用于生產(chǎn)丙型肝炎病毒多表位疫苗的表達載體PVX-6His-CTBt-Bt的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于生產(chǎn)丙型肝炎病毒多表位疫苗的表達載體PVX-6His-CTBt-Bt，該載體表達的丙型肝炎病毒多表位疫苗6His-CTBt-Bt由組氨酸標簽、口服免疫佐劑霍亂毒素B亞單位CTB和難治性丙型肝炎病毒基因型1的6個B細胞抗原表位Bp組成。為便于該疫苗在煙草高效表達，人工合成密碼子優(yōu)化的6His-CTBt-Bt基因，克隆至高效植物病毒表達載體馬鈴薯X病毒載體PVX201，獲得丙型肝炎病毒多表位疫苗6His-CTBt-Bt的重組表達載體PVX-6His-CTBt-Bt，該表達載體接種煙草，以煙草為反應器生產(chǎn)針對難治性丙型肝炎病毒的，易于純化，有較好口服免疫效果和體外抗病毒感染的抗丙型肝炎病毒疫苗。
【專利說明】用于生產(chǎn)丙型肝炎病毒多表位疫苗的表達載體PVX-6His-CTBt-Bt

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及抗病毒疫苗研發(fā)領域，尤其是涉及一種用于生產(chǎn)丙型肝炎(丙肝)病毒多表位疫苗的表達載體PVX-6HiS-CTBt-Bt。

【背景技術】
[0002]丙型肝炎病毒是丙型肝炎的致病因子，該病毒感染的世界總人數(shù)超過1.7億，我國感染人數(shù)超過4000萬。大多數(shù)丙型肝炎病毒感染者為持續(xù)性感染，進而引起慢性肝炎、肝硬化和肝細胞癌。據(jù)報道，全球40%的慢性肝病和80%的肝細胞癌與丙型肝炎病毒有關，每年全球用于丙肝治療費用超過1000億美元?，F(xiàn)有的治療藥物只對部分丙型肝炎肝病毒感染者有效，且治療時間長，成本高和有副作用。疫苗是防治，特別是預防病毒性疾病的一種極其經(jīng)濟、簡單和有效的手段。但是，至今還沒有疫苗來預防和治療丙型肝炎病毒感染。因此，研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權的丙型肝炎病毒(特別是難治性丙型肝炎病毒)基因工程多表位疫苗具有極其重要的科學價值、無可估量的商業(yè)價值和社會效益。
[0003]植物作為制備基因工程疫苗生物反應器具有生產(chǎn)成本低、安全性好、可口服、容易運輸和保存等優(yōu)點，因而成為近年來國際上疫苗研究和生產(chǎn)的一個熱點和發(fā)展趨勢。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種用于生產(chǎn)丙型肝炎病毒多表位疫苗的表達載體PVX-6His-CTBt-Btο
[0005]本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:
(I)疫苗氨基酸組成設計:
丙型肝炎肝病毒多表位疫苗氨基酸組成設計:從N端至C端依次為6個組氨酸(便于疫苗純化)，口服免疫佐劑霍亂毒素B亞單位CTB (增強疫苗口服免疫效果)，難治性丙型肝炎病毒基因型 I 的 6 個 B 細胞中和抗原表位 Bt(El313_327aa-E2396_424aa-E2438_447aa-E2523_54(laa-E261Q_627aa-E2631_648aa)o各個抗原表位之間通過一個甘氨酸和一個絲氨酸殘基隔開)。
[0006](2)疫苗密碼子優(yōu)化:
為了促進疫苗基因在煙草的高表達，利用偏愛密碼子在線分析軟件httP://yww.b1informatics.0rR/codon/cRi—bin/codon.cri 分析，合成 6His-CTBt-Bt 疫苗所需的優(yōu)化密碼子序列。
[0007](3)疫苗基因合成
為了便于6His-CTBt-Bt疫苗基因的克隆和表達，對上述優(yōu)化的丙型肝炎病毒多表位疫苗6His-CTBt_Bt密碼子序列，在其5’端引入ClaI酶切位點和煙草偏愛Kozak序列，3’端引入終止密碼子和SalI酶切位點。使用在線分析軟件http://helixweb.nih.rov/dnaworks/設計22條引物，PCR合成疫苗基因6His-CTBt_Bt。
[0008](4)疫苗表達載體構建及鑒定測序: PCR合成的6His-CTBt-Bt疫苗基因和馬鈴薯X病毒載體PVX201，使用ClaI和SalI雙酶切，連接，獲得疫苗表達載體PVX_6Hi s-CTBt-Bt，對表達載體進行酶切和測序鑒定。
[0009](5)疫苗在煙草的表達和Western blot鑒定:
