αB-晶狀體蛋白的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了αB-晶狀體蛋白在制備抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中鉀離子通道藥物中的用途。本發(fā)明給予急性高眼壓大鼠模型注射αB-晶狀體蛋白，與未注射組相比，注射組大鼠視網(wǎng)膜上kv1.1和kv1.3的表達量降低，表明αB-晶狀體蛋白具有抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中鉀離子通道的功能。本發(fā)明為臨床上通過抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中鉀離子通道的功能治療相關疾病提供了新的候選藥物。
【專利說明】ctB-晶狀體蛋白的用途
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術領域】，涉及aB-晶狀體蛋白的新用途，具體涉及aB-晶 狀體蛋白在制備抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中鉀離子通道藥物中的用途。
【背景技術】
[0002] 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（RGCs)是視網(wǎng)膜內(nèi)信息傳遞的最后一站，其軸突先組成視網(wǎng) 膜的神經(jīng)纖維層，然后匯聚成視神經(jīng)，在視覺通路中起著重要的傳導作用。視神經(jīng)損傷能夠 弓丨起視神經(jīng)病變，從而引起視覺缺失，這種情況在許多眼科病重都能見到，如視神經(jīng)炎、視 路占位性病變、青光眼、缺血性視神經(jīng)病變和糖尿病視網(wǎng)膜病變等。近年來，關于視神經(jīng)保 護的研究受到國內(nèi)外眾多學者的關注。研究顯示，外傷性視神經(jīng)病變視神經(jīng)損害的主要病 理學基礎是RGCs的過度凋亡及神經(jīng)節(jié)細胞的再生障礙。視神經(jīng)損傷后對RGCs的保護主要 是停止或防止其發(fā)生凋亡。阻斷或降低RGCs的凋亡途徑和增加RGCs的存活能力，已成為 防止視神經(jīng)病變、保存患者視功能的研究方向。
[0003] 研究表明在RGCs上許多種鉀離子通道存在，這些鉀離子通道在RGCs的發(fā)育、神經(jīng) 軸再生、軸突導向、動作電位和反復放電調解中起到了很重要的作用。Kvl通道家族屬于電 壓門控鉀離子通道。研究證明大鼠的RGCs表達kvl.l、kvl. 2、kvl. 3,但是不表達kvl. 5,并 且通過在大鼠玻璃體腔內(nèi)注射鉀離子通道阻滯劑，發(fā)現(xiàn)阻斷kvl. 1、kvl. 3、可減少RGCs的 凋亡，只阻斷kvl. 2只起很小的作用，阻斷kvl. 5不起作用。Kvl. 1和kvl. 3通過凋亡機制 中的不同通路促進RGCs細胞的自發(fā)性凋亡，kvl. 1的衰竭增加了抗凋亡因子Bcl-xL等的表 達，而kvl. 3的衰竭減少了caspase-3、caspase-9和Bad等的表達。最終，kvl. 1和kvl. 3 的衰竭均可增加視神經(jīng)橫斷傷后RGCs的存活率。
[0004] aB-晶狀體蛋白是晶狀體主要的蛋白成分之一，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)其在角 膜、虹膜、視網(wǎng)膜、睫狀體、視神經(jīng)都有一定的存在且與眼部疾病的發(fā)病機制有著重要聯(lián)系。 aB-晶狀體蛋白是一類普通存在的小分子熱休克蛋白，有強大的分子伴侶作用。發(fā)明人 所在的課題組已經(jīng)證明aB-晶狀體蛋白對大鼠視網(wǎng)膜無毒性作用，可促進急性高眼壓后 RGCs的存活，并且通過增加RGCs中GAP-43表達促進RGCs的軸突再生。
