一種含有巖藻聚糖硫酸酯的免疫佐劑及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種含有巖藻聚糖硫酸酯的免疫佐劑及其應用，其解決了目前免疫佐劑種類少、副作用無法避免、不能滿足感染性疾病暴發(fā)時需要提供大量疫苗的技術問題，其由下列質量比的組分組成：巖藻聚糖硫酸酯；人參皂苷；余為載體；載體由下列質量比的組分組成：乳化劑；助乳化劑；油相和水相。本發(fā)明可廣泛用于疫苗的制備領域。
【專利說明】一種含有巖藻聚糖硫酸酯的免疫佐劑及其應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種含有巖藻聚糖硫酸酯的免疫佐劑，還涉及含有巖藻聚糖硫酸酯的免疫佐劑的流感疫苗，屬于生物技術和生物醫(yī)藥領域。

【背景技術】
[0002]巖藻聚糖硫酸酯作為海帶等褐藻所固有的細胞間多糖，存在于褐藻細胞壁基質中，是褐藻所特有的生物活性物質。例如，以海帶(Laminaria japonicia)為原料所提取的巖藻聚糖硫酸酯(Fucoidan),主要由含硫酸基巖藻糖(Fucose)組成；其次,還伴有少量的半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、糖醛酸等，是一種水溶性的雜聚多糖，又被稱為褐藻糖膠、褐藻多糖硫酸酯，其主要有效成份是a -L-巖藻糖-4-硫酸酯。
[0003]巖藻聚糖硫酸酯是一種優(yōu)秀的健康食品、藥品原料，因天然含有硫酸根，從而具有陰離子高分子化合物的特性。研究表明，巖藻聚糖硫酸酯具有抗凝血、降血脂、抗慢性腎衰、抗腫瘤、抗病毒、促進組織再生、抑制胃潰瘍、增強機體免疫機能等多種生理活性。巖藻聚糖硫酸酯具有明顯的抗凝血和促纖溶的藥理學活性；包含硫酸基的巖藻糖或其降解物能誘導癌細胞凋亡，可用作凋亡誘導劑和抗癌藥；能誘發(fā)細胞生長因子的生成，從而促進各種細胞生長，修復受損壞或機能減退的器官和組織；由于其具有抗凝血的作用，所以適用于血粘度高的病人，可作為預防血栓形成的藥物或保健品；它還具有良好的降血脂、降血糖、降膽固醇的功效，能克服降脂藥物的一些副作用；可治療慢性腎衰，對中早期腎衰效果顯著，特別對改善腎功能，提高腎臟對肌酐清除率效果尤為顯著；可作為金屬離子的結合劑和阻吸劑，如可使人體對鉛的吸收減少70%以上。
[0004]此外，巖藻聚糖硫酸酯不僅能夠有效激活免疫細胞，提高機體免疫力，而且對正常宿主細胞無致畸的毒副作用，因此被認為是一種重要的生物調節(jié)劑。另外，人參皂苷Rgl和Rbl能夠提高機體免疫力，有文獻報道它們可用作免疫佐劑，增強抗原的免疫原性。
[0005]目前市場上流感疫苗使用的佐劑主要是鋁佐劑和MF59，但實際上鋁佐劑對蛋白亞單位疫苗誘導抗體產生的能力較弱，不能有效地誘導免疫應答，在某些情況下還會產生與過敏反應有關的IgE，其副作用無法避免;MF59作為疫苗佐劑時，增加免疫原性的同時，也增加了反應原性，如接種部位紅腫熱痛等癥狀。隨著各種新發(fā)流感在全世界的爆發(fā)和對人感染性的增強，迫切需要開發(fā)具有更高安全性和免疫原性的免疫佐劑。


【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明就了為了解決目前免疫佐劑種類少、副作用無法避免、不能滿足感染性疾病暴發(fā)時需要提供大量疫苗的技術問題，提供一種能有效提高疫苗免疫效果、副作用少、降低疫苗用量的含有巖藻聚糖硫酸酯的免疫佐劑。
