTip(Millipore)對單體和二聚 E2661-his 蛋白-WT 和 ΛHVR1+2+3 進行純化。
[0202] 生物傳感器分析與評價
[0203] 所有實驗均使用Biacore 2000單元（GE Healthcare)進行。將蛋白配體進 行緩沖液更換到PH值為4. 2的IOmM醋酸鈉中，然后通過胺耦合法固定到CM5芯片（GE Healthcare)上，獲得約 800 個響應單元（RU)。在 IXHBS-N 緩沖液（0· Olifepes, 0.15M NaCl，3mM EDTA)中進行固定。對于所有實驗，陰性對照配體被固定于前述的流動池 中，或者采用陰性對照分析物注射以減少非特異性結合。動力學實驗在HBS-EP緩沖液 (0· OlH印es, 0· 15M NaCl, 3mM EDTA, 0· 05% Tween 20)中以 10μ L/min流量進行。蛋白分析 物在HBS-EP中進行4-5次連續(xù)的兩倍稀釋，然后注射到系統(tǒng)中，起始濃度為0. lmg/mL。注 射進行250秒以獲得結合速率，并允許解離600秒。包括在中點濃度進行的獨立加樣對照， 以確保濃度的準確性。各循環(huán)之間以l〇〇uL/min的流量重復，且包括兩個15 μ L的IOOmM 磷酸脈沖。
[0204] 使用BIA評估軟件，基于平衡熱力學，根據(jù)三理論結合模型將原始的生物傳感數(shù) 據(jù)進行整體擬合（GE Healthcare)。值得注意的是，在減去背景后，在任何原始數(shù)據(jù)中均未 觀察到本體折射率效應（RI)，在擬合期間將RI設定為恒值〇。在不同的反應方案中，組分 A和B分別代表配體和分析物。
[0205] " I: ILangmuir 結合"模型
[0206] A+B 〇 AB,其中"ka"為正向，"kd"為反向。
[0207] KD = kd/ka
[0208] 分析物和配體之間的結合速率（ka = Ι/Ms)表示正向反應，且為分析物摩爾濃度 (M)與以秒（s)表示的時間的函數(shù)。解離速率（kd= Ι/s)作為時間函數(shù)表示反向反應，但 與濃度無關。以摩爾單位（M)表示的平衡解離常數(shù)或KD可通過解離速率（kd)除以結合速 率（ka)計算得到。
[0209] "兩種狀態(tài)結合（構象變化）"模型
[0210] A+B 〇 AB,其中 "kal" 為正向，"kdl" 為反向。
[0211] AB 〇 AB*, U沖 "ka2" 為正向，"kd2" 為反向。
[0212] KD = (kdl/kal)X (kd2/ka2)
[0213] 該模型形成兩個動力學方程，其中一級結合速率（kal = Ι/Ms)和解離速率（kdl =ι/s)描述上述1:1的結合互作。二級結合速率（ka2 = Ι/s)和解離速率（kd2 = 1/s) 表示發(fā)生在分析物和配體之間相互作用后構象變化的動力學。這種相互作用被描述為時間 (s)的函數(shù)，但與分析物的濃度無關。整個KD值是通過由一級方程和二級方程所產生的KD 值相乘而得到。
[0214] "二價分析物"模型
[0215] A+ B O AB,其中 kal (X2)為正向，kdl 為反向。
[0216] AB + B η AB2,其中 ka2 為正向，kd2(X2)為反向。
[0217] KD = n/a
[0218] 該模型形成兩個動力學方程，其中，一級結合速率（kal = l/MsX2)和解離速率 (kdl = Ι/s)表示如上所述的1:1結合互作，然而使結合速率（ka)乘以2以反映兩個可獲 得的配體結合位點。將二級結合速率（ka2 = Ι/RUs)計算為響應單元（RU)與以秒（s)表 示的時間的函數(shù)。使二級解離速率（kd2 = l/MsX2)乘以2,以反映兩個可獲得的配體結合 位點。值得注意的是，由于不同濃度下，單價和二價結合的程度不同，二價結合模型不能生 成親和常數(shù)或KD，因此解離速率（kd)不再與濃度無關。
[0219] 由于傳感器芯片檢測到的折射率變化與在響應單元（RU)中測定的芯片上吸收量 變化成比例，因此采用如下方程式計算每種配體的分析物結合能力的理論最大值（R max):
[0220] Rniax =(分析物質量（MW) / 配體質量（MW)) X RlX S，
[0221] 在此，R1是固定的配體（⑶81-LEL二聚體）（RU)的水平，S是相互作用的化學計量 t匕，因此描述了分子質量、RU與結合速率之間的關系。理論Rmax通常高于實驗Rmax，這是由 于尤其是當使用非特異性的固定化方法如胺偶聯(lián)時，固定配體的功能性/有效性通常會受 到影響。實驗Rmax可用于直接測定相互作用系統(tǒng)的KD值，但由于使芯片飽和需要大量的分 析物，因而常常難以確定。相反，通過如上所述不同分析物濃度下關聯(lián)傳感的整體擬合預測 出實驗Rmax和KD :即KD濃度的0. 1-10倍最適于動力學分析。
