聚乙二醇化磷脂為載體的膠束多肽疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種聚乙二醇化磷脂為載體的膠束多肽疫苗，所述疫苗能夠預(yù)防或治療腫瘤，所述的膠束多肽疫苗由聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和多肽疫苗自組裝形成，所述的聚乙二醇化磷脂為聚乙二醇(親水嵌段)通過共價鍵和磷脂分子(疏水嵌段)上的含氮堿基結(jié)合形成的化合物。膠束疫苗的粒徑為10～100nm，所述的膠束多肽疫苗中裝載的多肽抗原為長度為5～100個氨基酸的多肽疫苗，根據(jù)需要，該膠束多肽疫苗還包含調(diào)節(jié)機體免疫功能的免疫佐劑。
【專利說明】聚乙二醇化磷脂為載體的膠束多肽疫苗

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領(lǐng)域，具體而言，涉及一種以聚乙二醇化磷脂為載體的膠束 多肽疫苗，及其制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 以納米尺度材料作為載體設(shè)計的腫瘤治療性疫苗是治療腫瘤的新思路。已有的 研究表明，利用納米尺度材料載體攜帶蛋白抗原，能夠提高抗原的免疫原性，這種現(xiàn)象可能 與納米尺度材料相對巨大的比表面積和復(fù)雜的結(jié)構(gòu)有關(guān)；同時納米尺度材料載體對蛋白 抗原能夠起到一定程度的保護(hù)，防止蛋白抗原很快地被血液中的蛋白酶和內(nèi)網(wǎng)系統(tǒng)降解， 有利于蛋白抗原發(fā)揮作用；另外，攜帶有蛋白抗原的納米尺度材料載體易被抗原呈遞細(xì)胞 (antigen present cells, APCs),特別是樹突狀細(xì)胞（Dendritic Cells, DCs),攝取和加 工，從而使DCs處理和呈遞大量蛋白抗原，引發(fā)更為有效的免疫反應(yīng)。使用特定的納米尺度 材料包載腫瘤特異性抗原和免疫佐劑組成腫瘤治療性疫苗，接種腫瘤患者能夠刺激患者的 免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生殺傷腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)，減小甚至清除手術(shù)或放、化療后體內(nèi)殘存的腫瘤 病灶。
[0003] 目前雖然已經(jīng)出現(xiàn)多種以納米尺度材料為載體的腫瘤疫苗設(shè)計方案，但都存在 一些關(guān)鍵性的技術(shù)障礙。以病毒（viruses)、病毒樣顆粒（virus-like particles)或 病毒顆粒（virosomes)作為載體的腫瘤疫苗（l.Arlen PM, et al. A randomized phase II study ofdocetaxel alone or in combination with PANVAC-V(vaccinia) and PANVAC-F(fowlpox)in patients with metastatic breast cancer(NCI 05-C-0229). Cl in Breast Cancer. 2006 ；7 :176 - 179. ；2.Gulley JL, et al.Immunologic and prognostic factors associated with overall survival employing a poxviral-based PSA vaccine in metastatic castrate-resistant prostate cancer. Cancer Tmmunol Immunother. 2009)，雖然能夠在使用初期刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，但由于病毒的蛋白成分 本身就是有效的抗原同時組成占優(yōu)，因此引發(fā)的免疫反應(yīng)主要是針對病毒載體本身的抗原 而非病毒載體攜帶的腫瘤特異性抗原，降低了免疫反應(yīng)的效率，特別是在腫瘤特異性抗原 的抗原性比較弱的情況下，這種效應(yīng)更為明顯；而為了提高治療性疫苗的免疫治療效果，通 常要進(jìn)行多次免疫，這種情況下前次免疫引發(fā)的針對病毒載體本身的免疫反應(yīng)（主要是抗 體反應(yīng)），會大大降低后續(xù)免疫治療的效果；此外以常見病毒，例如腺病毒，痘病毒等為載 體設(shè)計的疫苗，往往因為患者可能的早期病毒感染產(chǎn)生的免疫保護(hù)而顯著降低疫苗的免疫 治療效果（Huang X，Yang Y. Innate immune recognition of viruses and viral vectors. Hum Gene Ther. 2009 ；20:293 - 301.)〇
