小鼠潘氏細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株小鼠潘氏細(xì)胞雜交瘤GCLP細(xì)胞株，小鼠潘氏細(xì)胞雜交瘤GCLP細(xì)胞株的制備方法及應(yīng)用，本發(fā)明提供的細(xì)胞株不僅能在細(xì)胞培養(yǎng)條件下持續(xù)性傳代，還具有潘氏細(xì)胞生理功能，能分泌小鼠防御素、溶菌酶及消化道干細(xì)胞促生長(zhǎng)因子。CCTCC C201419520141024
【專利說(shuō)明】小鼠潘氏細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株、制備方法及其應(yīng)用
[0001]發(fā)明所屬領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于雜交瘤【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及小鼠潘氏細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株、制備小鼠潘氏細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株的方法及小鼠潘氏細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株的應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]潘氏細(xì)胞是許多動(dòng)物消化道的一種細(xì)胞，近年來(lái)的研究表明:該細(xì)胞具有分泌動(dòng)物特異性防御素、溶菌酶以及消化道干細(xì)胞生長(zhǎng)因子等等物質(zhì)的能力，其所分泌的這些物質(zhì)能殺滅病原微生物和調(diào)控消化道細(xì)胞分化，對(duì)維持消化道的健康起著極其重大的作用(陶凱忠，唐慶娟，鄭萍.潘氏細(xì)胞研究進(jìn)展，現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，9 (4):794-800)。
[0003]目前，關(guān)于潘氏細(xì)胞的研究多采用組織學(xué)的方法，如免疫組化分析，分離培養(yǎng)潘氏細(xì)胞未見(jiàn)報(bào)道。用于實(shí)驗(yàn)研究的潘氏細(xì)胞系多為人或動(dòng)物的癌變潘氏細(xì)胞，如T-84和Caco-2等(匡偉，趙國(guó)琦.幾種特殊的腸上皮細(xì)胞系.中國(guó)畜牧雜志，2007，43(13):41-43)。這類細(xì)胞系是通過(guò)長(zhǎng)期體外培養(yǎng)馴化得來(lái)，往往不具備正常潘氏細(xì)胞的分泌功能(紀(jì)華英，陳其奎，曾暉.小鼠小腸上皮細(xì)胞的體外原代培養(yǎng)，中國(guó)畜牧雜志，2010，16(9):1417-1419);而從組織中分離的潘氏細(xì)胞又無(wú)法長(zhǎng)期培養(yǎng)，這使得潘氏細(xì)胞的研究和利用受到很大限制。
[0004]建立動(dòng)物永生性細(xì)胞系通常采取傳代細(xì)胞建系和癌變細(xì)胞建系的方法(薛慶善.體外培養(yǎng)的原理與技術(shù).北京:科學(xué)出版社，2001)。這兩種方法需要較長(zhǎng)的時(shí)間或特殊的癌變組織。機(jī)體中一些高度分化的終末細(xì)胞如淋巴細(xì)胞等體外永續(xù)性培養(yǎng)非常困難，而建立的癌變細(xì)胞系與正常細(xì)胞具有本質(zhì)區(qū)別，在研究中有很多局限性(馬玉龍，許梓榮，郭彤，等.雞腸上皮細(xì)胞的分離及原代培養(yǎng)方法.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，27 (I):74- 80.)。
[0005]發(fā)明技術(shù)內(nèi)容:
本發(fā)明的目的是提供一種小鼠潘氏細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株，該細(xì)胞株不僅能在細(xì)胞培養(yǎng)條件下持續(xù)性傳代，還具有潘氏細(xì)胞生理功能，能分泌小鼠防御素、溶菌酶及消化道干細(xì)胞促生長(zhǎng)因子。
[0006]本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種制備小鼠潘氏細(xì)胞雜交瘤GCLP細(xì)胞株的方法。