[0222] 直接結合酶免疫測定
[0223] 用在 PBS 中稀釋的 0. 5 μ g/mL 雪滴花（Galanthus nivalis)凝集素（Sigma)將 96孔Maxisorb酶聯(lián)免疫板（Nalge Nunc)涂覆4°C下過夜16小時。然后除去凝集素，并 用BSAltlPBS (含10mg/mL BSA(Sigma)的PBS液）在室溫下將空白位置封閉1-2小時。然后 添加在含0. 05%吐溫20的PBS (PBST)中稀釋的2 μ g/mL重組E2蛋白，并在室溫下溫育1 小時。然后將所述板在PBST中洗滌四次。然后向結合于雪滴花凝集素包被的所述板的E2 加入用BSA 5PBST(含5mg/mL BSA的PBST)連續(xù)稀釋的豚鼠血清，并在室溫下孵育2小時。 使用辣根過氧化物酶綴合的兔抗豚鼠免疫球蛋白（DAKO)(用BSA 5PBST按1:1000稀釋）檢 測結合的抗體，并按照制造商的建議，用四甲基對二氨基聯(lián)苯底物（Sigma)進行顯色。在 Fluostar (BMG技術公司）上讀取450nm-620nm處（背景）的吸光度值（光密度）。
[0224] CD81抑制試驗
[0225] 簡言之，用含 5 μ g/mL 二聚 CDSIMBP-LEL113-2。1 的 PBS 液包被 96 孔 Maxisorb 酶聯(lián)免 疫板（Nalge Nunc)，并于 4°C下孵育 16 小時。除去 MBP-LEL113-2。1 后，用 BSAltlPBS (含 IOmg/ mL BSA(Sigma)的PBS液）在37°C下封閉2小時，以減少非特異的結合。然后將所述板在 PBST (含 0. 05 % 吐溫 20 (Sigma)的 PBS 液）中洗滌四次。將用 BSA5PBST (含 5mg/mL BSA 的PBST)連續(xù)稀釋的免疫血清與50ng的H77c或JFHlWTE2661-his蛋白混合，然后加入到用 MBP-LEL113-201包被的免疫檢測板中。利用兔抗-his抗體（Rockland Immunochemicals)檢 測結合的E2661-his。進一步用PBST洗滌之后，使用辣根過氧化物酶綴合的抗兔免疫球蛋白 (DAKO)(用BSA 5PBS/吐溫按1:1000稀釋）檢測結合到MBP-LEL113-201上的殘基E2復合物， 并按照制造商的建議，用四甲基對二氨基聯(lián)苯底物（Sigma)進行顯色。在Fluostar (BMG技 術公司）上讀取450nm-620nm處（背景）的吸光度值（光密度）。計算每個血清樣品抑制 80 %的滴度。
[0226] HCVpp中和試驗
[0227] 用 1 μ g 的 pNL43. LUC. R-E-加上 1 μ g 的 H77c ρΕ1Ε2 載體（Drummer et al.，F(xiàn)EBS Lett 546:385-90, 2003)或編碼非功能性E1E2(空白）的pcDNA4HisMax載體共轉染HEK 293T細胞。轉染72小時后，收集含有HCVpp的培養(yǎng)上清液，并進行過濾（0. 45 μ m)。將豚 鼠血清經連續(xù)稀釋后與H77c HCVpp病毒在37°C下孵育1小時，然后一式四份加入到于前一 天以3 X IO4個細胞/孔接種于48孔組織培養(yǎng)板（Nunc, Nalge)中的的單層Huh7. 5細胞中。 孵育4小時（37°C，5% CO2)后，用PBS洗滌細胞并更換培養(yǎng)基。再經過3天孵育（37°C，5% 〇)2)后，裂解細胞，并在配備有發(fā)光光學裝置的？111 〇#&1'?1^1&1^6(*11〇1呢1^)中測定熒 光素酶的活性。
[0228] HCV細胞培養(yǎng)物來源的病毒（HCVcc)的進入、進入抑制和中和試驗
[0229] HCV RNA由質粒DNA體外轉錄得到，所述質粒DNA編碼含有如前所述的Gaussia熒 光素酶基因的感染性J6/JFH1嵌合基因型2a基因組。包括含有賦予其感染性丟失的GND突 變的相同質粒作為陰性對照。用XbaI酶消化來線性化所述DNA質粒，并使用T7Mega Script 試劑盒進行轉錄。然后通過與DNA酶I孵育除去DNA模板，并用苯酚-氯仿法沉淀擴增的 RNA。對RNA進行定量，并用I %瓊脂糖-甲醛凝膠成像。使用DMRIE-C試劑（Invitrogen)， 按照制造商的建議將RNA轉染至Huh7. 5單層細胞中，72小時后收獲含HCVcc的上清液。澄 清上清并于-8〇°C保存。