[0004] 以脂質(zhì)體為載體的納米疫苗，載體本身不具有免疫原性，能夠有效提高腫瘤特 異性抗原的免疫效率，但是，脂質(zhì)體載體由于尺度和成分的原因，經(jīng)過皮下接種后其顆粒 并不能有效地擴散入引流淋巴結(jié)，一部分疫苗成分長時間駐留在接種部位，隨之而來的， 免疫產(chǎn)生的腫瘤特異性抗原細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞（Cytotoxic lymphocytes, CTLs)會有 很大一部分遷移至疫苗接種部位而非腫瘤生長部位,大大降低了針對腫瘤的特異性免疫 反應(yīng)(Hailemichael Y, et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8+T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nat Med. 2013 ； 19(4) :465-72.)。另外，由于脂質(zhì)體制備的特點，得到的產(chǎn)物往往均一性較差，顆粒尺度跨 度很大，而且批次之間的重復(fù)性也一般，在質(zhì)量控制上存在一定的難度。
[0005] 膠束載體，是一種由同時包含疏水嵌段和親水嵌段的雙親性聚合物分子自組裝成 的納米顆粒，膠束納米顆粒的組裝是聚合物分子在水溶液中自發(fā)形成熱力學(xué)穩(wěn)定體系，這 個過程是由疏水片段從水溶液中撤出并自發(fā)堆積聚合引起的自由能降低推動的。與低分 子量表面活性劑相比，雙親性聚合物的臨界膠團(tuán)濃度（critical micelle concentration, CMC)更低，這使得聚合物膠束更能對抗溶液的稀釋，同時，疏水嵌段組成的膠束核結(jié)構(gòu)緊 密，在生理環(huán)境中被大量體液稀釋后，不容易解離，穩(wěn)定性更好。雙親性聚合物分子的親水 性嵌段大都選用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG)，聚乙二醇水溶性良好，具有高度 水合特性，在膠束顆粒的外殼區(qū)域能夠為膠束顆粒提供足夠的空間位阻。此外，它的生物 相容性良好，是通過FDA認(rèn)證的廣泛使用的藥用輔料。雙親性聚合物分子的疏水嵌段材料 比較豐富，是決定膠束載體載藥效率和穩(wěn)定性的主要因素。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，疏水嵌段 中的親脂基團(tuán)可分為三類，聚酯（polyester)衍生物,聚氨基酸（poly(amino acid))衍生 物和普郎尼克類（Pluronics)。聚酯類內(nèi)核嵌段中，聚乳酸（poly(lactic acid)，PLA)，聚 己內(nèi)麗（poly(caprolactone)，PCL)和聚輕基乙酸（poly(glycolic acid))均為 FDA 認(rèn) 可的具有良好生物相容性的材料。聚氨基酸類內(nèi)核嵌段中，聚天冬氨酸（poly(aspartic acid)，PAsp)，聚谷氨酸（poly (glutamic acid)，PGlu)，聚賴氨酸（poly (L-Iysine)，PLys)， 聚組氨酸（poly (histidine), PHis)等材料已被普遍利用。Pluronics為聚環(huán)氧乙燒-聚環(huán) 氧丙烷-聚環(huán)氧乙烷組成的三嵌段共聚物，可以表示為PE0m-PP0n-PE0m。