[0007]本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供小鼠潘氏細(xì)胞雜交瘤GCLP細(xì)胞株的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明公開(kāi)了一株新的雜交瘤細(xì)胞株，其特征在是:該細(xì)胞株由小鼠空腸的潘氏細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞雜交融合而得，能在細(xì)胞培養(yǎng)條件下持續(xù)性傳代，能分泌小鼠防御素、溶菌酶及消化道干細(xì)胞促生長(zhǎng)因子，該細(xì)胞是小鼠潘氏細(xì)胞雜交瘤GCLP細(xì)胞株，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC C2014195，保藏日期是2014年10月24日。中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心簡(jiǎn)稱CCTCC，是中國(guó)專利局指定的保藏機(jī)構(gòu)，位于湖北省武漢市武漢大學(xué)校內(nèi)，郵編 430072,網(wǎng)址:www.cctcc.0rg ,電話:027-68752319, Email: cctcciwhu.edu.cn。在本發(fā)明公開(kāi)后，不以贏利為目的的研究者可依法向保藏中心索取本微生物菌種再現(xiàn)本發(fā)明。
[0009]本發(fā)明公開(kāi)了小鼠潘氏細(xì)胞雜交瘤GCLP細(xì)胞株建立的方法，該方法包括如下步驟:
(1)小鼠空腸消化道內(nèi)膜細(xì)胞消化分離:將小鼠空腸取下后，用胰蛋白酶、中性蛋白酶和膠原酶的混合物進(jìn)行消化，充分消化后用細(xì)胞培養(yǎng)液將消化離散的內(nèi)膜細(xì)胞沖洗出來(lái)，配制成合適密度的細(xì)胞懸液；
(2)細(xì)胞融合:細(xì)胞懸液與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0等量混合，用PEG作融合劑，常規(guī)方法融合，在用Raw264.7細(xì)胞制作的飼養(yǎng)細(xì)胞層上接種融合細(xì)胞，用HAT作篩選培養(yǎng)基，獲得消化道內(nèi)膜細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞群；
(3)雜交瘤細(xì)胞株的分離培養(yǎng)與篩選:用細(xì)吸管吸出不同的融合細(xì)胞克隆，分別培養(yǎng)于鋪有Raw264.7飼養(yǎng)細(xì)胞層的培養(yǎng)孔中進(jìn)行連續(xù)傳代，平行樣品進(jìn)行熒光桃紅染色，留下那些染色陽(yáng)性的平行樣品的細(xì)胞克隆繼續(xù)培養(yǎng)，取平行樣品進(jìn)行CK-18抗體的潘氏細(xì)胞特異性抗原檢測(cè)鑒定，選留具有潘氏細(xì)胞特異性抗原的融合細(xì)胞株作為潘氏細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株繼續(xù)培養(yǎng)并保存，建成潘氏細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株。
[0010]在本發(fā)明中，PEG指聚乙二醇,英文名polyethylene glycol的簡(jiǎn)稱，HAT是含有
H一Hypoxanthine次黃嘌呤，A—Aminopterin甲氨喋呤，T-Thymidine胸腺卩密唳核苷培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基。本發(fā)明中的潘氏細(xì)胞指小腸中的一類上皮細(xì)胞。
[0011]本發(fā)明還公開(kāi)了新的潘氏細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明中的小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0，Raw264.7飼養(yǎng)細(xì)胞可通過(guò)可通過(guò)市售商業(yè)生物公司或菌種保藏機(jī)構(gòu)獲得，如中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏有該細(xì)胞，研究者可向該中心索取。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):于現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有如下優(yōu)點(diǎn):
