鹽酸藥根堿在防治流感藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】鹽酸藥根堿在制備流感病毒藥物中的應(yīng)用，屬于中藥應(yīng)用領(lǐng)域，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)施的：首先用取自不同亞型的流感病毒神經(jīng)氨酸酶液和鹽酸藥根堿在37℃培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，然后加入熒光底物緩沖溶液進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)鹽酸藥根堿對(duì)H1N1、H3N2及B型流感病毒均有作用，然后檢測(cè)了鹽酸藥根堿在細(xì)胞水平上的抗流感作用，發(fā)現(xiàn)鹽酸藥根堿也能對(duì)感染H1N1和H3N2的細(xì)胞起到治療作用，最后，檢測(cè)了鹽酸藥根堿對(duì)小鼠流感模型的影響，發(fā)現(xiàn)加入鹽酸藥根堿后，可以明顯抑制流感感染小鼠體重的減輕程度，使小鼠逐漸恢復(fù)到健康水平，并且能顯著降低流感小鼠的肺指數(shù)。
【專利說(shuō)明】鹽酸藥根堿在防治流感藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及鹽酸藥根堿在制備抑制流感病毒藥物中的應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 流行性感冒（以下簡(jiǎn)稱流感）是由黏液病毒科的RNA病毒引起的急性病毒性呼吸 道傳染病，它傳染性強(qiáng)、流行面廣、發(fā)病率高，全球每年大約有5%?15%感染。黏液病毒科 分5個(gè)屬：甲型流感病毒屬、乙型流感病毒屬、丙型流感病毒屬、傳染性鮭魚(yú)貧血病毒屬和 托高土病毒屬。目前，甲型流感病毒最常見(jiàn)也最容易引起世界大流行和地區(qū)流行。
[0003] 甲型流感病毒RNA由8個(gè)節(jié)段組成，編碼10個(gè)蛋白；其中第六節(jié)段編碼神經(jīng)氨酸 酶（neuraminidase，NA)蛋白。NA是存在于流感病毒被膜上的兩種蛋白之一，主要作用為 催化水解寡糖、糖蛋白、糖脂中a _2、3, a _2、6糖苷鍵，釋放末端的N-乙酰神經(jīng)氨酸酶殘 基。病毒侵染細(xì)胞時(shí)，首先通過(guò)血凝素（hemagglutinin，HA)與細(xì)胞表面SA (唾液酸）受體 結(jié)合形成糖苷鍵，再經(jīng)NA催化，切斷糖苷鍵，以利于流感病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；子代病毒完成復(fù) 制后，以出芽的方式突出宿主細(xì)胞，再通過(guò)NA的催化作用而釋放，從而感染新的宿主細(xì)胞。
[0004] 中醫(yī)中藥抗病毒已有數(shù)千年的歷史，我國(guó)在利用中藥防治流感方面積累了大量寶 貴的理論和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。在我國(guó)，中藥資源非常豐富，從古至今用中醫(yī)藥治療流感療效顯著。 但在國(guó)外，由于中藥中有效成分不明，作用原理不清，所以使中藥的發(fā)展在國(guó)外受阻。現(xiàn)在 單味中藥抗流感的研究已經(jīng)有數(shù)十年了，已經(jīng)篩選出很多具有抗流感病毒的中草藥。所以， 我們從天然產(chǎn)物中獲得了新穎的具有NA抑制活性的化合物--鹽酸藥根堿，以此來(lái)尋找抑 制流感NA，從而抑制流感病毒的新藥物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供鹽酸藥根堿在制備流感病毒藥物中的應(yīng)用。鹽酸藥根堿能 夠有效的抑制神經(jīng)氨酸酶的活性，從而抑制流感病毒在體內(nèi)的繁殖，進(jìn)而減輕或治愈流感 患者。本發(fā)明對(duì)化合物鹽酸藥根堿對(duì)H1N1 (代表甲型流感病毒I組）和H3N2 (代表甲型流 感病毒II組）兩類NA進(jìn)行了體外酶學(xué)抑制性的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)H1N1和H3N2的IC5Q分別 為120. 40±20. 07 iimol/L，193. 40±21. 70 iimol/L，我們又對(duì)這兩種病毒感染MDCK細(xì)胞并 加以此種化合物進(jìn)行了細(xì)胞存活率的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)此化合物均能提高病毒感染后的細(xì)胞存活 率。本發(fā)明為開(kāi)發(fā)以神經(jīng)氨酸酶為靶點(diǎn)的新藥提供基礎(chǔ)，為鹽酸藥根堿應(yīng)用于人類流感的 治療提供了參考。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0006] 圖1是不同濃度鹽酸藥根堿對(duì)H1N1，H3N2和B型流感病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制作 用。
[0007] 圖2是不同濃度鹽酸藥根堿與H1N1或H3N2共同作用后，混合液對(duì)MDCK細(xì)胞的損 傷作用。
[0008] 圖3是不同濃度鹽酸藥根堿對(duì)感染了 H1N1或H3N2的MDCK細(xì)胞的治療作用。
