一種載有胸苷酸合酶抑制劑的白蛋白納米微球及其制法
【專利摘要】一種載有胸苷酸合酶抑制劑的白蛋白納米微球，它是將胸苷酸合酶抑制劑和有機溶劑組成的溶液加入白蛋白溶液中，使白蛋白展開并自組裝形成納米微球，將胸苷酸合酶抑制劑包覆在蛋白納米微球中的載有胸苷酸合酶抑制劑的白蛋白納米微球，所述的白蛋白納米微球直徑40～500nm，所述白蛋白納米微球中胸苷酸酶抑制劑的質(zhì)量比例為7～20％。本發(fā)明的納米微球具有良好的生物相容性，制備流程簡便，物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，能夠增加藥物穩(wěn)定性，具有一定的緩釋作用，具有臨床治療癌癥的潛在應(yīng)用。本發(fā)明公開了其制法。
【專利說明】一種載有胸苷酸合酶抑制劑的白蛋白納米微球及其制法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001〕 本發(fā)明涉及一種載有胸苷酸合酶抑制劑的白蛋白納米微球及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]抗代謝抗腫瘤藥物通過抑制腫瘤細胞生存和復(fù)制所必需的代謝途徑，導(dǎo)致腫瘤細胞死亡。由于目前尚未發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞有獨特的代謝途徑，所以抗代謝藥物的選擇性較小，并且對增殖較快的正常組織如骨髓、消化道黏膜等也呈現(xiàn)毒性?？勾x抗腫瘤藥物的抗瘤譜比較窄，臨床上多數(shù)用于治療白血病，但對某些實體瘤也有效。由于抗代謝藥物的作用點各異，一般無交叉耐藥性。依據(jù)抗代謝基本理論的要求，抗代謝物的結(jié)構(gòu)與代謝物一般都很相似，而且大多數(shù)抗代謝物是以代謝物為先導(dǎo)化合物，利用諸如生物電子等排原理等藥物設(shè)計方法，制備其抗代謝物。臨床上常用的有嘧啶類抗代謝物、嘌呤類抗代謝物、葉酸類抗代謝物等藥物。
[0003]胸苷酸合酶是抗腫瘤藥物開發(fā)的一個重要靶點，與葉酸生物代謝相關(guān)。胸苷酸合酶是由兩個相同亞甲基單位組成的二聚蛋白質(zhì)，每個亞甲基分子量約為36乂103，在生物體內(nèi)0嫩的合成中起著重要的作用，是催化尿嘧啶脫氧核苷甲基化的關(guān)鍵酶，通過抑制胸苷酸合酶能夠抑制0嫩的生物合成，進而抑制細胞生長。胸苷酸合酶抑制劑的結(jié)構(gòu)與底物相似，與酶結(jié)合后可以阻止或抑制正常底物與酶的結(jié)合，從而干擾抑制胸苷酸合酶的生物活性，抑制0嫩合成，達到治療癌癥的效果。
[0004]納米微球由于其特有的性質(zhì)使其在藥物輸送方面具有良好的應(yīng)用前景。因為腫瘤部位的血管系統(tǒng)具有比正常部位更高的通透性(即幻效應(yīng)，高分子納米藥物載體可以充分利用這種效應(yīng)，在腫瘤等病變部位富集，達到被動靶向的目的；通過靶向基團或分子的聯(lián)合作用能夠在殺死目標細胞的基礎(chǔ)上，最大限度的減少對正常組織的傷害，減小藥物的系統(tǒng)毒性。納米微球較大的比表面積能夠吸附、結(jié)合或包覆其它小分子藥物如多肽、蛋白、核酸分子。納米微球能通過改變自身組成，增加疏水藥物的水溶性，提高小分子藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性，延長藥物分子在體內(nèi)循環(huán)的半衰期。天然大分子納米微球不僅具備傳統(tǒng)藥物輸送體系能改善藥物溶解性，增加藥物體內(nèi)循環(huán)時間和被動靶向的特點，還具有良好生物相容性，能夠改變藥物體內(nèi)分布情況，降低藥物系統(tǒng)毒性等優(yōu)點。
[0005]白蛋白是由肝實質(zhì)細胞合成，在血漿中的半衰期約為15?19天，是血漿中含量最多的蛋白質(zhì)，占血漿總蛋白的40%?60%。為含585個氨基酸殘基的單鏈多肽，分子量為66458，分子中含17個二硫鍵，不含有糖的組分。在邱=7.4的環(huán)境中，白蛋白為負離子，每分子可以帶有200個以上負電荷。它是血漿中很主要的載體，許多水溶性差的物質(zhì)可以通過與白蛋白的結(jié)合而被運輸。這些物質(zhì)包括膽紅素、長鏈脂肪酸(每分子可以結(jié)合4?6個分子〉、膽汁酸鹽、前列腺素、類固醇激素、金屬離子(⑶'附和藥物(阿司匹林、青霉素等因此白蛋白作為藥物載體具有良好的應(yīng)用前景。