小鼠潘氏融合GCLP細(xì)胞株不僅能在細(xì)胞培養(yǎng)條件下持續(xù)性傳代，還具有潘氏細(xì)胞生理功能，能分泌小鼠防御素、溶菌酶及消化道干細(xì)胞促生長(zhǎng)因子。本發(fā)明提供的細(xì)胞株克服了離體狀態(tài)下難研究了潘氏細(xì)胞的情況，為長(zhǎng)期的持續(xù)研究提供了大量的樣本數(shù)。
[0014]小鼠潘氏細(xì)胞雜交瘤GCLP細(xì)胞株為開(kāi)發(fā)潘氏細(xì)胞分泌物的藥物化功能以及由此開(kāi)發(fā)出新型藥物提供了生產(chǎn)資料基礎(chǔ)。
[0015]

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1是酶消化獲得的小鼠空腸內(nèi)膜細(xì)胞群熒光桃紅染色圖片圖圖2是盲雜交后獲得的融合細(xì)胞克隆圖
圖3是經(jīng)篩選獲得的潘氏融合細(xì)胞株熒光桃紅染色圖片圖圖4是潘氏融合細(xì)胞株核型分析圖
圖5是潘氏融合細(xì)胞株潘氏細(xì)胞特異性抗原組織化學(xué)檢測(cè)圖A表示潘氏融合細(xì)胞B表示陰性細(xì)胞對(duì)照

【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合具體的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0018]實(shí)施例1小鼠潘氏細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株的建立 1.1主要溶液與器皿的準(zhǔn)備
1.1.1含雙抗的PBS溶液:在常規(guī)PBS溶液中加入青、鏈霉素，使其濃度分別達(dá)到200單位 /ml 和 200mg/ml。
[0019]1.1.20.5%胰蛋白酶消化液:用加有0.04EDTA的PBS溶液配制胰蛋白酶溶液，使胰蛋白酶的終濃度為0.5%。
[0020]1.1.30.25%胰蛋白酶消化液:用加有0.02EDTA的PBS溶液配制胰蛋白酶溶液，使胰蛋白酶的中濃度為0.25%。
[0021]1.1.4膠原蛋白酶+中性酶混合消化液:用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基分別配制膠原蛋白酶XI型及中性蛋白酶I濃縮液，其濃度分別為2000u/ml和0.lmg/ml，用前將二者等量混合后，作10倍稀釋。
[0022]1.1.5DMEM完全培養(yǎng)基:向DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入胎牛血清，使其終濃度達(dá)到15%。
[0023]1.1.6其他常規(guī)培養(yǎng)用溶液
1.1.7平端注射針頭:16號(hào)注射針頭尖端被鋸平并打磨平滑，針管長(zhǎng)度保持在2cm以上。
[0024]1.1.8綁扎用線繩:消毒好的細(xì)棉線 1.1.9動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用手術(shù)器械
1.1.10平皿、離心管、吸管等其他分離細(xì)胞用器皿。
[0025]1.1.11所有溶液經(jīng)0.2um過(guò)濾除菌、所有器皿經(jīng)高溫高壓滅菌處理。
[0026]1.1.12無(wú)菌水浴瓶:取10ml帶翻口橡皮塞的鹽水瓶，瓶塞上插入一根平端注射針頭，瓶中裝入鹽水或PBS溶液，使液面離瓶口距離約2cm，裝入耐高溫高壓的塑料袋中，扎緊袋口，放高壓滅菌器中消毒，冷卻后拿出順便在瓶頸處扎緊塑料袋，用前預(yù)熱至37°C。
[0027]1.2小鼠準(zhǔn)備:選取28日齡昆明小鼠為取材動(dòng)物，使用前饑餓24小時(shí)。
[0028]1.3飼養(yǎng)層細(xì)胞的準(zhǔn)備:選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raw264.7細(xì)胞，經(jīng)10ug/ml工作濃度的絲裂霉素C處理3小時(shí)，消化吹散后用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至15個(gè)/ml，接種于96孔板中，24小時(shí)后即可用于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。