金剛砂磨損煙葉葉片，在磨損處接種疫苗表達載體PVX-6His-CTBt-Bt，同時以馬鈴薯X病毒PVX201 (陰性對照)和PVX204 (攜帶GFP基因接種煙葉作為對照，每個葉片接種病毒載體量為2-4 μ g。通過觀察GFP蛋白表達驗證、優(yōu)化病毒接種和復制效果，制備煙草的蛋白提取物，分別使用鼠源的6 X His Tag抗體(LanPower ?)和CTB抗體(antibodies-onlineInc), Western blot檢測疫苗表達。Ni柱純化表達的疫苗蛋白6His-CTBt_Bt。
[0010](6)動物實驗測定疫苗的免疫特性和安全性:
Ni柱純化的疫苗蛋白口服免疫四周齡的BALB/c鼠三次(免疫時間為1，14和28天)，每次每只鼠免疫10 Pg的疫苗蛋白。不含疫苗的煙葉蛋白提取物(10 Pg)免疫的鼠作為對照。實驗組及對照組分別免疫三只鼠。不同時間取血，2倍系列稀釋，ELISA測定不同時期(1,14, 28，56和70天)抗體的滴度。陽性血清的OD值(490nm)大于陰性對照(疫苗免疫前的鼠血清和未進行疫苗免疫的鼠血清)OD值至少2倍的條件下，陽性血清的最大稀釋度為此抗體的滴度。同時，疫苗免疫鼠前后，監(jiān)測鼠體溫和飲食，初步分析疫苗的安全性。
[0011](7)丙肝病人血清反應實驗測定疫苗的人體內(nèi)抗原性:
ELISA測定30個隨機選取的臨床難治性丙型肝炎病毒(基因型I)病人血清(來自浙江省)與疫苗蛋白的反應性。20個隨機選取的臨床丙型肝炎病毒陰性血清(來自浙江省)作為陰性對照。陽性血清的OD值大于陰性對照OD值(20個丙型肝炎病毒陰性血清的平均值)2倍的條件下，判定疫苗蛋白與該陽性血清有反應性。
[0012](8)病毒進入抑制實驗測定疫苗的病毒感染抑制效果:
丙型肝炎病毒基因I型假病毒粒子(攜帶熒光素酶基因)用I mg/ml的疫苗蛋白或0.5mg/ml的CD81抗體(丙型肝炎病毒進入抑制的陽性對照)37度孵育2小時，然后，未孵育和孵育的假病毒粒子分別感染Huh7細胞。三天后，收獲病毒感染的細胞，熒光素活性(病毒滴度的指示劑)實驗測定每種細胞內(nèi)的病毒滴度，確定疫苗對病毒感染的抑制效果。
[0013]本發(fā)明依托已有的丙型肝炎病毒及其防治研究基礎，基于煙草偏愛密碼子和我國流行的難治性丙型肝炎病毒基因型I序列分析，利用馬鈴薯X病毒載體PVX201，通過分子生物學技術構建了用于生產(chǎn)難治性丙型肝炎病毒多表位疫苗的重組馬鈴薯X病毒表達載體PVX-6His-CTBt-Bt，該表達載體接種煙草，可生產(chǎn)具備免疫原性和體外抗型肝炎病毒感染的丙肝疫苗。
[0014]丙型肝炎病毒疫苗表達載體PVX-6His-CTBt_Bt及丙型肝炎病毒多表位疫苗6His-CTBt-Bt可用來生產(chǎn)預防性或治療性的丙型肝炎病毒疫苗或生產(chǎn)丙型肝炎病毒診斷試劑盒。
[0015]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1: PVX-6His-CTBt-Bt載體的構建示意圖，A:PVX-6His-CTBt_Bt載體示意圖；B:Apal/Sall酶切鑒定重組表達載體PVX-6His-CTBt_Bt ；
圖2:疫苗在煙草的表達和鑒定示意圖，A:PVX204和PVX201接種煙葉，12天后，制備煙葉蛋白提取物，Western blot檢測(;B:PVX-6His-CTBt-Bt和PVX201接種煙葉，12天后，制備蛋白提取物，分別使用6XHis Tag抗體(上圖)和CTB抗體(下圖)，Western blot檢測；
圖3:疫苗的純化和免疫原性示意圖，A:Ni柱純化的疫苗蛋白6His-CTBt-Bt; B:丙肝疫苗6His-CTBt-Bt免疫鼠血清的抗體滴度，M1，M2和M3表示疫苗免疫的三只鼠；
圖4:疫苗與丙型肝炎病毒感染病人血清反應的示意圖，ELISA測定丙肝疫苗與臨床難治性丙型肝炎病毒(基因型I)感染病人血清反應性，臨床丙型肝炎病毒陰性血清作為陰性對照。丙型肝炎病毒陽性血清的OD值大于陰性對照OD值(20個丙型肝炎病毒陰性血清的平均值)2倍的條件下，判定疫苗蛋白與該陽性血清有反應性；
圖5:疫苗體外抑制難治性丙型肝炎病毒(基因型I)的感染示意圖，丙型肝炎病毒(基因型I)假病毒粒子用疫苗蛋白6His-CTBt-Bt，37度孵育2小時后感染Huh7細胞。3天后，收獲細胞，測定熒光素酶活性(病毒粒子滴度的指示劑)。
[0016]【具體實施方式】:
下面結合附圖和實施方式對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
[0017]實施例1
PVX-6His-CTBt-Bt載體的構建與鑒定，其方法如下:
(I)疫苗氨基酸組成設計:
