周期型馬來絲蟲m29表位基因dna疫苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種周期型馬來絲蟲M29表位基因DNA疫苗的制備方法，以我國流行的周期型馬來絲蟲為研究對(duì)象，擴(kuò)增馬來絲蟲myosin基因片段，構(gòu)建了周期型馬來絲蟲myosin真核表達(dá)重組質(zhì)粒。根據(jù)測序結(jié)果分析，推測其氨基酸序列，然后利用相關(guān)的軟件預(yù)測它們的B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位，制備出周期型馬來絲蟲肌球蛋白表位基因疫苗。將該疫苗免疫接種BALB/c小鼠，并檢測其疫苗的體液免疫和細(xì)胞免疫的應(yīng)答效果。試驗(yàn)結(jié)果證明了該疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng)，取得滿意效果，制備周期型馬來絲蟲肌球蛋白表位基因疫苗獲得成功。
【專利說明】周期型馬來絲蟲M29表位基因 DNA疫苗的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種周期型馬來絲蟲M29表位基因 DNA疫苗的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 淋巴絲蟲病是全球最古老的疾病之一。據(jù)埃及開羅博物館展示的4000年前的古 埃及法老塑像，顯示患有右下肢象皮腫，即為該病典型臨床表現(xiàn)之一。據(jù)WHO報(bào)告，全球有 83個(gè)國家和地區(qū)共有淋巴絲蟲感染者約1. 2億，其中班氏絲蟲病約1. 07億，馬來絲蟲病和 帝汶絲蟲病共約1300萬。這些感染者中約4400萬有淋巴絲蟲病的臨床表現(xiàn)，約7600萬為 微絲蚴血癥者。估計(jì)全球有受威脅人口超過11億，約占世界總?cè)丝诘?0%。我國曾是全 球淋巴絲蟲病流行最嚴(yán)重的國家之一，受威脅人口達(dá)3. 3億。雖然絲蟲病的防治在全球范 圍內(nèi)取得了巨大的成績，但由于氣候變暖等自然、生物和社會(huì)以及淋巴絲蟲的夜現(xiàn)周期性 和微絲蚴血癥者多無臨床癥狀等諸多因素的廣泛存在，近年來在一些國家和地區(qū)出現(xiàn)疫情 復(fù)燃和蔓延的趨勢，絲蟲病的流行不僅給人民的健康帶來嚴(yán)重危害，也成為因病致貧的重 要原因之一。最新研究報(bào)道表明，感染者殘存?zhèn)魅驹吹奈⒔z蚴血癥可持續(xù)20年以上，中等 密度和較高密度微絲蚴血癥者具有傳播絲蟲病的作用。所以后期的監(jiān)控與防治任務(wù)仍很艱 巨。
[0003] 在我國流行的主要是班氏絲蟲和馬來絲蟲。后者生活史較復(fù)雜，主要包括幼蟲在 蚊體內(nèi)和成蟲在人體內(nèi)的發(fā)育過程，此外還可在人體以外的多種脊椎動(dòng)物體內(nèi)發(fā)育成熟。 淋巴絲蟲病可導(dǎo)致患者永久或長期致殘，被WHO列為世界第二大致殘病兇。尋找控制絲蟲 病疫苗的研究越來越受到人們重視。篩選有效的保護(hù)性抗原并有機(jī)結(jié)合以獲得最佳保護(hù)效 應(yīng)是疫苗研究的一個(gè)重要內(nèi)容。肌球蛋白（myosin)是一種廣泛存在于真核生物中的功能 蛋白，不僅存在于肌細(xì)胞中，而且在非肌細(xì)胞中也存在。它作為生物體的一種重要的收縮 蛋白質(zhì)，在調(diào)節(jié)肌肉收縮和細(xì)胞重組等方面發(fā)揮著重要作用。有關(guān)寄生蟲myosin的分子生 物學(xué)和免疫學(xué)方面的研究表明它是一種早期免疫顯性分子，具有較顯著的免疫原性，免疫 動(dòng)物可產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫保護(hù)作用。這也是研究者致力于myosin分子疫苗和藥物研究的原 因。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種方法簡便、易操作，效果好的周期型馬來絲蟲M29表 位基因 DNA疫苗的制備方法。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：
[0006] 一種周期型馬來絲蟲M29表位基因 DNA疫苗的制備方法，其特征是：包括下列步 驟：
[0007] ( -）引物設(shè)計(jì)
[0008] 根據(jù)GenBank中周期型馬來絲蟲肌球蛋白基因（的高度保守序列區(qū)，應(yīng)用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并分別引入Xho I /BamH I酶切位點(diǎn)，起始終止密碼以及保 護(hù)性堿基；