[0029]1.4小鼠空腸內(nèi)膜細(xì)胞消化分離:
1.4.1空腸取樣:28日齡的昆明小鼠斷頸處死，浸泡于75%酒精中消毒約5分鐘，在無(wú)菌室超凈工作臺(tái)仰放于9cm以上規(guī)格的平皿內(nèi)，破開(kāi)腹壁，用眼科鑷分離空腸，用手術(shù)剪從中部剪取約5厘米長(zhǎng)的空腸，放入另一平皿中。
[0030]1.4.2沖洗:將平端注射針頭裝在50ml注射器上，吸取約50ml含雙抗PBS溶液，注射針管從空腸的一端插入約0.5cm深，用眼科鑷夾住插入部位，上移注射器，使空腸全部懸空，用力推注射器柱塞，使其中的PBS溶液快速通過(guò)空腸腸腔，將其中的內(nèi)容物沖洗出來(lái)，然后將空腸放入另一無(wú)菌平皿中，注射針管經(jīng)酒精棉球擦拭消毒后從空腸的另一端插入，重復(fù)上述過(guò)程反向沖洗空腸，如此重復(fù)3次以上，最后一次沖洗完成后，
1.4.3消化:將已預(yù)熱至37°C的無(wú)菌水浴瓶，除去其外的塑料袋包裝，取下插有平端注射針頭的瓶塞，將針頭插入空腸一端，用線繩綁緊在針頭上，取一 5ml的注射器，吸取約2ml的膠原蛋白酶+中性酶混合消化液，連接針頭，先輕推注射器柱塞，使其向腸管中注入約Iml的消化液沖洗腸管，用線繩結(jié)扎腸管的另一端，再繼續(xù)推注射器柱塞，將剩下的消化液推入腸管中(腸管已充分充盈時(shí)停止推注，以免壓力過(guò)大脹破腸管)，垂直上提瓶塞，將腸管慢慢從瓶口放入瓶中，塞緊瓶塞，連同其上的注射器一起放入37°C、5%C02培養(yǎng)箱中，消化約40分鐘，取出水浴瓶，取一 1nl的注射器，吸取1mlDMEM完全培養(yǎng)基，換下瓶塞上的注射器，輕輕拔出瓶塞，輕輕垂直提出腸管，平移至一 1ml離心管管口上方，用眼科剪輕輕剪斷腸管結(jié)扎端，用力推注射器柱塞，使其中培養(yǎng)基快速?zèng)_洗腸管，沖洗液收集于離心管中，此即為第一次消化細(xì)胞懸液，接著用0.5%的胰蛋白酶溶液重復(fù)上述消化過(guò)程，消化時(shí)間為15分鐘，用第一次消化的細(xì)胞懸液沖洗消化后的腸管，獲得二次消化細(xì)胞懸液，用吸管反復(fù)吹打細(xì)胞懸液，使其中的組織塊充分分散為單個(gè)細(xì)胞，用200目的濾布將吹打后的細(xì)胞懸液過(guò)濾于另一 1ml離心管中，顯微鏡下計(jì)數(shù)其中的單個(gè)細(xì)胞。
[0031]1.4.3細(xì)胞收集及與瘤細(xì)胞雜交融合:取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0細(xì)胞若干，輕輕吹散后于細(xì)胞計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)細(xì)胞，并計(jì)算出懸液中的細(xì)胞密度，按照空腸內(nèi)膜細(xì)胞總數(shù):SP2/0細(xì)胞總數(shù)=1:1的比例將這兩種細(xì)胞懸液混合，混合液裝于一支大小適中的離心管中以1000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄上清，并用無(wú)菌棉簽盡量吸干離心管中的液體，留下管底的細(xì)胞沉積物。向細(xì)胞沉積物中緩慢加入細(xì)胞融合用PEG0.4ml，用時(shí)約I分鐘，立即以1000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，取出離心管后立即加入1mlDMEM完全培養(yǎng)基，再以1000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄上清，留下管底細(xì)胞沉積物。
[0032]1.4.4雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng):用雜交瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基重懸管底的細(xì)胞沉積物調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至14個(gè)/ml。將鋪有Raw264.7飼養(yǎng)層細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板吸去培養(yǎng)基，用雜交瘤細(xì)胞混懸液對(duì)該培養(yǎng)板進(jìn)行重新鋪板，放于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0033]1.5雜交瘤細(xì)胞篩選