[0006]金屬離子具有良好的配位作用，已經(jīng)有報道金屬離子能夠顯著增加藥物與載體之間的相互作用的平衡常數(shù)，能夠起到交聯(lián)納米微球，提高藥物緩釋性能的作用。
[0007]白蛋白在加熱的情況下能夠變性，已有報道通過加熱方法合成穩(wěn)定白蛋白微球，加熱的方法能夠在部分保留白蛋白活性結(jié)構(gòu)的前提下穩(wěn)定白蛋白納米微球，提高納米微球在不同邱和鹽濃度條件下的穩(wěn)定性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種具有生物相容性，可生物降解的，低系統(tǒng)毒性的，可用作癌癥治療的一種載有胸苷酸合酶抑制劑的白蛋白納米微球及其制備方法，解決了疏水型胸苷酸合酶抑制劑生物體內(nèi)遞送的問題。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0010]一種載有胸苷酸合酶抑制劑的白蛋白納米微球，它是將胸苷酸合酶抑制劑和有機溶劑組成的溶液加入白蛋白溶液中，使白蛋白展開并自組裝形成納米微球，將胸苷酸合酶抑制劑包覆在蛋白納米微球中的載有胸苷酸合酶抑制劑的白蛋白納米微球，所述的白蛋白納米微球直徑40?50011111，所述白蛋白納米微球中胸苷酸酶抑制劑的質(zhì)量比例為7?20%。
[0011]上述的載有胸苷酸合酶抑制劑的白蛋白納米微球，所述的白蛋白可以是牛血清白蛋白和人血清白蛋白。
[0012]上述的載有胸苷酸合酶抑制劑的白蛋白納米微球，所述的白蛋白溶液是白蛋白和改性劑的水溶液。
[0013]上述的載有胸苷酸合酶抑制劑的白蛋白納米微球，所述的改性劑是二硫蘇糖醇、巰基乙醇或谷胱甘肽，白蛋白與改性劑的質(zhì)量比為25:5.8-8.0。
[0014]上述的載有胸苷酸合酶抑制劑的白蛋白納米微球，所述的胸苷酸合酶抑制劑可以是培美曲塞、雷替曲塞或者是上述胸苷酸合酶抑制劑的組合物。
[0015]上述的載有胸苷酸合酶抑制劑的白蛋白納米微球，所述的有機溶劑可以是丙酮、乙醇或甲醇。
[0016]一種制備上述載有胸苷酸合酶抑制劑的白蛋白納米微球的方法，它包括如下步驟:
[0017]步驟1.使用含有改性劑的水溶液溶解白蛋白，白蛋白與改性劑質(zhì)量比為25:5.8-8.0，溶液中反應(yīng)物總濃度為18.5?38.2呢/111匕在371下反應(yīng)0.1?2匕；
[0018]步驟2.在步驟1的體系中加入鹽酸或氫氧化鈉溶液，調(diào)整體系邱=5-9 ；
[0019]步驟3.有機溶劑中溶解胸苷酸合酶抑制劑得到1.5111^/1111的胸苷酸合酶抑制劑溶液，加入到步驟2得到的白蛋白溶液中，控制加入藥物量208，然后蒸發(fā)除去有機溶劑，所述的有機溶劑可以是丙酮、乙醇或甲醇；
[0020]步驟4.加入體系總質(zhì)量0.1%。?1%。的金屬鹽，攪拌0.25?311后，60?70。〇加熱納米微球0?5111111 ；
[0021]步驟5.用超速離心，冷凍離心或超濾離心方法分離納米微球和未反應(yīng)原料，加入體系總質(zhì)量1?20%的藥物輔料甘露醇或葡萄糖，冷凍干燥得到載有胸苷酸合酶抑制劑的白蛋白納米微球制劑，納米微球直徑為50?500=%胸苷酸合酶抑制劑占白蛋白載藥納米微球質(zhì)量的7?20%。
[0022]上述的制備白蛋白納米微球的方法，所述的白蛋白是牛血清白蛋白或人血清白蛋白。
[0023]上述的制備白蛋白納米微球的方法，所述的改性劑是二硫蘇糖醇、巰基乙醇或谷胱甘肽。
[0024]上述的制備白蛋白納米微球的方法，步驟4所述的金屬鹽溶液可以是硫酸鈣、氯化鈣、氯化鐵、硫酸鋅或硝酸鋅的水溶液。
[0025]本發(fā)明的載有胸苷酸合酶抑制劑的改性白蛋白納米微球粒徑均一，分散性好，溶解度高，具有良好的緩釋效果和體內(nèi)性能。
[0026]本發(fā)明通過兩種方法對納米微球進行交聯(lián)，金屬離子作用后的納米微球能夠改善藥物緩釋性能，提高胸苷酸合酶抑制劑與白蛋白之間相互作用力；加熱固化能夠增強納米微球主體白蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。
[0027]本發(fā)明人通過改性的手段使白蛋白能夠以1:1?1:30的摩爾比負載胸苷酸合酶抑制劑類藥物，最后精選摩爾比為1:15?1:25胸苷酸合酶抑制劑與改性白蛋白相互作用，在疏水力的作用下成球的同時包覆藥物形成載有胸苷酸合酶抑制劑的改性白蛋白納米微球。