丙型肝炎肝病毒多表位疫苗氨基酸組成設計:從N端至C端依次為6個組氨酸(便于疫苗純化)，口服免疫佐劑霍亂毒素B亞單位CTB (增強疫苗口服免疫效果)，難治性丙型肝炎病毒基因型 I 的 6 個 B 細胞中和抗原表位 Bt(El313_327aa-E2396_424aa-E2438_447aa-E2523_54(laa-E261Q_627aa-E2631_648aa)o各個抗原表位之間通過一個甘氨酸和一個絲氨酸殘基隔開)。
[0018]按上述要求設計的丙型肝炎肝病毒疫苗6His-CTBt_Bt氨基酸序列為:
His His His His His His Met He Lys Leu Lys Phe Gly Val Phe Phe
151015
Thr Val Leu Leu Ser Ser Ala Tyr Ala His Gly Thr Pro Gln Asn Ile
202530
Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His Asn Thr Gln He His Thr Leu Asn
354045
Asp Lys He Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met
505560
Ala Ile He Thr Phe Lys Asn Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro
65707580
Gly Ser Gln His He Asp Ser Gln Lys Lys Ala He Glu Arg Met Lys
859095
Asp Thr Leu Arg He Ala Tyr Leu Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys Leu
100105110
Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala He Ala Ala He Ser Met
115120125
Ala Asn He Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp
130135140
Ser Gly Ser Ala Ser Gly He Thr Ser Leu Phe Ser Arg Gly Pro Ser145150155160
Gln Lys lie Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp His lie Asn Arg

165170175
Gly Ser Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Ala His Arg Phe Gly Ser
180185190
Gly Val Pro Thr Tyr Asn Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu
195200205
Leu Asn Gly Ser Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr
210215220
Val Asn Phe Thr lie Phe Gly Ser Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His
225230235240
Arg Leu Asp Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg

245250
(2)疫苗密碼子優(yōu)化:
為了促進疫苗基因在煙草的高表達，利用偏愛密碼子在線分析軟件http://Vww.b1informatics, org/codon/cgi~bin/codon, cgi 分析，合成 6His-CTBt-Bt 疫苗所需的優(yōu)化密碼子序列為:
catatcgatg ccatgggaca tcatcatcat catcatatga ttaagcttaa gtttggagtt60
ttttttactg ttcttctttc ttctgcttat gctcatggaa ctccacaaaa tattactgat120
ctttgtgctg aatatcataa tactcaaatt catactctta atgataagat tttttcttat180
actgaatctc ttgctggaaa gagagaaatg gctattatta cttttaagaa tggagctact240
tttcaagttg aagttccagg atctcaacat attgattctc aaaagaaggc tattgaaaga300
atgaaggata ctcttagaat tgcttatctt actgaagcta aggttgaaaa gctttgtgtt360