[0009] Pl:上游 5, - CC GGA TCC ATG AAA TGC AAA AAA T - 3'
[0010] 下劃線序列為BamH I酶切位點(diǎn) Tm = 56. 84
[0011] P2:下游 5, - CC CTC GAG ATG GTG AAC GGA GTA CG - 3'
[0012] 下劃線序列為Xho I酶切位點(diǎn) Tm = 66. 90
[0013] (二）周期型馬來絲蟲蟲體及微絲蚴的收集和總RNA的提取和測定
[0014] (1)將取自長爪沙鼠腹腔液的成蟲及微絲蚴移入1.5ml勻漿器中，加入 ImlTrizol試劑研磨，室溫靜置5min ;
[0015] (2)加入0· 2ml氯仿，震蕩15s后靜置2min, 4°C，12000rpm離心15min取上清；
[0016] (3)加入0· 5ml異丙醇混勻，室溫靜置IOmin, 4°C，12000rpm離心IOmin棄上清；
[0017] (4)加入Iml 75%乙醇混勻，4°C，9000rpm離心5min棄上清；
[0018] (5)干燥 5min 后溶于 DEPC 處理水 30ul, 60°C IOmin ;
[0019] (6)取2ul總RNA稀釋200倍，在紫外分光光度計(jì)上測0D260和0D280值，確定 其濃度和純度，并進(jìn)行甲醛電泳檢測；
[0020] (三）cDNA的合成
[0021] (1)取總 RNA 5ul，后加入 IOmM dNTPmix lul，0· 5ug/ul oligo (dT) 12-18ul，DEPC 處理水3ul, 65°C加熱5min,后冰浴5min ;
[0022] (? 另取 IOXBuffer 2ul, 25mM MgClMul, 0· IM DTT 2ul, RNA 酶抑制劑 Iul 混 勻，42°C 孵育 2min ;
[0023] (3)將步驟⑵混合液加入步驟⑴物質(zhì)中混勻，再加入Iul逆轉(zhuǎn)錄酶 Superscript II 混勻；42°C孵育 50min，70°C 15min 終止反應(yīng)，-70°C保存?zhèn)溆茫?br> [0024] (四）PCR 擴(kuò)增 Bm - myosin 基因
[0025] Pl = 56. 84, P2 = 66. 90,反應(yīng)體系 cDNA I. 5ul, IOXPCR Buffer 2. 5ul, 2. 5mM dNTPmix 4. Oul, P1P2各0· 7ul, 5U/ul TaqDNA聚合蛋白酶0· 2ul, ddH20 15. 4ul ;混勻在DNA 擴(kuò)增儀 PTC - 100 上進(jìn)行 PCR ;循環(huán)參數(shù)為：94°C 3min, 94°C 50s, 51°C 45s, 72°C 90s,共 33 個(gè)循環(huán)，最后一次循環(huán)72°C延伸反應(yīng)時(shí)間為7min，4°C冷卻終止反應(yīng)；同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照。 PCR產(chǎn)物經(jīng)I. 0 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定；
[0026] (五）Bm - myosin基因片段純化和T載體的連接以及轉(zhuǎn)化
[0027] (1)純化Bm -myosin基因片段：取50U1PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，在紫 外燈下切割含目的基因的凝膠，按膠回收試劑盒說明，純化回收產(chǎn)物；
[0028] (2)感受態(tài)大腸桿菌的制備：大腸桿菌DH5 α在新鮮LB瓊脂平板上37°C培養(yǎng)過 夜；挑取單菌落于3ml LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩過夜；取300ul菌液加入30ml LB培養(yǎng)基 中，37°C 220rpm 振蕩 4h,冰浴 Ih,后分裝到 I. 5ml Eppendorf 管 4°C 離，8000rpm 5min ; 棄上清，加入冰浴〇· lmol/L MgC12100ul懸浮，4°C離心，8000rpm 5min,棄上清，加入冰 浴0. lmol/L CaCl2 - 10%甘油溶液300ul懸浮，-70°C保存?zhèn)溆茫?br> [0029] (3) Bm -myosin基因和pGEM -T載體的連接：取純化的PCR產(chǎn)物3ul，2 X快速連接 緩沖液 5ul，pGEM - T 載體 lul，T4DNA 連接酶 3weiss/ul lul，共 IOul 混勻，4°C連接 20h ;