[0028]本發(fā)明的納米微球鑒定方法包括:動態(tài)光散射，紫外可見光譜，III細胞毒性試驗，體外藥物釋放試驗，證明了改性白蛋白納米微球的存在并與胸苷酸合酶抑制劑之間存在相互作用。
[0029]本發(fā)明涉及載有胸苷酸合酶抑制劑的改性白蛋白納米微球制劑的制備，其中包括制備載有胸苷酸合酶抑制劑的改性白蛋白納米微球山)將載有胸苷酸合酶抑制劑的改性白蛋白納米微球于藥物輔料按照一定比例混合將混合物冷凍干燥，得到粉劑。
[0030]本發(fā)明提供了一種平均粒徑為40?500=0的載有胸苷酸合酶抑制劑的改性白蛋白納米微球的方法。本發(fā)明的改性白蛋白載藥納米微球生物相容性好，結(jié)構(gòu)性質(zhì)穩(wěn)定。本發(fā)明的載藥復(fù)合納米微球很好的改進了現(xiàn)有胸苷酸合酶抑制劑的性能。

【專利附圖】

【附圖說明】
:
[0031]圖1為負載雷替曲塞的改性血清白蛋白013數(shù)據(jù)
[0032]圖2為負載雷替曲塞的改性血清白蛋白透射電鏡數(shù)據(jù)

【具體實施方式】
[0033]下面結(jié)合實施例進一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但是這些實施例并不限制本發(fā)明的保護范圍。
[0034]實施例1負載培美曲塞改性牛血清白蛋白載藥納米微球的制備
[0035]在41111反應(yīng)器中，將251118牛血清白蛋白和6.31118 二硫蘇糖醇溶于11111蒸懼水中，在371下反應(yīng)0.51！，加入氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系邱=8.0，滴加1.5呢/此培美曲塞丙酮溶液1.51111,形成納米微球，加入0.51118/1111硫酸鈣溶液20^ I反應(yīng)15分鐘后，601反應(yīng)5分鐘，371旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)15分鐘，納米微球經(jīng)過截留分子量100，000的超濾離心管離心得到改性牛血清白蛋白載藥納米微球水相分散液。加入體系總質(zhì)量2 %的甘露醇冷凍干燥，得到載藥納米微球粉劑。
[0036]實施例2負載雷替曲塞改性牛血清白蛋白載藥納米微球的制備
[0037]在4111[反應(yīng)器中，將151118牛血清白蛋白和4.811?二硫蘇糖醇溶于加[蒸懼水中，在371下反應(yīng)0.5匕加入鹽酸溶液調(diào)節(jié)體系邱=5.0，滴加1.5呢/此雷替曲塞無水乙醇溶液1.101,形成納米微球，加入0.5呢/此硫酸鋅溶液20 ^ I反應(yīng)15分鐘后，加入0.02禮硫酸鈣溶液100 ^ 1,攪拌2匕371旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)15分鐘，納米微球在12，000轉(zhuǎn)速下超速離心3-11,復(fù)溶得到改性牛血清白蛋白載藥納米微球水相分散液。加入體系總質(zhì)量2%的甘露醇冷凍干燥，得到載藥納米微球粉劑。
[0038]實施例3負載雷替曲塞改性牛血清白蛋白載藥納米微球的制備
[0039]在4111[反應(yīng)器中，將15呢牛血清白蛋白和3.5呢巰基乙醇溶于1此蒸餾水中，在371下反應(yīng)0.1卜，加入氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系邱=9.0，滴加1.5呢/此雷替曲塞無水乙醇溶液1.51111,形成納米微球，加入0.251118/1111氯化鈣溶液20^ I反應(yīng)211后，701反應(yīng)2分鐘，371旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)15分鐘，納米微球在100，000轉(zhuǎn)速下冷凍離心5-11,復(fù)溶得到改性牛血清白蛋白載藥納米微球水相分散液。加入體系總質(zhì)量5%的葡萄糖冷凍干燥，得到載藥納米微球粉劑。
[0040]實施例4負載雷替曲塞改性牛血清白蛋白載藥納米微球的制備