tggaataata agactccaca tgctattgct gctatttcta tggctaatat tactggacat420
agaatggctt gggatatgat gatgaattgg tctggatctg cttctggaat tacttctctt480
ttttctagag gaccatctca aaagattcaa cttgttaata ctaatggatc ttggcatatt540
aatagaggat ctggatttct tgctgctctt ttttatgctc atagatttgg atctggagtt600
ccaacttata attggggaga aaatgaaact gatgttcttc ttcttaatgg atctgattat660
ccatatagac tttggcatta tccatgtact gttaatttta ctatttttgg atctatgtat720
gttggaggag ttgaacatag acttgatgct gcttgtaatt ggactaga768
(3)疫苗基因合成
為了便于6His-CTBt-Bt疫苗基因的克隆和表達，對上述優(yōu)化的丙型肝炎病毒多表位疫苗6His-CTBt_Bt密碼子序列，在其5’端引入ClaI酶切位點和煙草偏愛Kozak序列，3’端引入終止密碼子和SalI酶切位點。使用在線分析軟件http://helixweb.nih.rov/dnaworks/設計如下22條引物:
1
catatcgatg ccatgggaca tcatcatcat catcatatga ttaagcttaa gttt54
2
cagaagaaag aagaacagta aaaaaaactc caaacttaag cttaatcata tgatgatgat603
gtttttttta ctgttcttct ttcttctgct tatgctcatg gaactccaca aaatattact60
4
tgaatttgag tattatgata ttcagcacaa agatcagtaa tattttgtgg agttccatga60
5
gtgctgaata tcataatact caaattcata ctcttaatga taagattttt tcttatactg60
a61
6
gccatttctc tctttccagc aagagattca gtataagaaa aaatcttatc attaagagta60
7
gctggaaaga gagaaatggc tattattact tttaagaatg gagctacttt tcaagttgaa60
8
cttcttttga gaatcaatat gttgagatcc tggaacttca acttgaaaag tagctccatt60
9
tctcaacata ttgattctca aaagaaggct attgaaagaa tgaaggatac tcttagaatt60
10
agcttttcaa ccttagcttc agtaagataa gcaattctaa gagtatcctt cattctttca60
11
ctgaagctaa ggttgaaaag ctttgtgttt ggaataataa gactccacat gctattgctg60
12
aagccattct atgtccagta atattagcca tagaaatagc agcaatagca tgtggagtct60
13
aatattactg gacatagaat ggcttgggat atgatgatga attggtctgg atctgcttct60
14
cttttgagat ggtcctctag aaaaaagaga agtaattcca gaagcagatc cagaccaatt60
15
tttttctaga ggaccatctc aaaagattca acttgttaat actaatggat cttggcatat60
16
aaaagagcag caagaaatcc agatcctcta ttaatatgcc aagatccatt agtattaaca60
17
ctggatttct tgctgctctt ttttatgctc atagatttgg atctggagtt ccaacttata60
18
taagaagaag aacatcagtt tcattttctc cccaattata agttggaact ccagatccaa60
19
aaaatgaaac tgatgttctt cttcttaatg gatctgatta tccatataga ctttggcatt22
20
gatccaaaaa tagtaaaatt aacagtacat ggataatgcc aaagtctata tggataatca60