[0005] 雖然許多研究證明aB-晶狀體蛋白對RGCs具有保護作用，但是其作用機制尚不 明確。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明是基于以下實驗發(fā)現(xiàn)提出的：給予大鼠急性高眼壓模型以aB-晶狀體蛋 白注射，與未注射相比，注射aB-晶狀體蛋白后，RGCs細胞中kvl.l、kvl. 3表達降低，同時 Bcl-xL升高、caspase-3降低，表明aB-晶狀體蛋白是通過控制鉀離子通道kvl. 1和kvl. 3 來調控RGCs細胞的凋亡。
[0007] 本發(fā)明提供了aB-晶狀體蛋白在制備抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中鉀離子通道藥物 中的用途。所述鉀離子通道可以是kvl. 1、可以是kvl. 3、或是kvl. 1和kvl. 3的組合。kvl. 1 和kvl. 3通過不同的通路控制細胞的凋亡過程，單獨抑制上述兩種鉀離子通道中的一種就 可以達到控制細胞凋亡的目的。在本發(fā)明的具體實施方案中，給予大鼠急性高眼壓模型以 aB-晶狀體蛋白注射，與未注射相比，注射aB-晶狀體蛋白后，RGCs細胞中的kvl. 1和 kvl. 3兩種通道蛋白的表達均受到抑制。
[0008] 本發(fā)明還提供了aB-晶狀體蛋白在制備促進視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中Bcl-xL蛋白 表達升高的藥物中的用途。在本發(fā)明的具體的實施方案中，給予大鼠急性高眼壓模型以 aB-晶狀體蛋白注射，與未注射相比，注射aB-晶狀體蛋白后，RGCs細胞中Bcl-xL表達升 商。
[0009] 本發(fā)明還提供樂aB-晶狀體蛋白在制備抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中caspase-3 蛋白表達的藥物中的用途。在本發(fā)明的具體的實施方案中，給予大鼠急性高眼壓模型以 aB-晶狀體蛋白注射，與未注射相比，注射aB-晶狀體蛋白后，RGCs細胞中caspase-3表 達降低。
[0010] 本發(fā)明還提供了aB-晶狀體蛋白在制備抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡的藥物中的 用途。在本發(fā)明的具體的實施方案中，給予大鼠急性高眼壓模型以aB-晶狀體蛋白注射， 與未注射相比，注射aB-晶狀體蛋白后，RGCs細胞中Bcl-xL表達升高，同時caspase-3表 達降低，表明RGCs細胞凋亡的進程受到抑制。
[0011] 本發(fā)明還提供了aB-晶狀體蛋白在制備治療視神經(jīng)損傷的藥物中的用途。視神 經(jīng)損傷的主要病理學基礎是RGCs的過度凋亡及神經(jīng)節(jié)細胞的再生障礙。視神經(jīng)損傷后對RGCs的保護主要是停止或防止其發(fā)生凋亡。
[0012] 通過建立視神經(jīng)損傷的動物模型并進行實驗研究，以尋求有效的治療方法，對于 研究視神經(jīng)損傷機制及治療具有重要意義。現(xiàn)在國內(nèi)外視神經(jīng)損傷模型分為機械性視神經(jīng) 損傷的動物模型、缺血性視神經(jīng)損傷的動物模型、高眼壓性視神經(jīng)損傷的動物模型。高眼壓 性視神經(jīng)損傷的動物模型包括急性暫時性高眼壓和慢性持續(xù)性高眼壓。急性暫時性高眼壓 可以通過下列方法實現(xiàn)：（1)前房灌注法；（2)玻璃體腔灌注法；(3)藥物誘導法。上述所提 到的構建視神經(jīng)損傷模型的方法均可用于本發(fā)明。
[0013] 在本發(fā)明的具體的實施方案中，選用的是前房灌注生理鹽水法制備的急性高眼壓 視神經(jīng)損傷模型，具體的構建過程如下：用10%水合氯醛（0.4ml/100g)行大鼠左下腹腔注 射麻醉。全身麻醉成功后用左氧氟沙星滴眼液沖洗右眼結膜囊，再滴復方托吡卡胺滴眼液 和鹽酸奧布卡因滴眼液各一滴，兩種滴眼液使用時間間隔5min。在解剖顯微鏡下將連有生 理鹽水輸液器的33G針頭于角膜緣做隧道切口刺入前房，注意勿傷虹膜和晶狀體，打開輸 液調節(jié)器至最大。保持液體液平面與鼠眼垂直距離156cm(產(chǎn)生15. 22kPa，相當于120mmHg 的眼內(nèi)壓）。當莫非氏管中無液體滴注并且球結膜、虹膜、視網(wǎng)膜蒼白時說明急性高眼壓模 型成功。間斷滴諾氟沙星滴眼液以預防感染并防止角膜干燥。持續(xù)灌注60min，拔出針頭， 可見球結膜及虹膜恢復正常顏色，涂抹紅霉素眼膏。前房穿刺過程中傷及晶狀體、虹膜以及 穿刺后發(fā)生眼部感染的大鼠予以剔除。