[0041]在4此反應(yīng)器中，將25呢牛血清白蛋白和7.3呢谷胱甘肽溶于1此蒸餾水，在371下反應(yīng)211，加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)體系邱=6.0，滴加1呢加[雷替曲塞甲醇溶液21111形成納米微球，加入0.51118/1111硝酸鋅溶液20^ [反應(yīng)21！后，701反應(yīng)3分鐘，371旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)15分鐘，納米微球在12，000轉(zhuǎn)速下超速離心3111111，復(fù)溶得到改性牛血清白蛋白載藥納米微球水相分散液。加入體系總質(zhì)量10%的乳糖冷凍干燥，得到載藥納米微球粉劑。
[0042]實施例5負載培美曲塞改性人血清白蛋白載藥納米微球的制備
[0043]在4111[反應(yīng)器中，將251118人血清白蛋白和6.31118 二硫蘇糖醇溶于1111[蒸懼水，在371下反應(yīng)0.51！，加入氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系邱=8.0，滴加1.5呢/此培美曲塞丙酮溶液1.50匕形成納米微球，加入0.51118/111[硫酸鈣溶液20 0 I反應(yīng)15分鐘后，601反應(yīng)5分鐘，371旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)15分鐘，納米微球經(jīng)過截留分子量100，000的超濾離心管離心得到改性人血清白蛋白載藥納米微球水相分散液。加入體系總質(zhì)量2 %的甘露醇冷凍干燥，得到載藥納米微球粉劑。
[0044]實施例6負載雷替曲塞改性人血清白蛋白載藥納米微球的制備
[0045]在4111[反應(yīng)器中，將151118人血清白蛋白和4.81118 二硫蘇糖醇溶于1111[蒸懼水，在371下反應(yīng)0.51！，加入鹽酸溶液調(diào)節(jié)體系邱=5.0，滴加1.5呢/此雷替曲塞無水乙醇溶液1.501,形成納米微球，加入0.5呢/此硫酸鋅溶液20仏反應(yīng)15分鐘后，加入0.02禮硫酸鈣溶液100 ^ 1,攪拌2匕371旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)15分鐘，納米微球在12，000轉(zhuǎn)速下超速離心3-11,復(fù)溶得到改性人血清白蛋白載藥納米微球水相分散液。加入體系總質(zhì)量2%的甘露醇冷凍干燥，得到載藥納米微球粉劑。
[0046]實施例7負載雷替曲塞改性人血清白蛋白載藥納米微球的制備
[0047]在4此反應(yīng)器中，將15呢牛血清白蛋白和3.5呢巰基乙醇溶于1此蒸餾水，在371下反應(yīng)0.1卜，加入氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系邱=9.0，滴加1.5呢/此雷替曲塞無水乙醇溶液
1.51111,形成納米微球，加入0.251118/1111氯化鈣溶液20^ I反應(yīng)211后，701反應(yīng)2分鐘，371旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)15分鐘，納米微球在100，000轉(zhuǎn)速下冷凍離心5111111，復(fù)溶得到改性人血清白蛋白載藥納米微球水相分散液。加入體系總質(zhì)量5%的葡萄糖冷凍干燥，得到載藥納米微球粉劑。
[0048]實施例8負載雷替曲塞改性人血清白蛋白載藥納米微球的制備
[0049]在4此反應(yīng)器中，將25呢人血清白蛋白和7.3呢谷胱甘肽溶于1此蒸餾水，在371下反應(yīng)211，加入氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系邱=6.0，滴加1呢加[雷替曲塞甲醇溶液21111形成納米微球，加入0.51118/1111硝酸鋅溶液20^ [反應(yīng)21！后，701反應(yīng)3分鐘，371旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)15分鐘，納米微球在12，000轉(zhuǎn)速下超速離心3111111，復(fù)溶得到改性人血清白蛋白載藥納米微球水相分散液。加入體系總質(zhì)量10%的乳糖冷凍干燥，得到載藥納米微球粉劑。
[0050]實施例9負載培美曲塞和雷替曲塞改性牛血清白蛋白載藥納米微球的制備