[0007]為此，本發(fā)明提供一種含有巖藻聚糖硫酸酯的免疫佐劑，其由下列質量比的組分組成:巖藻聚糖硫酸酯I?20% ;人參皂苷0.01?2% ;余為載體；載體由下列質量比的組分組成:乳化劑I?30% ;助乳化劑I?50% ;油相I?50% ;余為水相。
[0008]優(yōu)選地，人參皂苷為Rgl或Rbl中的一種，或者為質量混合物比為1:100?100:1的Rgl與Rbl的混合物。
[0009]優(yōu)選地，乳化劑為常規(guī)的吐溫80或聚氧乙烯蓖麻油中的一種，或者為質量混合比為3:1?1:3的常規(guī)吐溫80與Span80的混合物，或者為質量混合比為1:1的常規(guī)聚氧乙烯蓖麻油與Span80的混合物。
[0010]優(yōu)選地，助乳化劑為常規(guī)的1，2_丙二醇或聚乙二醇400中的一種。
[0011]優(yōu)選地，油相為常規(guī)的肉豆蘧酸異丙酯或油酸乙酯或注射用大豆油中的一種。
[0012]優(yōu)選地，水相為注射用水或者含有藥物或疫苗成分的注射用水溶液。
[0013]本發(fā)明同時提供了含有巖藻聚糖硫酸酯的免疫佐劑在制備流感疫苗中的應用，含有巖藻聚糖硫酸酯的免疫佐劑與流感疫苗血凝素的質量比為6000?321000:1，其中，含有巖藻聚糖硫酸酯的免疫佐劑由下列質量比的組分組成:巖藻聚糖硫酸酯I?20% ;人參皂苷0.01?2% ;余為載體。
[0014]本發(fā)明含有巖藻聚糖硫酸酯和人參皂苷的免疫佐劑，能夠顯著增強抗原的免疫原性，提高疫苗的效果，使疫苗在價格上具有明顯的優(yōu)勢。尤其在流感疫苗中使用佐劑，不僅可增強免疫原性，還可以降低抗原用量，特別在應對流感大流行時，佐劑的使用可有效降低抗原用量，擴大接種人群數量，降低疫苗生產企業(yè)因產量不足而帶來的壓力。

【具體實施方式】
[0015]為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術內容，特采用以下實施例進行詳細說明，其目的在于更好理解本
【發(fā)明內容】
而非限制本發(fā)明的保護范圍。
[0016]本發(fā)明下列實施例中，人參皂苷Rgl或Rbl為市購產品或者為常規(guī)方法提取得到的產品，產品純度為95%以上。例如，南京替斯艾么中藥技術研究所的人參皂苷Rbl，產品編號TCM-039，HPLC檢測純度不低于98% ;人參皂苷Rgl，產品編號TCM-041，HPLC檢測純度不低于98%。
[0017]巖藻聚糖硫酸酯為市購產品或者為常規(guī)方法得到的產品，產品純度為80%以上，其余20%為其它多糖成分。例如，sigma公司的產品，純度不低于85%，產品編號F8065。
[0018]HlNl流感病毒裂解疫苗，例如，浙江天元生物藥業(yè)有限公司生產的甲型HlNl流感病毒裂解疫苗，國藥準字S20090027 ;華蘭生物疫苗有效公司生產的甲型HlNl流感病毒裂解疫苗，國藥準字S20090016。
[0019]實施例1
[0020]納米乳劑載體的制備(A):