21
tgtactgtta attttactat ttttggatct atgtatgttg gaggagttga acatagactt60
22
gaggtcgact tatctagtcc aattacaagc agcatcaagt ctatgttcaa ctcctccaa59
使用上述22條引物，PCR合成疫苗基因6His-CTBt-Bt。
[0019](4)疫苗表達載體構建及鑒定測序:
PCR合成的6His-CTBt-Bt疫苗基因和馬鈴薯X病毒載體PVX201 (英國David Baulcombe教授惠贈)，使用ClaI和SalI雙酶切，連接，獲得疫苗表達載體PVX-6Hi s-CTBt-Bt，對表達載體進行酶切和測序鑒定。
[0020]按前面所述實驗方法構建丙型肝炎病毒基因工程多表位疫苗的重組表達載體PVX-6His-CTBt-Bt載體(圖1A)，Apal/Sall酶切鑒定表明構建載體正確(圖1B)，測序進一步證實:疫苗6Hi s-CTBt-Bt的序列與設計序列吻合，表明重組表達載體PVX-6His-CTBt-Bt已成功構建。
[0021]疫苗6His-CTBt_Bt的測序序列如下:
gccatgggac atcatcatca tcatcatatg attaagctta agtttggagt tttttttact60
gttcttcttt cttctgctta tgctcatgga actccacaaa atattactga tctttgtgct120
gaatatcata atactcaaat tcatactctt aatgataaga ttttttctta tactgaatct180
cttgctggaa agagagaaat ggctattatt acttttaaga atggagctac ttttcaagtt240
gaagttccag gatctcaaca tattgattct caaaagaagg ctattgaaag aatgaaggat300
actcttagaa ttgcttatct tactgaagct aaggttgaaa agctttgtgt ttggaataat360
aagactccac atgctattgc tgctatttct atggctaata ttactggaca tagaatggct420
tgggatatga tgatgaattg gtctggatct gcttctggaa ttacttctct tttttctaga480
ggaccatctc aaaagattca acttgttaat actaatggat cttggcatat taatagagga540
tctggatttc ttgctgctct tttttatgct catagatttg gatctggagt tccaacttat600
aattggggag aaaatgaaac tgatgttctt cttcttaatg gatctgatta tccatataga660
ctttggcatt atccatgtac tgttaatttt actatttttg gatctatgta tgttggagga720
gttgaacata gacttgatgc tgcttgtaat tggactagat aa762
實施例2
疫苗在煙草的表達和Western blot鑒定,其方法如下:
金剛砂磨損煙葉葉片，在磨損處接種疫苗表達載體PVX-6His-CTBt-Bt，同時以馬鈴薯X病毒PVX201 (陰性對照)和PVX204 (攜帶GFP基因接種煙葉作為對照，每個葉片接種病毒載體量為2-4 μ g。通過觀察GFP蛋白表達驗證、優(yōu)化病毒接種和復制效果，制備煙草的蛋白提取物，分別使用鼠源的6 XHis Tag抗體(LanPower ?)和CTB抗體(antibodies-onlineInc), Western blot檢測疫苗表達。Ni柱純化表達的疫苗蛋白6His-CTBt_Bt。
[0022]按前面所述實驗方法，重組表達載體PVX-6His-CTBt_Bt接種煙草。同時，作為病毒載體接種的陽性對照PVX204 (表達GFP基因)接種煙葉，12天后，Western blot檢測證實接種PVX204煙葉表達了 GFP蛋白，但是，接種PVX201的煙葉，沒有GFP蛋白表達(圖2A)。因此，12天后，制備重組表達載體PVX-6His-CTBt-Bt接種煙草的蛋白提取物，分別使用6XHis Tag抗體(圖2A上)和CTB抗體(圖2A下)，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)轉染疫苗表達載體PVX-6His-CTBt-Bt的煙草成功表達了疫苗(圖2B)，作為陰性對照，接種空載體PVX201的煙草中沒有疫苗蛋白帶的出現(xiàn)(圖2B)。這些結果表明:重組表達載體PVX-6His-CTBt-Bt接種的煙草成功表達了丙肝疫苗6Hi s-CTBt-Bt。