[0006] 聚乙二醇化磷脂是一種新型的雙親性聚合物分子。其親水嵌段為聚乙二醇，疏水 嵌段為磷脂分子。聚乙二醇分子通過共價鍵與磷脂分子上的含氮堿基結(jié)合。目前，聚乙二 醇化磷脂作為包載材料主要是用于包載小分子化療藥物，其優(yōu)點包括：其優(yōu)點如下：1)疏 水內(nèi)核磷脂可以包載難溶性藥物，大大提高藥物的溶解能力；2)親水外殼聚乙二醇可以保 護(hù)膠束內(nèi)部的藥物分子不被外界吸附或降解，能夠幫助藥物逃逸網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的攝取，延 長藥物循環(huán)時間；3)控制藥物的釋放，優(yōu)化藥物的體內(nèi)分布以達(dá)到更好的治療效果（不會 引發(fā)免疫反應(yīng)）。但是，有關(guān)聚乙二醇化磷脂膠束對蛋白或多肽的包載研究極少，有關(guān)聚乙 二醇化磷脂制備的膠束作為載體系統(tǒng)開發(fā)的腫瘤治療性疫苗的研究國內(nèi)外均未見報道。
[0007] 單磷酰脂A (Monophosphoryl Lipid A, MPLA)是一類較為常見的免疫佐劑（結(jié)構(gòu) 見圖9)，其是通過化學(xué)修飾來源于沙門氏菌R595的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS)而 得到的新型的免疫佐劑。與LPS相比，MPLA基本保留了免疫刺激能力，但是內(nèi)毒素毒性大 大降低，因此成為了一種更加安全且有效的免疫佐劑，并已被美國FDA批準(zhǔn)作為免疫佐劑 進(jìn)入臨床。與LPS發(fā)揮作用的分子機制相似，MPLA也是通過與Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR) 4相作用，激活其下游與天然免疫相關(guān)的信號通路，激活天然免疫反應(yīng)，促進(jìn) 干擾素 Y和腫瘤壞死因子α的表達(dá)；與此同時活化樹突狀細(xì)胞，進(jìn)而進(jìn)一步激活獲得性免 疫反應(yīng)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明涉及一種能夠預(yù)防和治療腫瘤的膠束多肽疫苗。
[0009] 本發(fā)明所述的膠束多肽疫苗由聚乙二醇化磷脂（PEG-PE)和多肽疫苗自組裝形 成，所述的聚乙二醇化磷脂為聚乙二醇（親水嵌段）通過共價鍵和磷脂分子（疏水嵌段） 上的含氮堿基結(jié)合形成的化合物。
[0010] 本發(fā)明所述的聚乙二醇化磷脂分子中的聚乙二醇親水嵌段為分子量500?10000 的PEG分子，優(yōu)選為PEG1500?3000,最優(yōu)選為PEG2000。
[0011] 本發(fā)明所述的膠束疫苗的粒徑為10?IOOnm,優(yōu)選為10?50nm，最優(yōu)選為20nm。
[0012] 本發(fā)明所述的多肽疫苗為長度為5?100個氨基酸的多肽疫苗，優(yōu)選為10?50 個氨基酸的多肽疫苗，更優(yōu)選為20?30個氨基酸的多肽疫苗，最優(yōu)選為E7多肽或OT-I多 肽。
[0013] 本發(fā)明所述的E7抗原多肽為來源于人16型乳頭瘤病毒（HPV16)腫瘤的相關(guān)抗 原，在N端連接一個棕櫚酸分子，即E7 43_62序列：棕櫚酸-GQAEroRAHYNIVTFCCK⑶；
[0014] 本發(fā)明所述的OT-I多肽為來源于卵清蛋白（OVA)的17個氨基酸的多肽，包 含OVA蛋白在H-2Kb分型小鼠特異性CTL表位0VA257-264,氨基酸序列結(jié)構(gòu)為棕櫚 酸-EQLESIINFEKLTEWKD。
[0015] 本發(fā)明所述的膠束多肽疫苗還可以包含調(diào)節(jié)機體免疫功能的免疫佐劑，所述的免 疫佐劑包括弗氏佐劑、氫氧化鋁佐劑、單磷酰脂A佐劑，優(yōu)選為單磷酰脂A(MPLA)佐劑。
[0016] 本發(fā)明所述的膠束多肽疫苗中，聚乙二醇化磷脂聚合物分子、多肽抗原、免疫佐劑 的用量摩爾比例范圍720 :4?160 :3?80,最優(yōu)選摩爾比180 :4 :3。
[0017] 本發(fā)明所述的膠束多肽疫苗制劑為溶液形式或凍干形式。
[0018] 本發(fā)明所述的膠束多肽疫苗的制備方法為：
[0019] (1)以易揮發(fā)有機溶劑溶解PEG-PE載體分子、疫苗分子、佐劑分子，制備載體分子 溶液、疫苗溶液、佐劑溶液；
[0020] (2)按照特定比例將步驟（1)所獲得的載體分子溶液、疫苗溶液、佐劑溶液混勻；
[0021] (3)除去步驟（2)所獲得的混合溶液中的全部有機溶劑，使載體分子、疫苗分子和 佐劑分子形成分布均勻的混合脂膜；
[0022] (4)以一定量的生理鹽水溶解步驟（3)所獲得的混合脂膜，溫育條件下使脂膜水 化均勻，隨后室溫靜置一定時間，獲得膠束疫苗溶液；
[0023] (5)將步驟（4)所獲得的膠束疫苗溶液用0. 22 μ m的濾膜過濾除菌；