[0030] (4).轉(zhuǎn)化：取連接反應(yīng)物IOul加入新鮮制備的大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞300ul 混勻，冰浴30min，42°C熱休克90s，快速移至冰浴3min，加入200ul LB培養(yǎng)基，37°C孵育 45min。將培養(yǎng)物IOOul涂在含有X -gal, IPTG，Amp的I. 5%瓊脂平板上，倒置平板，37°C 過夜培養(yǎng)；
[0031] (六）陽性重組克隆的篩選和鑒定
[0032] (1)陽性重組克隆的篩選：挑取生長狀態(tài)好的白色菌斑，并提取質(zhì)粒；
[0033] (2)PCR鑒定：以重組質(zhì)粒Bm - myosin/pGEM - T為模板，用Bm - myosin的引物 P1、P2 進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系 25ul, Bm -myosin/pGEM -T 重組質(zhì)粒 I. 5ul, IOXPCRBuffer 2. 5ul, 2. 5mM dNTPmix4. Oul, PI、P2 各 0· 7ul, 5U/ul TaqDNA 聚合蛋白酶 0· 2ul, ddH20 15. 4ul ;循環(huán)參數(shù)為：94°C 3min, 94°C 50s, 51°C 45s, 72°C 90s,共 33 個(gè)循環(huán)，最后一次循 環(huán)72°C延伸反應(yīng)時(shí)間為7min，4°C冷卻終止反應(yīng)；PCR產(chǎn)物經(jīng)I. 0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定；
[0034] (3)酶切鑒定：取經(jīng)PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒，用BamH I與Xho I雙酶切，用 1. 〇%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切片段；
[0035] (七）Bm - MYOSIN二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測
[0036] 分別應(yīng)用EXPASY服務(wù)器上的SOPMA、GOR、nnPredic、HNN方法以及EMBOSS程序分 析預(yù)測Bm - myosin的二級(jí)結(jié)構(gòu)；
[0037] (八）Bm-MYOSIN親水性、表面可及性、抗原性、極性及柔韌性參數(shù)預(yù)測
[0038] 采用Hopp&Woods親水性參數(shù)、Emini表面可及性參數(shù)、Jameson - Wolf抗原性參 數(shù)、Zimmerman極性參數(shù)和柔韌性參數(shù)預(yù)測；
[0039] (九）Bm - MYOSIN T細(xì)胞表位預(yù)測
[0040] (1)人源HLA I類分子結(jié)合表位的預(yù)測：將肌球蛋白的AA序列以FASTA格式輸入 Rankp印服務(wù)器，選擇AA長度為9 - mers，基因型為HLA - A0201、HLA - Al 101，預(yù)測HLA I 類分子結(jié)合肽，保留輸出的結(jié)果；
[0041] (2)鼠源MHC I類分子結(jié)合表位的預(yù)測：將肌球蛋白的AA序列以FASTA格式輸入 Rankp印服務(wù)器，選擇AA長度為9 - mers，基因型為H2 - d，包括H2 - KcU H2 - Ld和H2 - Dd， 為H2-d型小鼠表達(dá)的MHC I類分子；預(yù)測MHC I類分子結(jié)合肽，保留輸出的結(jié)果；
[0042] (3)人源HLA II類分子結(jié)合表位的預(yù)測：將肌球蛋白的AA序列以FASTA格式輸 入 Rankp印服務(wù)器，選擇基因型為 HLA - DRB1*0101、HLA - DRB1*0301、HLA - DRB1*0401、 HLA - DRB1*0701、HLA - DRB1*0801、HLA - DRB1*0901、HLA - DRB1*1101、HLA - DRB1*1301、 HLA - DRB1*1501，預(yù)測HLA II類分子結(jié)合肽，保留輸出的結(jié)果；
[0043] (4)鼠源MHC II類分子結(jié)合表位的預(yù)測：將肌球蛋白的AA序列以FASTA格式輸入 Rankp印服務(wù)器，選擇選擇基因型為I - Ad、I -Ed，預(yù)測鼠源MHC II類分子結(jié)合肽，保留輸 出的結(jié)果；
[0044](十）表位基因片段的選擇