[0014] 本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：首次發(fā)現(xiàn)了aB-晶狀體蛋白與kvl. 1和kvl. 3兩種 通道蛋白的相關性，S卩aB-晶狀體蛋白可以抑制kvl. 1和kvl. 3兩種鉀離子通道蛋白的表 達，從而阻斷鉀離子通道的功能。根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)，可以開發(fā)aB-晶狀體蛋白作為治療跟鉀 離子通道功能相關的疾病的候選藥物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015] 圖1顯示術后7dQRT-PCR檢測結果；
[0016] 圖2顯示術后14dQRT-PCR檢測結果；
[0017] 圖3顯示術后7d和14d蛋白表達量的Westernblot結果；
[0018] 圖4顯不術后7d蛋白表達量的統(tǒng)計結果；
[0019] 圖5顯示術后14d蛋白表達量的統(tǒng)計結果。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合具體的實施例進一步說明本發(fā)明，本發(fā)明的實施例僅用于解釋本發(fā)明， 并不意味著限制本發(fā)明的保護范圍。
[0021] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0022] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0023] 實驗動物與分組：
[0024] 3月齡雄性清潔級SD大鼠60只，體重220g左右，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學 院實驗動物中心提供，許可證號SCXK-(軍）2012-0004,飼養(yǎng)于武警總醫(yī)院總醫(yī)院中心實驗 室，經(jīng)裂隙燈及眼底鏡檢查無眼部病變。隨機分成以下三組 ：
[0025] (1)急性高眼壓組（A組）：急性高眼壓模型成功構建后，不做其他處理。
[0026] (2)急性高眼壓+玻璃體腔注射生理鹽水組（B組）：急性高眼壓模型成功建立后， 行玻璃體注射生理鹽水5ii1。
[0027] (3)急性高眼壓+玻璃體腔注射aB-晶狀體蛋白組（C組）：急性高眼壓模型建立 后，行玻璃體腔注射aB-晶狀體蛋白（濃度l*l(T5g/L)5ia。
[0028] 每組20只，右眼為實驗眼。分別于術后7d和14d，每組取5只大鼠視網(wǎng)膜，使用 QRT-PCR法檢測kvl. 1、kvl. 3、Bcl-xL、和caspase_3mRNA的表達水平；分別于術后7d和 14d時，每組取5只大鼠視網(wǎng)膜，使用westernblot檢測視網(wǎng)膜kvl. 1、kvl. 3、Bcl-xL、和 caspase-3的蛋白表達水平。
[0029] 實施例1大鼠急性高眼壓模型的建立
[0030] 方法：用10%水合氯醛（0. 4ml/100g)行大鼠左下腹腔注射麻醉。全身麻醉成功 后用左氧氟沙星滴眼液沖洗右眼結膜囊，再滴復方托吡卡胺滴眼液和鹽酸奧布卡因滴眼液 各一滴，兩種滴眼液使用時間間隔5min。在解剖顯微鏡下將連有生理鹽水輸液器的33G針 頭于角膜緣做隧道切口刺入前房，注意勿傷虹膜和晶狀體，打開輸液調節(jié)器至最大。保持液 體液平面與鼠眼垂直距離156cm(產(chǎn)生15. 22kPa，相當于120mmHg的眼內(nèi)壓）。當莫非氏管 中無液體滴注并且球結膜、虹膜、視網(wǎng)膜蒼白時說明急性高眼壓模型成功。間斷滴諾氟沙星 滴眼液以預防感染并防止角膜干燥。持續(xù)灌注60min，拔出針頭，可見球結膜及虹膜恢復正 常顏色，涂抹紅霉素眼膏。前房穿刺過程中傷及晶狀體、虹膜以及穿刺后發(fā)生眼部感染的大 鼠予以剔除。
[0031] 實施例2大鼠急性高眼壓模型玻璃體腔藥物注射