[0023]實施例3
動物實驗測定疫苗的免疫特性和安全性，其方法如下:
Ni柱純化的疫苗蛋白口服免疫四周齡的BALB/c鼠三次(免疫時間為1，14和28天)，每次每只鼠免疫10 Pg的疫苗蛋白。不含疫苗的煙葉蛋白提取物(10 Pg)免疫的鼠作為對照。實驗組及對照組分別免疫三只鼠。不同時間取血，2倍系列稀釋，ELISA測定不同時期(1,14, 28，56和70天)抗體的滴度。陽性血清的OD值(490nm)大于陰性對照(疫苗免疫前的鼠血清和未進行疫苗免疫的鼠血清)OD值至少2倍的條件下，陽性血清的最大稀釋度為此抗體的滴度。同時，疫苗免疫鼠前后，監(jiān)測鼠體溫和飲食，初步分析疫苗的安全性。
[0024]按前面所述實驗方法，Ni柱純化疫苗蛋白6His-CTBt_Bt (圖3A，Lane 1，疫苗蛋白量約為煙草提取物總蛋白量的0.18%)，純化的疫苗蛋白口服免疫BALB/c鼠三次(免疫時間為1，14和28天)，ELISA測定不同時期(1，14，28，56和70天)抗體的滴度。與對照組(不含疫苗的煙草提取物免疫鼠)相比，14天時疫苗免疫鼠檢測到抗體出現(xiàn)，56天時達到峰值(三只疫苗免疫鼠血清的抗體滴度分別為:1 =90000 ； 1:60000 ；1:80000),然后抗體滴度下降(圖3B)。這些結果表明:煙草表達的丙肝疫苗免疫鼠，誘導了體液免疫反應。同時，疫苗免疫前后，鼠體溫和進食量沒有明顯變化，表明疫苗免疫鼠并沒有對鼠產(chǎn)生明顯的體內(nèi)毒性。
[0025]實施例4
丙肝病人血清反應實驗測定疫苗的人體內(nèi)抗原性，其方法如下:
ELISA測定30個隨機選取的臨床難治性丙型肝炎病毒(基因型I)病人血清(來自浙江省)與疫苗蛋白的反應性。20個隨機選取的臨床丙型肝炎病毒陰性血清(來自浙江省)作為陰性對照。陽性血清的OD值大于陰性對照OD值(20個丙型肝炎病毒陰性血清的平均值)2倍的條件下，判定疫苗蛋白與該陽性血清有反應性。
[0026]實施例3發(fā)現(xiàn)煙草表達的疫苗6His-CTBt_Bt誘導鼠產(chǎn)生高滴度的抗體，說明煙草表達的丙肝疫苗6His-CTBt-Bt在鼠體內(nèi)具有很好的免疫原性。為了進一步確定是否煙草表達的疫苗在人體內(nèi)也具有免疫原性，ELISA實驗測定丙肝疫苗與臨床難治性丙型肝炎病毒(基因型I)病人血清的反應性。臨床丙型肝炎病毒陰性血清作為陰性對照。丙肝疫苗6His-CTBt-Bt與30個臨床難治性丙型肝炎病毒(基因型I)病人血清中的29個發(fā)生反應，反應率為96.67%(圖4)。這些結果表明煙草表達的丙肝疫苗6His-CTBt-Bt在人體內(nèi)具有很好的抗原性，也說明煙草表達的6His-CTBt-Bt可應用于臨床難治性丙型肝炎病毒(基因型I)感染者的診斷。
[0027]實施例5
病毒進入抑制實驗測定疫苗的病毒感染抑制效果，其方法如下:
丙型肝炎病毒基因I型假病毒粒子(攜帶熒光素酶基因，日本Takaji Wakita教授惠贈)用I mg/ml的疫苗蛋白或0.5 mg/ml的⑶81抗體(丙型肝炎病毒進入抑制的陽性對照)37度孵育2小時，然后，未孵育和孵育的假病毒粒子分別感染Huh7.5.1細胞(美國FrancisV.Chisari教授惠贈)。三天后，收獲病毒感染的細胞，熒光素活性(病毒滴度的指示劑)實驗測定每種細胞內(nèi)的病毒滴度，確定疫苗對病毒感染的抑制效果。
[0028]按前面所述實驗方法，難治性丙型肝炎病毒(基因型I)假病毒粒子用疫苗蛋白孵育，感染Huh7.5.1細胞。3天后，收獲細胞，測定熒光素酶活性(病毒粒子滴度的指示劑)。與未孵育的難治性丙型肝炎病毒(基因型I)假病毒粒子相比，丙肝疫苗6His-CTBt-Bt孵育強烈抑制病毒粒子感染，使病毒感染性降低了 86.5%。作為陽性對照，CD81孵育病毒粒子顯著降低了病毒感染性(圖4)。這些結果表明:煙草表達的疫苗6His-CTBt-Bt在體外具備很強的中和難治性丙型肝炎病毒(基因型I)病毒感染的能力。
【權利要求】
1.丙型肝炎病毒疫苗表達載體PVX-6His-CTBt-Bt及丙型肝炎病毒多表位疫苗6His-CTBt-Bt在制備丙型肝炎病毒疫苗中的應用。
2.丙型肝炎病毒疫苗表達載體PVX_6His-CTBt-Bt及丙型肝炎病毒多表位疫苗6His-CTBt-Bt在丙型肝炎病毒診斷中的應用。
【文檔編號】A61K39/29GK104353071SQ201410569549
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月23日 優(yōu)先權日:2014年10月23日
【發(fā)明者】孔令保, 黃明潔, 郭韞麗 申請人:江西農(nóng)業(yè)大學