[0009] 圖4是不用濃度鹽酸藥根堿對(duì)感染了流感病毒的小鼠體重的影響。
[0010] 圖5是不用濃度鹽酸藥根堿對(duì)感染流感病毒的小鼠肺中病毒載量的影響。

【具體實(shí)施方式】
[0011] 以下通過(guò)實(shí)例形式的【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0012] 實(shí)施例1
[0013] 我們用含有流感病毒NA的尿囊液（經(jīng)雞胚傳代，收尿囊液，-80°C保存）在pH 6. 5MES緩沖液（32. 5mM)中進(jìn)行配制，我們將49 y L的NA液及其與不同濃度的41 y L鹽酸 藥根堿的混合物加入到反應(yīng)緩沖液中，在37°C孵箱中放置30min，然后加入50 y L 20 y M MU-NANA底物緩沖液，在酶標(biāo)儀上進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為360nm，發(fā)射波長(zhǎng)為450nm，檢測(cè)時(shí) 長(zhǎng)8min。檢測(cè)結(jié)果為，鹽酸藥根堿對(duì)H1N1，H3N2和B型流感病毒NA的半數(shù)一直濃度（IC 5Q) 分別為 120. 40±20. 07 ii mol/L，193. 40±21. 70 ii mol/L 和 178. 05±8. 57 ii mol/L。
[0014] 實(shí)施例2
[0015] 為了檢測(cè)鹽酸藥根堿在細(xì)胞水平的抗流感作用，我們用兩種不同的處理對(duì)其進(jìn)行 實(shí)驗(yàn)：首先將鹽酸藥根堿按濃度梯度稀釋成不同濃度，I將上述溶液與l〇〇TCID5(l的不同亞 型流感病毒（H1N1和H3N2)等體積孵育2小時(shí)，總體積為200 i! L。然后將混合液加入到MDCK 細(xì)胞中孵育2h ; II將100TCID5Q的不同亞型流感病毒（H1N1和H3N2)在MDCK細(xì)胞中孵育2 小時(shí)，在加入不用濃度的鹽酸藥根堿孵育2小時(shí)。2種不同處理稀釋液都用維持液（10 yg/ ml胰酶的DMEM)。2小時(shí)后，換一次上述的維持液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。24小時(shí)后換含有2% 血清的維持液，連續(xù)觀察2?3天，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞病變效果。上述實(shí)驗(yàn)均在37°C、5% C〇2條件下培養(yǎng)。
[0016] 結(jié)果如圖2和圖3所示，在不同處理?xiàng)l件下，加入鹽酸藥根堿與流感病毒時(shí)，隨著 鹽酸藥根堿濃度的增加，細(xì)胞存活率也隨著增加。說(shuō)明鹽酸藥根堿可以抑制流感病毒，保護(hù) MDCK細(xì)胞免受病毒破壞，而且保護(hù)效應(yīng)也隨著鹽酸藥根堿濃度的增加呈現(xiàn)濃度依賴性。
[0017] 實(shí)施例3
[0018] 為了檢測(cè)鹽酸藥根堿在小鼠流感模型中的保護(hù)作用，我們采用50 iiL 10LD5Q的 FM1病毒滴鼻感染小鼠。實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為6組，分別為NC組；10LD5Q組；10LD50+50mg/kg Tamiflu組；鹽酸藥根堿低、中、高劑量組：10LD 5(l+50, 100, 200mg/kg鹽酸藥根堿。每組10 只，病毒攻擊前1天開(kāi)始給藥，均采用灌胃給藥的方式，每天2次，連續(xù)7天，每只小鼠灌胃 0.2ml。每天記錄小鼠生存狀態(tài)，體重變化。然后在15天時(shí)，處死小鼠，記錄肺重，對(duì)肺組織 研磨加入PBS，后測(cè)定其NA活性。
[0019] 結(jié)果如圖4和圖5所示，說(shuō)明鹽酸藥根堿可以抑制流感感染小鼠體重的減輕程度， 改善小鼠的生存狀態(tài)，使小鼠逐漸恢復(fù)到健康水平。
[0020] 結(jié)果如下表所示，說(shuō)明不同濃度的鹽酸藥根堿能顯著降低流感小鼠的肺指數(shù)。
[0021]

【權(quán)利要求】
1. 化合物鹽酸藥根堿在防治流感藥物中的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1中鹽酸藥根堿以作為單一成分在防治流感藥物的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求1中鹽酸藥根堿以作為復(fù)方藥物中的一種成分在防治流感藥物的應(yīng)用。
4. 如權(quán)利要求1中鹽酸藥根堿以口服給藥方式的應(yīng)用。
5. 如權(quán)利要求1中鹽酸藥根堿以注射給藥方式的應(yīng)用。
6. 如權(quán)利要求1中鹽酸藥根堿以噴霧吸入方式的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K31/4375GK104257654SQ201410572655
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月22日
【發(fā)明者】麻彤輝, 房學(xué)迅, 于淼, 于大海, 田莉, 王燁, 楊吉雨, 王溪竹, 梁偉國(guó) 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)