[0051]在41111反應(yīng)器中，將251118牛血清白蛋白和6.31118 二硫蘇糖醇溶于11111蒸懼水中，在371下反應(yīng)0.51！，加入氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系邱=8.0，滴加1.培美曲塞/雷替曲塞(摩爾比1:1)丙酮溶液1.501，形成納米微球，加入0.5111^/1111硫酸鈣溶液20 ^ [反應(yīng)15分鐘后，601反應(yīng)5分鐘，371旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)15分鐘，納米微球經(jīng)過截留分子量100，000的超濾離心管離心得到改性牛血清白蛋白載藥納米微球水相分散液。加入體系總質(zhì)量2%的甘露醇冷凍干燥，得到載藥納米微球粉劑。
【權(quán)利要求】
1.一種載有胸苷酸合酶抑制劑的白蛋白納米微球，其特征是:它是將胸苷酸合酶抑制劑和有機溶劑組成的溶液加入白蛋白溶液中，使白蛋白展開并自組裝形成納米微球，將胸苷酸合酶抑制劑包覆在蛋白納米微球中的載有胸苷酸合酶抑制劑的白蛋白納米微球，所述的白蛋白納米微球直徑40?500nm，所述白蛋白納米微球中胸苷酸酶抑制劑的質(zhì)量比例為7 ?20%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載有胸苷酸合酶抑制劑的白蛋白納米微球，其特征是:所述的白蛋白可以是牛血清白蛋白或人血清白蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載有胸苷酸合酶抑制劑的白蛋白納米微球，其特征是:所述的白蛋白溶液是白蛋白和改性劑的水溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載有胸苷酸合酶抑制劑的白蛋白納米微球，其特征是:所述的改性劑是二硫蘇糖醇、巰基乙醇或谷胱甘肽，白蛋白與改性劑的質(zhì)量比為25:5.8-8.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載有胸苷酸合酶抑制劑的白蛋白納米微球，其特征是:所述的胸苷酸合酶抑制劑是培美曲塞、雷替曲塞或者是上述胸苷酸合酶抑制劑的組合物。
6.一種制備權(quán)利要求1所述的載有胸苷酸合酶抑制劑的白蛋白納米微球的方法，其特征是它包括如下步驟: 步驟1.使用含有改性劑的水溶液溶解白蛋白，白蛋白與改性劑質(zhì)量比為25:5.8-8.0,溶液中反應(yīng)物總濃度為18.5?38.2mg/mL，在37°C下反應(yīng)0.1?2h ; 步驟2.在步驟I的體系中加入鹽酸或氫氧化鈉溶液,調(diào)整體系pH = 5-9 ； 步驟3.有機溶劑中溶解胸苷酸合酶抑制劑得到1.5mg/mL的胸苷酸合酶抑制劑溶液，加0.5?3mL到步驟2得到的白蛋白溶液中，控制加入藥物量約2mg，然后蒸發(fā)除去有機溶齊U，所述的有機溶劑是丙酮、乙醇或甲醇； 步驟4.加入體系總質(zhì)量0.1%。?1%。的金屬鹽，攪拌0.25?3h后，60?70°C加熱納米微球O?5min ； 步驟5.用超速離心，冷凍離心或超濾離心方法分離納米微球和未反應(yīng)原料，加入體系總質(zhì)量I?20%的藥物輔料甘露醇或葡萄糖，冷凍干燥得到載有胸苷酸合酶抑制劑的白蛋白納米微球制劑，納米微球直徑為50?500nm，胸苷酸合酶抑制劑占白蛋白載藥納米微球質(zhì)量的7?20%。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備白蛋白納米微球的方法，其特征是:所述的白蛋白是牛血清白蛋白或人血清白蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備白蛋白納米微球的方法，其特征是:所述的改性劑是二硫蘇糖醇、巰基乙醇或谷胱甘肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備白蛋白納米微球的方法，其特征是:步驟4所述的金屬鹽溶液是硫酸鈣、氯化鈣、氯化鐵、硫酸鋅或硝酸鋅的水溶液。
【文檔編號】A61K9/16GK104306339SQ201410568047
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月22日
【發(fā)明者】蔣錫群, 武偉, 張兆恒, 楊治旻, 章曉驊 申請人:南京大學(xué), 南京正大天晴制藥有限公司