[0032] aB-晶狀體蛋白溶液的配制：將商品aB-晶狀體蛋白干粉（購自sigma)溶于生 理鹽水中，使其終濃度為l*l(T5g/L。
[0033] 方法：大鼠急性高眼壓模型建立后，使用微量進樣器，在顯微鏡下于大鼠右眼角膜 緣后刺入玻璃體腔，從角膜中央可見放大的針頭，緩慢注射，拔出針頭，結膜囊內(nèi)涂紅霉素 眼膏。其中B組大鼠玻璃體腔內(nèi)注入等滲鹽水5iU，C組大鼠玻璃體腔內(nèi)注入l*l(T5g/L的 aB-晶狀體蛋白溶液5iU。用蓋玻片輕壓角膜，觀察玻璃體腔注射部位有無出血及滲漏， 眼底視網(wǎng)膜反光是否正常，眼底血管走行及充盈是否正常。顯微鏡下觀察確認玻璃體腔無 出血、無晶狀體及虹膜損傷者納入實驗。諾氟沙星滴眼液點術眼一滴，然后用紅霉素眼膏涂 抹術眼。
[0034] 實施例 3QRT-PCR法檢測kvl. 1、kvl. 3、Bcl-xL和caspase-3 的mRNA水平
[0035] 步驟：
[0036] 1.視網(wǎng)膜總RNA提取
[0037] 分別于術后7d和14d時，每組取5只大鼠，10%水合氯醛腹腔麻醉。取出術眼置 冰浴生理鹽水中漂洗3min*2次。顯微鏡下，去除眼前節(jié)，取出視網(wǎng)膜組織。按超純RNA提 取試劑盒（購自北京康為世紀生物科技有限公司）的說明提取視網(wǎng)膜組織中的總RNA。
[0038] 2.RNA定量
[0039] 吸取2ylRNA，以空氣作空白對照，用ABI核酸定量分析儀檢測RNA純度，純RNA 的0D260/280比值接近2. 0，DNA的0D260/280的比值接近1. 8。用ABI核算定量分析儀測 定0D260值進行準確定量。
[0040] 3.反轉錄
[0041] 用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒（購自北京康為世紀生物科技有限公司） 進行反轉錄，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行，步驟如下：
[0042] (1)將RNA模板、引物、5*RTmix和無RNase的水溶解并置于冰上備用。按下表向 反應管中加入20ii1反應體系的第一部分，混勻。（見表1)
[0043] 表1反應體系的第一部分
【權利要求】
1. a B-晶狀體蛋白在制備抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中鉀離子通道藥物中的用途。
2. 根據(jù)權利要求1所述的用途，其特征在于，所述抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中鉀離子通 道是抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中鉀離子通道蛋白的表達。
3. 根據(jù)權利要求2所述的用途，其特征在于，所述鉀離子通道蛋白是kvl. 1。
4. 根據(jù)權利要求1所述的用途，其特征在于，所述鉀離子通道蛋白是kvl. 3。
5. 根據(jù)權利要求1所述的用途，其特征在于，所述鉀離子通道蛋白是kvl. 1和kvl. 3。 6. a B-晶狀體蛋白在制備促進視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中Bcl-xL蛋白表達升高的藥物中的 用途。 7. a B-晶狀體蛋白在制備抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中caspase-3蛋白表達的藥物中的 用途。
8. 根據(jù)權利要求1-7中任一項所述的用途，其特征在于，所述視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞來自 于大鼠。
【文檔編號】A61K38/17GK104383521SQ201410584604
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月27日 優(yōu)先權日:2014年10月27日
【發(fā)明者】吳志鴻, 侯世科, 樊毫軍, 馬艷 申請人:中國人民武裝警察部隊總醫(yī)院