[0045] 根據(jù)B細(xì)胞表位預(yù)測和T細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果，選擇富含抗原表位的基因片段 562bp -1269bp設(shè)計(jì)引物，以質(zhì)粒pcDNA3. I (+) -BmM55為模板，并將該片段克隆至原核表達(dá) 載體pET - 28a(+)中，構(gòu)建pET - BmM29。應(yīng)用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物；
[0046] 上游 Pl :5, - GCGGATCCGCTAATGAATTGAATATGC - 3，
[0047] 其中GGATCC為BamH I酶切位點(diǎn)；
[0048] 下游 P2 :5, - CGGAATTCCTATGGTGAACGGAGTACGGT
[0049] 其中GAATTC為EcoR I酶切位點(diǎn)；
[0050] 引物使用前用ddH20溶解，濃度為10 μ mol/L ;
[0051] (十一）表位基因片段PCR擴(kuò)增
[0052] (1)以pcDNA3. 1(+) - BmM55為模板，P1、P2分別為上、下游引物，反應(yīng)體系：
[0053] PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

【權(quán)利要求】
1. 一種周期型馬來絲蟲M29表位基因 DNA疫苗的制備方法，其特征是： 包括下列步驟： (一） 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中周期型馬來絲蟲肌球蛋白基因（的高度保守序列區(qū)，應(yīng)用Primer Premier5. O軟件設(shè)計(jì)引物，并分別引入Xho I /BamH I酶切位點(diǎn)，起始終止密碼以及保 護(hù)性堿基； Pl:上游 5' - CC GGA TCC ATG AAA TGC AAA AAA T - 3' 下劃線序列為BamH I酶切位點(diǎn)Tm = 56. 84 P2:下游 5, - CC CTC GAG ATG GTG AAC GGA GTA CG - 3， 下劃線序列為Xho I酶切位點(diǎn)Tm = 66. 90 (二） 周期型馬來絲蟲蟲體及微絲蚴的收集和總RNA的提取和測定 (1) 將取自長爪沙鼠腹腔液的成蟲及微絲蚴移入I. 5ml勻漿器中，加入ImlTrizol試 劑研磨，室溫靜置5min ; (2) 加入0· 2ml氯仿，震蕩15s后靜置2min, 4°C，12000rpm離心15min取上清； (3) 加入0· 5ml異丙醇混勻，室溫靜置IOmin, 4°C，12000rpm離心IOmin棄上清； (4) 加入Iml 75%乙醇混勻，4°C，9000rpm離心5min棄上清； (5) 干燥 5min 后溶于 DEPC 處理水 30ul, 60°C IOmin ; (6) 取2ul總RNA稀釋200倍，在紫外分光光度計(jì)上測0D260和0D280值，確定其濃 度和純度，并進(jìn)行甲醛電泳檢測； (三） cDNA的合成 (1) 取總 RNA 5ul,后加入 IOmM dNTPmix lul，0.5ug/ul oligo(dT)12-18ul，DEPC 處 理水3ul, 65°C加熱5min,后冰浴5min ; (2) 另取 IOXBuffer 2ul, 25mM MgC12 4ul, 0· IM DTT 2ul, RNA 酶抑制劑 Iul 混 勻，42°C 孵育 2min ; (3) 將步驟（2)混合液加入步驟（1)物質(zhì)中混勻，再加入Iul逆轉(zhuǎn)錄酶Superscript II 混勻；42°C孵育50min，70°C 15min終止反應(yīng)，-70°C保存?zhèn)溆茫? (四） PCR擴(kuò)增Bm - myosin基因 Pl = 56·84，Ρ2 = 66.90，反應(yīng)體系 cDNA 1.5ul，10XPCR Buffer 2.5ul，2.5mM dNTPmix 4.0ul, Pl P2 各 0.7ul，5U/ul TaqDNA 聚合蛋白酶 0.2ul，ddH20 15. 4ul;混勻在 DNA 擴(kuò)增儀 PTC -100 上進(jìn)行 PCR ;循環(huán)參數(shù)為：94°C 3min, 94°C 50s, 51°C 45s, 72°C 90s,共 33個(gè)循環(huán)，最后一次循環(huán)72°C延伸反應(yīng)時(shí)間為7min，4°C冷卻終止反應(yīng)；同時(shí)設(shè)立陰性對(duì) 照。PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定； (五） Bm - myosin基因片段純化和T載體的連接以及轉(zhuǎn)化 (1) 純化Bm -myosin基因片段：取50ulPCR產(chǎn)物經(jīng)1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈 下切割含目的基因的凝膠，按膠回收試劑盒說明，純化回收產(chǎn)物； (2) 感受態(tài)大腸桿菌的制備：大腸桿菌DH5a在新鮮LB瓊脂平板上37 °C培養(yǎng)過 夜；挑取單菌落于3ml LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩過夜；取300ul菌液加入30ml LB培養(yǎng)基 中，37°C 220rpm 振蕩 4h,冰浴 Ih,后分裝到 I. 5ml Eppendorf 管 4°C離，8 OOOrpm 5min ; 棄上清，加入冰浴〇· lmol/L MgC12 IOOul懸浮，4°C離心，8000rpm 5min,棄上清，加入冰 浴0. lmol/L CaCl2 - 10%甘油溶液300ul懸浮，-70°C保存?zhèn)溆茫? (3) Bm - myosin基因和pGEM - T載體的連接：取純化的PCR產(chǎn)物3ul，2 X快速連接緩 沖液 5ul，pGEM - T 載體 lul，T4DNA 連接酶 3weiss/ul lul，共 IOul 混勻，4°C連接 20h ; (4) .轉(zhuǎn)化：取連接反應(yīng)物IOul加入新鮮制備的大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞300ul混 勻，冰浴30min，42°C熱休克90s，快速移至冰浴3min，加入200ul LB培養(yǎng)基，37°C孵育 45min。將培養(yǎng)物IOOul涂在含有X -gal, IPTG，Amp的1. 5%瓊脂平板上，倒置平板，37°C 過夜培養(yǎng)； (六） 陽性重組克隆的篩選和鑒定 (1) 陽性重組克隆的篩選：挑取生長狀態(tài)好的白色菌斑，并提取質(zhì)粒； (2) PCR鑒定：以重組質(zhì)粒Bm - myosin/pGEM - T為模板，用Bm - myosin的引物Pl、 P2 進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系 25ul, Bm - myosin/pGEM - T 重組質(zhì)粒 I. 5ul, 10XPCR Buffer 2. 5ul, 2. 5mM dNTPmix4. Oul, PI、P2 各 0· 7ul, 5U/ul TaqDNA 聚合蛋白酶 0· 2ul, ddH20 15. 4ul ;循環(huán)參數(shù)為：94°C 3min, 94°C 50s, 51°C 45s, 72°C 90s,共 33 個(gè)循環(huán)，最后一次循 環(huán)72°C延伸反應(yīng)時(shí)間為7min，4°C冷卻終止反應(yīng)；PCR產(chǎn)物經(jīng)I. 0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定； (3) 酶切鑒定：取經(jīng)PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒，用BamH I與Xho I雙酶切，用1. 0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切片段； (七） Bm - MYOSIN二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測 分別應(yīng)用EXPASY服務(wù)器上的S0PMA、G0R、nnPredic、HNN方法以及EMBOSS程序分析預(yù) 測Bm - myosin的二級(jí)結(jié)構(gòu)； (八） Bm-MYOSIN親水性、表面可及性、抗原性、極性及柔韌性參數(shù)預(yù)測 采用Hopp&Woods親水性參數(shù)、Emini表面可及性參數(shù)、Jameson - Wolf抗原性參數(shù)、 Zimmerman極性參數(shù)和柔韌性參數(shù)預(yù)測； (九） Bm - MYOSIN T細(xì)胞表位預(yù)測 (1) 人源HLA I類分子結(jié)合表位的預(yù)測：將肌球蛋白的AA序列以FASTA格式輸入 Rankp印服務(wù)器，選擇AA長度為9 - mers，基因型為HLA - A0201、HLA - Al 101，預(yù)測HLA I 類分子結(jié)合肽，保留輸出的結(jié)果； (2) 鼠源MHC I類分子結(jié)合表位的預(yù)測：將肌球蛋白的AA序列以FASTA格式輸入 