[0021](I)分別稱取1.5g吐溫80，1.0g Span80, 1.5g分子量為400道爾頓的聚乙二醇，加入到玻璃容器中，室溫下攪拌3?10分鐘，轉速300轉/分鐘，混勻后加入4g注射用大豆油，繼續(xù)攪拌混合均勻得到混合物；
[0022](2)在上述步驟(I)的混合物中滴入4g注射用水，室溫，在260轉/分鐘下攪拌5?15分鐘，得到納米乳劑載體。
[0023]實施例2
[0024]納米乳劑載體的制備⑶:
[0025](I)分別稱取0.04g吐溫80，0.04g Span80, 0.12g分子量為400道爾頓的聚乙二醇，加入到玻璃容器中，室溫下攪拌3?10分鐘，轉速300轉/分鐘，混勻后加入4g注射用大豆油，繼續(xù)攪拌混合均勻得到混合物；
[0026](2)在上述步驟(I)的混合物中滴入4g注射用水，室溫，在260轉/分鐘下攪拌5?15分鐘，得到納米乳劑載體。
[0027]實施例3
[0028]納米乳劑載體的制備(C):
[0029](I)分別稱取0.4g吐溫80，0.8g Span80, 1.2g分子量為400道爾頓的聚乙二醇，加入到玻璃容器中，室溫下攪拌3?10分鐘，轉速300轉/分鐘，混勻后加入0.05g注射用大豆油，繼續(xù)攪拌混合均勻得到混合物；
[0030](2)在上述步驟(I)的混合物中滴入4.0g注射用水，室溫，在260轉/分鐘下攪拌5?15分鐘，得到納米乳劑載體。
[0031]實施例4
[0032](I)稱取市購的巖藻聚糖硫酸酯162mg, 1.62mg人參阜苷Rgl溶于1.0ml水中，配制成水溶液；
[0033](2)將上述(I)配制的水溶液與4.0ml市購得HlNl流感病毒裂解疫苗(血凝素含量為30μ g/ml)混合，然后再向其混合物中加入1.0ml生理鹽水，得總體積為6ml的含巖藻聚糖硫酸酯和人參皂苷Rgl的流感疫苗，在溫度4°C保存，備用；
[0034](3)稱取6g注射用大豆油，2.0g分子量400道爾頓的聚乙二醇，0.5g吐溫80，1.5gSpan80于玻璃容器中，溫度4°C，在220轉/分鐘下攪拌5_10分鐘，充分混勻，得到混合溶液；
[0035](4)在上述(3)的混合溶液中慢慢滴入(2)的含巖藻聚糖硫酸酯和人參皂苷Rgl的流感疫苗6ml，在溫度4°C、在220轉/分鐘下攪拌5_30分鐘，得到含有巖藻聚糖硫酸酯、納米乳劑為佐劑的流感病毒疫苗。
[0036]實施例5
[0037](I)稱取市購的巖藻聚糖硫酸酯1.2g，1mg人參皂苷Rbl溶于2ml水中，配制成水溶液；
[0038](2)將上述(I)配制的水溶液與2.2ml市購得HlNl流感病毒裂解疫苗(血凝素含量為30μ g/ml)混合，然后再向其混合物中加入1.8ml生理鹽水，得總體積為6ml的含巖藻聚糖硫酸酯和人參皂苷Rgl的流感疫苗，在溫度4°C保存，備用；
[0039](3)稱取5.8g注射用大豆油，2.2g分子量400道爾頓的聚乙二醇，0.6吐溫80，
1.4g Span80于玻璃容器中，溫度4°C，在220轉/分鐘下攪拌5_10分鐘，充分混勻，得到混合溶液；
[0040](4)在上述(3)的混合溶液中慢慢滴入(2)的含巖藻聚糖硫酸酯和人參皂苷Rbl的流感疫苗6ml，在溫度4°C、在220轉/分鐘下攪拌5_30分鐘，得到含有巖藻聚糖硫酸酯、納米乳劑為佐劑的流感病毒疫苗。
[0041]實施例6
[0042](I)稱取市購的巖藻聚糖硫酸酯4.0g,5mg人參阜苷Rgl, 5mg人參阜苷Rbl,溶于2ml水中，配制成水溶液；