[0024] (6)根據(jù)需要，向步驟（5)所獲得膠束疫苗溶液中添加一定量的凍干保護(hù)劑后對 膠束疫苗溶液進(jìn)行凍干，制備膠束疫苗凍干粉。
[0025] 本發(fā)明所述的膠束多肽疫苗的制備方法步驟（1)中所述的易揮發(fā)有機溶劑為，甲 醇、氯仿、乙醇或其混合物。
[0026] 本發(fā)明所述的膠束多肽疫苗的制備方法步驟（3)中所述的除去有機溶劑的方法 優(yōu)選為減壓水浴加熱旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。
[0027] 本發(fā)明所述的膠束多肽疫苗的制備方法步驟（4)中所述的溫育條件優(yōu)選為55°C 水浴孵育30分鐘。
[0028] 本發(fā)明所述的膠束多肽疫苗的制備方法步驟￠)中所述的凍干保護(hù)劑優(yōu)選為濃 度為0.05g/ml的甘露醇。
[0029] 本發(fā)明還涉及所述的膠束多肽疫苗制劑在治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用，所述腫瘤包 括非實體瘤與實體瘤，所述應(yīng)用具體為，通過皮下注射或靜脈注射的方式，給予患者一定劑 量的所述膠束多肽疫苗制劑。
[0030] 本發(fā)明還涉及所述的膠束多肽疫苗制劑在預(yù)防腫瘤中的應(yīng)用，所述腫瘤包括非實 體瘤與實體瘤，所述應(yīng)用具體為，通過皮下注射或靜脈注射的方式，給予患者一定劑量的所 述膠束多肽疫苗制劑。
[0031] 本發(fā)明還涉及一種抗腫瘤疫苗產(chǎn)品，所述的疫苗產(chǎn)品由所述的膠束多肽疫苗和藥 學(xué)上可接受的輔料組成。
[0032] 本發(fā)明還涉及所述的膠束多肽疫苗在治療腫瘤或預(yù)防腫瘤的藥物中的應(yīng)用，所述 腫瘤包括非實體瘤與實體瘤。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033] 圖1，膠束E7疫苗的透射電鏡照片
[0034] 圖2,膠束E7疫苗的動態(tài)光散射粒徑分析
[0035] 圖3,與脂質(zhì)體裝載的E7疫苗相比，膠束E7疫苗能夠高效快速的在皮下擴散
[0036] 圖4,膠束疫苗能夠被淋巴結(jié)中的樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞高效吞噬
[0037] 圖5A、5B，與脂質(zhì)體納米顆粒相比，腫瘤膠束疫苗能夠高效的刺激巨噬細(xì)胞分泌炎 性細(xì)胞因子
[0038] 圖6,與脂質(zhì)體納米顆粒相比，膠束疫苗能夠高效刺激樹突狀細(xì)胞的成熟、活化
[0039] 圖7,膠束E7疫苗能夠有效產(chǎn)生針對腫瘤特異性抗原的CTL反應(yīng)
[0040] 圖8,膠束E7疫苗能夠有效降低腫瘤生長速度，延長荷瘤小鼠生存期
[0041] 圖9,膠束E7疫苗能夠完全預(yù)防腫瘤切除手術(shù)后的腫瘤復(fù)發(fā)
[0042] 圖10, MPLA分子結(jié)構(gòu)

【具體實施方式】
[0043] 實施例1，膠束E7疫苗的制備
[0044] E7抗原多肽為來源于人16型乳頭瘤病毒（HPV16)腫瘤相關(guān)抗原，在N端連接一個 棕櫚酸分子，即E7-20多肽；E7 43_62序列：棕櫚酸-GQAEroRAHYNIVTFCCKCD
[0045] 儲液配制：
[0046] (1)向分裝完成的每管Img的E7-20加入ImL無水甲醇配制成濃度為lmg/mL的 E7-20儲液；
[0047] (2)將MPLA粉末溶解于甲醇與氯仿1:2混合溶液中配制成濃度為lmg/mL的MPLA 儲液；
[0048] (3)稱取30mg PEG-PE粉末加入3mL氯仿溶解配制成10mg/mL的PEG-PE儲液。
[0049] 1.膠束疫苗溶液制備，按照表1的處方制備IOmL膠束疫苗：
[0050] 步驟（1)取5mL PEG-PE儲液于旋蒸瓶內(nèi)，準(zhǔn)確量取400 μ L MPLA儲液和ImL E7-20 儲液加入旋蒸瓶，輕輕振搖使之與PEG-PE溶液混合均勻；
[0051] 步驟（2)于水浴加溫條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去有機溶劑（轉(zhuǎn)速90轉(zhuǎn)/分鐘，水 浴40°C )，除去有機溶劑后PEG-PE與MPLA、E7-20形成分布均勻的薄膜，于真空干燥器內(nèi)過 夜徹底除去殘留的有機溶劑和水；