Rankp印服務(wù)器，選擇AA長度為9 - mers，基因型為H2 - d，包括H2 - KcU H2 - Ld和H2 - Dd， 為H2-d型小鼠表達(dá)的MHC I類分子；預(yù)測MHC I類分子結(jié)合肽，保留輸出的結(jié)果； (3) 人源HLA II類分子結(jié)合表位的預(yù)測：將肌球蛋白的AA序列以FASTA格式輸 入 Rankp印服務(wù)器，選擇基因型為 HLA - DRB1*0101、HLA - DRB1*0301、HLA - DRB1*0401、 HLA - DRB1*0701、HLA - DRB1*0801、HLA - DRB1*0901、HLA - DRB1*1101、HLA - DRB1*1301、 HLA - DRB1*1501，預(yù)測HLA II類分子結(jié)合肽，保留輸出的結(jié)果； (4) 鼠源MHC II類分子結(jié)合表位的預(yù)測：將肌球蛋白的AA序列以FASTA格式輸入 Rankp印服務(wù)器，選擇選擇基因型為I -AcUI -Ed，預(yù)測鼠源MHC II類分子結(jié)合肽，保留輸出 白勺結(jié)果； (十）表位基因片段的選擇 根據(jù)B細(xì)胞表位預(yù)測和T細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果，選擇富含抗原表位的基因片段 562bp -1269bp設(shè)計(jì)引物，以質(zhì)粒pcDNA3. I (+) -BmM55為模板，并將該片段克隆至原核表達(dá) 載體pET - 28a(+)中，構(gòu)建pET - BmM29。應(yīng)用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物； 上游 Pl :5' - GCGGATCCGCTAATGAATTGAATATGC - 3' 其中GGATCC為BamH I酶切位點(diǎn)； 下游 P2 :5' - CGGAATTCCTATGGTGAACGGAGTACGGT 其中GAATTC為EcoR I酶切位點(diǎn)； 引物使用前用ddH20溶解，濃度為lOymol/L ; (i^一）表位基因片段PCR擴(kuò)增 (1)以pcDNA3. 1(+) - BmM55為模板，P1、P2分別為上、下游引物，反應(yīng)體系： PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系
擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)為：
取5 μ 1樣品用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增目的基因； (十二）目的基因與載體連接與鑒定 A、PCR產(chǎn)物及pET - 28a(+)載體質(zhì)粒雙酶切體系： 雙酶切反應(yīng)體系
目的基因與載體連接，具體反應(yīng)體系： 目的基因與載體連接反應(yīng)體系
混勻，室溫反應(yīng)30min以上，產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化； B、 E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備 (1) 用接種環(huán)取保存于-80°CDH5a菌液，劃菌于不含抗生素的LB平板上，37°C倒置培 養(yǎng)約14 - 16h至單菌落出現(xiàn)； (2) 挑單菌落至5ml無抗性的LB液，37°C振蕩培養(yǎng)約10 - 12h ; (3) 取Iml過夜培養(yǎng)的菌液至含IOOml無抗LB液中，37°C振蕩培養(yǎng)約2 - 2. 5h，到OD 值達(dá)0.5,冰浴5 - IOmin; (4) 分裝到2個(gè)50ml預(yù)冷無菌的離心管，4°C，1600rpm離心7min ; (5) 用IOml冰冷的0· IM CaC12溶液重懸細(xì)胞，4°C，I IOOrpm離心5min ; (6) 用IOml冰冷的0. IM CaC12溶液重懸細(xì)胞，冰上放置30min后，4°C，IlOOrpm離心 5min ； (7) 用2ml冰冷的0. IM CaCl2溶液重懸細(xì)胞，分裝后15%甘油凍存于-80°C ; C、 轉(zhuǎn)化及鑒定 (1) 取100 μ 1貯存于-80°C鈣化菌，冰浴化開；加入10 μ 1連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴 30min ； (2) 熱休克，42°C水浴30 - 90s，勿動(dòng)； (3) 快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，冷卻I - 2min ; (4) 加2. 