1.5.1雜交瘤細(xì)胞克隆的分離培養(yǎng):當(dāng)鋪板后的細(xì)胞培養(yǎng)10天后，可以看見(jiàn)許多融合成功的細(xì)胞呈克隆化生長(zhǎng)。用尖端被拉細(xì)并拉彎曲的巴氏吸管，在顯微鏡下將長(zhǎng)出的所有雜交瘤細(xì)胞克隆分別單獨(dú)吸出，培養(yǎng)至單個(gè)墊有Raw264.7飼養(yǎng)層細(xì)胞的96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，每個(gè)克隆放入同一孔中，讓其繼續(xù)生長(zhǎng)擴(kuò)增。細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)孔后按1:2的比例傳代，連續(xù)傳3-5代后，脫離飼養(yǎng)層細(xì)胞繼續(xù)傳代，以后按常規(guī)雜交瘤細(xì)胞傳代操作繼續(xù)傳代。
[0034]1.5.2雜交瘤細(xì)胞的鑒定與選留:當(dāng)單個(gè)細(xì)胞克隆傳代至2-4孔細(xì)胞時(shí)，對(duì)其中一孔進(jìn)行熒光桃紅染色，留下那些熒光桃紅染色陽(yáng)性的細(xì)胞克隆作為初篩選留克隆繼續(xù)培養(yǎng)，并將它們分別分成2塊培養(yǎng)板，其中一塊細(xì)胞用于潘氏細(xì)胞特異性抗原免疫熒光檢測(cè)，陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)應(yīng)的另一塊培養(yǎng)板的細(xì)胞克隆被選留繼續(xù)培養(yǎng)，進(jìn)一步對(duì)其傳代48小時(shí)的培養(yǎng)液中的防御素、溶菌酶含量進(jìn)行檢測(cè)，將含量最高的細(xì)胞克隆作為最終雜交瘤細(xì)胞留下繼續(xù)培養(yǎng)。
[0035]1.5.3雜交瘤細(xì)胞株細(xì)胞庫(kù)的建立:按照常規(guī)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)操作繼續(xù)培養(yǎng)最終選留下的雜交瘤細(xì)胞，直至細(xì)胞增殖到足夠數(shù)量，然后按照細(xì)胞庫(kù)建立程序?qū)⒃摷?xì)胞液氮凍存，建成可永續(xù)性應(yīng)用的細(xì)胞庫(kù)。
[0036]實(shí)施例2 GCLP細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
與普通雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)操作完全一樣，將保存的GCLP細(xì)胞解凍后進(jìn)行不斷的擴(kuò)繁傳代，每隔5代，對(duì)培養(yǎng)上清液取樣檢測(cè)小鼠潘氏細(xì)胞特異性防御素α 5的含量，只要其含量達(dá)到50ng/ml以上則視細(xì)胞培養(yǎng)正常，雜交瘤細(xì)胞未出現(xiàn)遺傳變化，否則應(yīng)檢查培養(yǎng)過(guò)程與細(xì)胞染色體。連續(xù)培養(yǎng)10代后細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，細(xì)胞形態(tài)無(wú)變化，細(xì)胞上清液小鼠潘氏細(xì)胞特異性防御素α 5的含量始終在62-80ng/ml之間變動(dòng)，證明該細(xì)胞遺傳性能穩(wěn)定，可以作為潘氏細(xì)胞在交流細(xì)胞株使用。
[0037]實(shí)施例3 GCLP細(xì)胞在預(yù)防初生仔豬腹瀉病中的應(yīng)用
3.1細(xì)胞準(zhǔn)備:按照常規(guī)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的方法將GCLP細(xì)胞培養(yǎng)到所需細(xì)胞量，取上清液樣測(cè)定其鼠β_防御素的含量，達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)即為合格上清液，可以收集用于后續(xù)應(yīng)用。