[0043](2)將上述(I)配制的水溶液與2.1ml市購得HlNl流感病毒裂解疫苗(血凝素含量為30 μ g/ml)混合，然后再向其混合物中加入1.9ml生理鹽水，得總體積為6ml的含巖藻聚糖硫酸酯和人參皂苷Rgl的流感疫苗，在溫度4°C保存，備用；
[0044](3)稱取6.5g注射用大豆油，1.5g分子量400道爾頓的聚乙二醇，1.2吐溫80，0.8g Span80于玻璃容器中，溫度4°C，在260轉/分鐘下攪拌5_10分鐘，充分混勻，得到混合溶液；
[0045](4)在上述(3)的混合溶液中慢慢滴入(2)的含巖藻聚糖硫酸酯和人參皂苷Rgl與Rbl的流感疫苗6ml，在溫度4°C、在220轉/分鐘下攪拌5-30分鐘，得到含有巖藻聚糖硫酸酯、納米乳劑為佐劑的流感病毒疫苗。
[0046]實施例7
[0047](I)稱取市購的巖藻聚糖硫酸酯1.0g, 0.34g人參皂苷Rbl溶于2ml水中，配制成水溶液；
[0048](2)將上述(I)配制的水溶液與2.5ml市購得HlNl流感病毒裂解疫苗(血凝素含量為30 μ g/ml)混合，然后再向其混合物中加入1.5ml生理鹽水，得總體積為6ml的含巖藻聚糖硫酸酯和人參皂苷Rgl的流感疫苗，在溫度4°C保存，備用；
[0049](3)稱取6.1g注射用大豆油，1.9g分子量400道爾頓的聚乙二醇，1.0聚氧乙烯蓖麻油，1.0g Span80于玻璃容器中，溫度4°C，在230轉/分鐘下攪拌5_10分鐘，充分混勻，得到混合溶液；
[0050](4)在上述(3)的混合溶液中慢慢滴入(2)的含巖藻聚糖硫酸酯和人參皂苷Rbl的流感疫苗6ml，在溫度4°C、在220轉/分鐘下攪拌5_30分鐘，得到含有巖藻聚糖硫酸酯、納米乳劑為佐劑的流感病毒疫苗。
[0051]實施例8
[0052](I)稱取市購的巖藻聚糖硫酸酯200mg，20mg人參皂苷Rgl溶于2.1ml水中，配制成水溶液；
[0053](2)將上述(I)配制的水溶液與2.0ml市購得HlNl流感病毒裂解疫苗(血凝素含量為30 μ g/ml)混合，然后再向其混合物中加入1.9ml生理鹽水，得總體積為6.0ml的含巖藻聚糖硫酸酯和人參皂苷Rgl的流感疫苗，在溫度4°C保存，備用；
[0054](3)稱取6.3g注射用大豆油，1.7g分子量400道爾頓的聚乙二醇，1.3吐溫80，
0.7g Span80于玻璃容器中，溫度4°C，在210轉/分鐘下攪拌5_10分鐘，充分混勻，得到混合溶液；
[0055](4)在上述(3)的混合溶液中慢慢滴入(2)的含巖藻聚糖硫酸酯和人參皂苷Rgl的流感疫苗6.3ml，在溫度4°C、在220轉/分鐘下攪拌5_30分鐘，得到含有巖藻聚糖硫酸酯、納米乳劑為佐劑的流感病毒疫苗。
[0056]實施例9
[0057](I)稱取市購的巖藻聚糖硫酸酯300mg，30mg人參皂苷Rbl溶于1.8ml水中，配制成水溶液；
[0058](2)將上述(I)配制的水溶液與1.7ml市購得HlNl流感病毒裂解疫苗(血凝素含量為30 μ g/ml)混合，然后再向其混合物中加入2.5ml生理鹽水，得總體積為6.0ml的含巖藻聚糖硫酸酯和人參皂苷Rgl的流感疫苗，在溫度4°C保存，備用；
[0059](3)稱取5.5g注射用大豆油，2.5g分子量400道爾頓的聚乙二醇，0.9吐溫80，1.1g Span80于玻璃容器中，溫度4°C，在210轉/分鐘下攪拌5_10分鐘，充分混勻，得到混合溶液；