25ml LB液至試管，再加0. 25ml混合物，傾斜放置，37 °C，IOOrpm振蕩培養(yǎng) 45min ； (5) 5000rpm 離心 Imin ; (6) 棄部分上清，混勻后倒在含Amp的LB平板上，用涂布器涂均勻，室溫靜置，直至液體 被吸收，37°C溫箱倒置培養(yǎng)12 - 16h ; (7) 用白槍頭挑單克隆至5ml含Amp的LB液，37°C，220rpm振蕩培養(yǎng)12 -16h，至OD值 在0.6 - 0.8之間； (8) 同時(shí)按上述步驟做陽性對(duì)照、陰性對(duì)照轉(zhuǎn)化反應(yīng)； (9) 提取質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒電泳鑒定和PCR鑒定； (10) 選取PCR鑒定陽性菌液，于LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增后進(jìn)行測序； (十三）BmM29表位基因真核表達(dá)載體構(gòu)建 純化目的表位基因并亞克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 (+)的BamH I和EcoR I的克 隆位點(diǎn)。目的基因和載體的摩爾比為5:1，反應(yīng)體系25ul，16°C水浴連接過夜；取連接液轉(zhuǎn) 化感受態(tài)大腸桿菌DH5 α，涂布于LB - Amp平板上，其中每mlLB中含AmplOOmg，37°C過夜 培養(yǎng)；從LB - Amp平板上隨機(jī)挑取單個(gè)菌落，分別接種于LB - Amp培養(yǎng)基中，37°C振蕩過 夜培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)BamH I和EcoR I酶切，后I. O%瓊脂糖凝膠電泳鑒定； (十四）BmM29表位基因疫苗免疫應(yīng)答試驗(yàn) A. pcDNA3. 1 (+)和 pcDNA3. 1 (+) - BmM29 質(zhì)粒大量抽提 (1) 取IOOml過夜培養(yǎng)的菌液加入50ml離心管，12000rpm離心3min收集細(xì)菌，盡量棄 盡上清； (2) 12000rpm離心3min，用移液器把剩下的少量液體吸出； (3) 加入IOml質(zhì)粒大量抽提試劑盒的溶液1，使用渦旋振蕩器和移液器讓細(xì)胞懸浮，無 小囷塊； (4) 加入IOml質(zhì)粒大量抽提試劑盒的溶液2,立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6 - 8次，室溫靜置 5min ； (5) 加入IOml質(zhì)粒大量抽提試劑盒的溶液4,立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6 - 8次，室溫靜置 lOmin，12000rpm離心20min，將溶液全部倒入過濾柱中，慢慢推動(dòng)推柄，濾液收集在50ml離 心管中； (6) 向?yàn)V液中加8ml異丙醇，混勻后轉(zhuǎn)移到吸附柱，12000rpm離心2min，棄收集管中的 廢液； (7) 向吸附柱中加3ml去內(nèi)毒素緩沖液，室溫靜置2min，12000rpm離心2min，棄收集管 中的廢液； (8) 向吸附柱中加入漂洗液W2，12000rpm離心2min，棄收集管中的廢液。重復(fù)一次； (9) 將吸附柱重新放回收集管，12000rpm離心5min，去除吸附柱中殘余的液體。 (10) 吸附柱置于干凈的50ml收集管，加 Iml洗脫液TE，室溫靜置5min，12000rpm離心 2min ； (11) 用生理鹽水將純化的質(zhì)粒稀釋至終濃度為lmg/ml，- 20°C保存?zhèn)溆谩?br> 2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的周期型馬來絲蟲M29表位基因 DNA疫苗的制備方法，其特征 是：步驟（十二）C(7)中，OD值為0.7。
3. -種免疫佐劑，其特征是：序列如下：CpG ODN 1826 5 ^ - TCCATGACGTTCCTGACGTT - 3 ^，并全鏈硫代磷酸骨架修飾來增強(qiáng)其核酸酶抗性。
【文檔編號(hào)】A61P33/10GK104368014SQ201410564361
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月21日
【發(fā)明者】方政, 吳佳倩, 徐倩, 方浩, 張波, 陸施娟, 陶然, 劉芹, 謝東方 申請(qǐng)人:南通大學(xué)