[0038]3.2上清液處理:細(xì)胞生長(zhǎng)48小時(shí)后，輕輕收取上清液(因雜交瘤細(xì)胞貼壁不牢固，收上清液時(shí)振動(dòng)過(guò)大，易使細(xì)胞大量懸浮于上清液中影響后續(xù)操作)，1800轉(zhuǎn)/分以上的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，取上清，0.22um濾膜過(guò)濾，濾液用作預(yù)防仔豬腹瀉病的實(shí)施樣品。
[0039]3.3試驗(yàn)豬的選擇:在仔豬腹瀉病流行豬場(chǎng)，選取同日出生的仔豬10窩，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，試驗(yàn)組豬在出生后第3日-第7日間，每日上午給每頭仔豬灌喂處理后的GCLP細(xì)胞上清液10ml，對(duì)照組行常規(guī)飼養(yǎng)。觀察統(tǒng)計(jì)2組仔豬的腹瀉發(fā)病情況和死亡情況。按照上述方法，分別于2013年12月和2014年2月間在武漢某豬場(chǎng)試驗(yàn)，結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組仔豬腹瀉發(fā)生率和因腹瀉而至的死亡率分別為3%和2%。而對(duì)照組仔豬腹瀉發(fā)生率和死亡率則分別為87%和76%。試驗(yàn)期間，該豬場(chǎng)其他豬群的仔豬腹瀉病發(fā)病率、死亡率與本試驗(yàn)的對(duì)照組基本相當(dāng)，這說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所使用的GCLP細(xì)胞培養(yǎng)上清液對(duì)初生仔豬腹瀉病具有良好防控作用。
【權(quán)利要求】
1.一株雜交瘤細(xì)胞株，其特征在是:該細(xì)胞株由小鼠空腸的潘氏細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞雜交融合而得，能在細(xì)胞培養(yǎng)條件下持續(xù)性傳代，能分泌小鼠防御素、溶菌酶及消化道干細(xì)胞促生長(zhǎng)因子，該細(xì)胞是小鼠潘氏細(xì)胞雜交瘤GCLP細(xì)胞株，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC C2014195。
2.制備權(quán)利要求書(shū)I中所述的小鼠潘氏細(xì)胞雜交瘤GCLP細(xì)胞株的方法，該方法包括如下步驟: (O小鼠空腸消化道內(nèi)膜細(xì)胞消化分離:將小鼠空腸取下后，用胰蛋白酶、中性蛋白酶和膠原酶的混合物進(jìn)行消化，充分消化后用細(xì)胞培養(yǎng)液將消化離散的內(nèi)膜細(xì)胞沖洗出來(lái)，配制成合適密度的細(xì)胞懸液； (2)細(xì)胞融合:細(xì)胞懸液與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0等量混合，用PEG作融合劑，常規(guī)方法融合，在用Raw264.7細(xì)胞制作的飼養(yǎng)細(xì)胞層上接種融合細(xì)胞，用HAT作篩選培養(yǎng)基，獲得消化道內(nèi)膜細(xì)胞雜交細(xì)胞株； (3)融合細(xì)胞株的分離培養(yǎng)與篩選:用細(xì)吸管吸出不同的融合細(xì)胞株克隆，分別培養(yǎng)于鋪有Raw264.7細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞層的培養(yǎng)孔中進(jìn)行連續(xù)傳代，進(jìn)行熒光桃紅染色，留下那些染色陽(yáng)性的細(xì)胞克隆繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)CK-18抗體的潘氏細(xì)胞特異性抗原檢測(cè)鑒定，選留具有潘氏細(xì)胞特異性抗原的融合細(xì)胞株株作為小鼠潘氏細(xì)胞雜交瘤GCLP細(xì)胞株繼續(xù)培養(yǎng)并保存，建成小鼠潘氏細(xì)胞雜交瘤GCLP細(xì)胞株。
3.權(quán)利要求1中所述的小鼠潘氏細(xì)胞雜交瘤GCLP細(xì)胞株在抗菌藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P31/00GK104388391SQ201410578367
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月27日
【發(fā)明者】高其雙, 程百煉, 盧順, 曹庭球, 陳志華, 周剛, 彭霞, 周莉 申請(qǐng)人:武漢市工程科學(xué)技術(shù)研究院