[0060](4)在上述(3)的混合溶液中慢慢滴入(2)的含巖藻聚糖硫酸酯和人參皂苷Rbl的流感疫苗6.0ml，在溫度4°C、在220轉/分鐘下攪拌5_30分鐘，得到含有巖藻聚糖硫酸酯、納米乳劑為佐劑的流感病毒疫苗。
[0061]實施例10
[0062](I)稱取市購的巖藻聚糖硫酸酯0.150g, 1.5mg人參阜苷Rgl溶于1.0ml水中，配制成水溶液；
[0063](2)將HlNl流感病毒裂解疫苗濃縮至血凝素含量為0.2mg/ml,然后將上述(I)配制的水溶液與1ml濃縮后的流感病毒裂解疫苗混合，得總體積為Ilml的含巖藻聚糖硫酸酯和人參皂苷Rgl的流感疫苗，在溫度4°C保存，備用；
[0064](3)稱取0.12g注射用大豆油，0.12g分子量400道爾頓的聚乙二醇，0.6g吐溫80，0.6g Span80于玻璃容器中，溫度4°C，在220轉/分鐘下攪拌5_10分鐘，充分混勻，得到混合溶液；
[0065](4)在上述(3)的混合溶液中慢慢滴入(2)的含巖藻聚糖硫酸酯和人參皂苷Rgl的流感疫苗I Iml，在溫度4°C、在220轉/分鐘下攪拌5_30分鐘，得到含有巖藻聚糖硫酸酯、納米乳劑為佐劑的流感病毒疫苗。
【權利要求】
1.一種含有巖藻聚糖硫酸酯的免疫佐劑，其特征是由下列質量比的組分組成:巖藻聚糖硫酸酯I?20% ;人參皂苷0.01?2% ;余為載體； 所述載體由下列質量比的組分組成:乳化劑I?30% ;助乳化劑I?50% ;油相I?50% ;余為水相。
2.根據權利要求1所述的含有巖藻聚糖硫酸酯的免疫佐劑，其特征在于，所述的人參皂苷為Rgl或Rbl中的一種，或者為質量混合物比為1:100?100:1的Rgl與Rbl的混合物。
3.根據權利要求1所述的含有巖藻聚糖硫酸酯的免疫佐劑，其特征在于，所述乳化劑為常規(guī)的吐溫80或聚氧乙烯蓖麻油中的一種，或者為質量混合比為3:1?1:3的常規(guī)吐溫80與Span80的混合物，或者為質量混合比為1:1的常規(guī)聚氧乙烯蓖麻油與Span80的混合物。
4.根據權利要求1所述的含有巖藻聚糖硫酸酯的免疫佐劑，其特征在于，所述助乳化劑為常規(guī)的I，2-丙二醇或聚乙二醇400中的一種。
5.根據權利要求1所述的含有巖藻聚糖硫酸酯的免疫佐劑，其特征在于，所述油相為常規(guī)的肉豆蘧酸異丙酯或油酸乙酯或注射用大豆油中的一種。
6.根據權利要求1所述的含有巖藻聚糖硫酸酯的免疫佐劑，其特征在于，所述水相為注射用水或者含有藥物或疫苗成分的注射用水溶液。
7.—種如權利要求1所述的含有巖藻聚糖硫酸酯的免疫佐劑在制備流感疫苗中的應用，其特征在于，含有巖藻聚糖硫酸酯的免疫佐劑與流感疫苗血凝素的質量比為6000?321000:1，其中，所述的含有巖藻聚糖硫酸酯的免疫佐劑由下列質量比的組分組成:巖藻聚糖硫酸酯I?20% ;人參皂苷0.01?2% ;余為載體。
【文檔編號】A61P31/16GK104383534SQ201410579310
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月24日 優(yōu)先權日:2014年10月24日
【發(fā)明者】苗笑晨, 苗其壯 申請人:威海芝恩藥業(yè)股份有限公司