[0230] 采用有限稀釋法（TCID5tl)測定 HCVcc 感染滴度（Lindenbach et al.，Science 309(5734) :623-626, 2005)。簡言之，對病毒母液進行連續(xù)稀釋，然后加入到以3X IO3個細 胞/孔接種于96孔板的細胞中。感染72小時后，用IXPBS洗滌細胞，并在冷的甲醇中固 定，然后用抗FLAG抗體檢測感染的細胞。結合的抗體用在PBST中按1:3稀釋的與辣根過 氧化物酶綴合的山羊抗小鼠多克隆抗體進行檢測，并在室溫下溫育1小時。然后將細胞用 PBS洗兩次，用PBST洗一次。感染的細胞通過添加3, 3' -二氨基聯(lián)苯胺（DAB)底物顯示，并 在室溫下孵育5分鐘。然后將細胞用PBS洗滌兩次，并向細胞中加入50 μ L PBS緩沖液以 避免干燥。在顯微鏡下觀察細胞，并計算出陽性孔。
[0231] 米用 Reed-Muench 方法（Reed and Muench, A simple method of estimating fifty percent endpoints, The American Journal of Hygiene 27:493 - 497, 1938)計算 TCID500 Reed-Muench法通過以下方程計算產生50%感染的確切稀釋度：
[0232]

【權利要求】
1. 包含丙型肝炎病毒（HCV)包膜糖蛋白2(E2)的組合物，其中所述HCV E2為基本上單 體耗盡的HCV E2。
2. 根據(jù)權利要求1所述的組合物，其包含大于70%的二聚和/或三聚和/或更高級形 式的HCV E2糖蛋白。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的組合物，其包含大于80% (按重量計）的三聚或三聚和 更高級形式的HCV E2糖蛋白。
4. 根據(jù)權利要求1或2所述的組合物，其包含大于80% (按重量計）的二聚HCV E2 糖蛋白。
5. 根據(jù)權利要求1或2所述的組合物，其包含大于80% (按重量計）的更高級形式的 HCV E2糖蛋白。
6. 包含丙型肝炎病毒（HCV)包膜糖蛋白2 (E2)的組合物，其中所述HCV E2為大于80 % (按重量計）的三聚HCV E2糖蛋白。
7. 包含丙型肝炎病毒（HCV)包膜糖蛋白2 (E2)的組合物，其中所述HCV E2為大于80 % (按重量計）的更高級形式的HCV E2糖蛋白。
8. 包含丙型肝炎病毒（HCV)包膜糖蛋白2 (E2)的組合物，其中所述HCV E2為大于80% (按重量計）的三聚和更高級形式的HCV E2糖蛋白。
9. 根據(jù)權利要求1-8中任一項所述的組合物，其還包含藥學上或生理上可接受的載體 和/或稀釋劑。
10. 根據(jù)權利要求1-8中任一項所述的組合物，其還包含佐劑。
11. 根據(jù)權利要求10所述的組合物，其中所述佐劑為ISCOMATRIX?。
12. 權利要求1-11中任一項所述的組合物在治療或預防HCV感染或者在制備用于治療 或預防HCV感染的藥物中的應用。
13. 權利要求1-11中任一項所述的組合物在診斷或監(jiān)測HCV感染或監(jiān)測抗HCV治療方 案或者在制備用于診斷或監(jiān)測HCV感染或監(jiān)測抗HCV治療方案的診斷試劑中的應用。
14. 根據(jù)權利要求13所述的應用，其中所述診斷試劑為抗體或包含所述抗體的抗原結 合片段。
15. 引發(fā)個體或患者免疫應答的方法，所述方法包括在足以引發(fā)免疫應答的條件下，向 所述個體或患者施用一段時間有效量的權利要求1-11中任一項所述的組合物。
16. 免疫個體抗HCV感染的方法，包括向所述個體施用權利要求1-11中任一項所述的 組合物。
17. 用于治療或預防個體HCV感染的方法，包括在足以治療或預防HCV的條件下，向所 述個體施用一段時間權利要求1-11中任一項所述的組合物。
18. 用于制備純化的抗基本上單體耗盡的HCV E2抗體的方法，包括向個體施用有效量 的基本上單體耗盡的HCV E2,并純化產生的抗體。
19. 試劑盒或者固體或半固體基底，包含權利要求1-11中任一項所述的組合物。
【文檔編號】A61P31/14GK104324373SQ201410558503
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2011年11月25日 優(yōu)先權日:2010年11月26日
【發(fā)明者】海蒂·卓默爾, 凱薩琳·麥卡弗里, 潘提利斯·龐博瑞斯 申請人:麥克法蘭博尼特醫(yī)學健康研究公司