[0052] 步驟（3)加入IOmL生理鹽水，于55°C水浴孵育30分鐘水化脂膜，得外觀均一無色 透明的膠束E7疫苗溶液；
[0053] 步驟（4)室溫靜置2小時后,經(jīng)0. 22 μ m濾膜過濾除菌后4°C儲存?zhèn)溆茫杀４鎯?周）。
[0054] 表1 :膠束E7疫苗處方
[0055]

【權(quán)利要求】
1. 一種膠束多肽疫苗，其特征在于，所述的膠束多肽疫苗由聚乙二醇化磷脂（PEG-PE) 和多肽疫苗自組裝形成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠束多肽疫苗，其特征在于， 所述的聚乙二醇化磷脂分子中的聚乙二醇親水嵌段為分子量500?10000的PEG分 子，優(yōu)選為PEG1500?3000,最優(yōu)選為PEG2000 ; 所述的多肽疫苗為長度為5?100個氨基酸的多肽疫苗，優(yōu)選為10?50個氨基酸的 多肽疫苗，最優(yōu)選為20?30個氨基酸的多肽疫苗。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2任一所述的膠束多肽疫苗，其特征在于，所述的聚乙二醇化磷脂 (PEG-PE)和多肽疫苗的摩爾比為720 :4?160,優(yōu)選摩爾比180 :4。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2任一所述的膠束多肽疫苗，其特征在于，所述的膠束多肽疫苗 進(jìn)一步包含免疫佐劑，所述的免疫佐劑包括弗氏佐劑、氫氧化鋁佐劑、單磷酰脂A (MPLA)佐 齊U，優(yōu)選為單磷酰脂A佐劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的膠束多肽疫苗，其特征在于，聚乙二醇化磷脂聚合物分子、多 肽疫苗、免疫佐劑的摩爾比例范圍720 :4?160 :3?80,優(yōu)選摩爾比180 :4 :3。
6. 權(quán)利要求1-5任一所述的膠束多肽疫苗的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟（1)，以易揮發(fā)有機溶劑溶解PEG-PE載體分子、疫苗分子、佐劑分子制備載體分子 溶液、疫苗溶液、佐劑溶液； 步驟（2)，按目標(biāo)膠束多肽疫苗中各成分的比例將步驟（1)所獲得的載體分子溶液、疫 苗溶液、佐劑溶液混勻； 步驟（3)，除去步驟（2)所獲得的混合溶液中的全部有機溶劑，使載體分子、疫苗分子 和佐劑分子形成分布均勻的混合脂膜； 步驟（4)，以生理鹽水溶解步驟（3)所獲得的混合脂膜，溫育條件下使脂膜水化均勻， 隨后室溫靜置一定時間，獲得膠束疫苗溶液； 步驟（5)，將步驟（4)的膠束疫苗溶液用0. 22 μ m的濾膜過濾除菌。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，該方法還包括： 步驟￠)，向所獲得膠束疫苗溶液中添加一定量的凍干保護(hù)劑后對膠束疫苗溶液進(jìn)行 凍干，獲得膠束疫苗凍干粉劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的制備方法，其特征在于， 步驟（1)所述的易揮發(fā)有機溶劑為，甲醇、氯仿、乙醇或其混合物； 步驟（3)所述的除去有機溶劑的方法為減壓水浴加熱旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)； 步驟（4)所述的溫育條件為55°C水浴孵育30分鐘； 步驟（6)所述的凍干保護(hù)劑為0. 05g/ml的甘露醇。
9. 一種用于治療或預(yù)防腫瘤的疫苗，所述的疫苗由權(quán)利要求1-5任一所述的膠束多肽 疫苗和藥學(xué)上可接受的輔料組成。
10. 權(quán)利要求1-5任一所述的膠束多肽疫苗或權(quán)利要求9所述疫苗在制備治療或預(yù)防 腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K9/107GK104288758SQ201410570624
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月22日
【發(fā)明者】梁偉, 朱明昭, 秦焱, 周暢, 劉志達(dá) 申請人:中國科學(xué)院生物物理研究所