一種利用vWF穩(wěn)定表達人凝血因子VIII的乳腺特異共表達載體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了屬于生物【技術領域】的一種利用vWF穩(wěn)定表達人凝血因子VIII的乳腺特異共表達載體。它包括骨架質粒和hFVIIIBDD-IRES-vWF片段，其中所述骨架質粒為pcDNA3.1(-)質粒，hFVIIIBDD-IRES-vWF片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。本發(fā)明還公開了共表達載體的制備方法，包括以下步驟：(1)利用包含hFVIIIBDD-IRES-vWF片段的共表達質粒，通過顯微注射法制備轉基因哺乳動物，(2)從步驟(1)所得轉基因哺乳動物的乳汁中分離人凝血因子VIII即得。在本發(fā)明制備的轉基因動物乳汁中所表達的vWF蛋白能夠顯著延長凝血因子VIII的半衰期。
【專利說明】-種利用vWF穩(wěn)定表達人凝血因子Vl I I的乳腺特異共表達 載體

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種利用VWF穩(wěn)定表達人凝血因子VIII的乳 腺特異共表達載體。

【背景技術】
[0002] 血友病是一種隱性遺傳的出血性疾病，是由于血液中某些凝血因子的缺乏而導致 的凝血功能障礙。根據(jù)所缺乏的特定凝血因子可以分為血友病A(hFVIII缺乏）、血友病 B (hFIX缺乏）和血友病C (hFXI缺乏）。其中發(fā)病率最高的是由于基因 hFVIII先天缺陷導 致凝血因子VIII缺乏引起的血友病A，約占血友病總數(shù)的85%，男性發(fā)病率約為1/5000,其 中三分之一的是由于基因自發(fā)突變引起的。
[0003] 人凝血因子VIII基因（hFVIII)，主要在肝臟中合成，兩個C區(qū)（各含約150個氨 基酸組成）和一個大的B區(qū)（980個氨基酸），各區(qū)的排列順序為A1-A2-B-A3-C1-C2。該初 級結構經(jīng)糖基化、二硫鍵形成、酪氨酸殘基硫酸化、蛋白質折疊等加工后分泌到循環(huán)系統(tǒng)中 時，是由兩條鏈以Ca 2+連接組成，即A1-A2-B或A1-A2結構域所組成的重鏈及由A3-C1-C2構 成的輕鏈，因 B區(qū)斷裂位點不同導致重鏈分子量在90?200kDa間，輕鏈分子量則為80kDa。 科學家認為B區(qū)是非必須片段，目前不確定其主要功能。vWF(von Willebrand factor,血管 性血友病因子）基因位于12號染色體上，其編碼獲得vWF蛋白是一種大分子量的多亞基糖 蛋白，由多個220kD的亞基組成，因終產物的聚合度不一，分子量最高者可高達20MD。一方 面，vWF可以介導血小板粘附于受損的血管壁，形成血栓得以止血；另外，正常情況下，vWF 與hFVIII在血漿中緊密結合形成穩(wěn)定的復合物。FVIII :vWF復合物的形成對維持hFVIII 的半衰期至關重要，因為復合體的形成在體內阻礙了可能由細胞表面受體介導的hFVIII 分解。活化時，重鏈刪除殘余的B區(qū)，Al和A2斷裂并與脫離了 vWF的輕鏈組合為活化的三 聚體。
[0004] 專利201310297925. 2公開了一種利用家兔乳腺生物反應器制備第八凝血因子的 方法。該方法制備的人第八凝血因子由于沒有保護元件vWF極不穩(wěn)定，是一種非常不穩(wěn)定 的蛋白質，極易失活，不利于活性因子的保存。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術問題在于克服目前以動物乳腺反應器制備人凝血因子VIII 時，所得人凝血因子VIII不穩(wěn)定的缺陷，提供了一種利用動物乳腺反應器制備人凝血因子 VIII的方法。
[0006] -種利用vWF穩(wěn)定表達人凝血因子VIII的乳腺特異共表達載體，包括骨架質粒和 hFVIIIBDD-IRES-vWF 片段，其中所述骨架質粒為 pcDNA3. 1(_)質粒，hFVIIIBDD-IRES-vWF 片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :1所示。
[0007] 所述共表達載體的啟動子為P1A3啟動子。
[0008] -種包含所述的利用vWF穩(wěn)定表達人凝血因子VIII的乳腺特異共表達載體的重 組表達轉化體，所述重組表達轉化體的宿主細胞是HC-Il細胞株。
[0009] 本發(fā)明所述重組表達轉化體是指含有本發(fā)明所述轉基因質粒的轉化細胞。其中所 述重組表達轉化體的制備方法較佳地為：將上述轉基因質粒轉化至宿主細胞中制得。所述 的宿主細胞較佳地為本領域常規(guī)的各種宿主細胞，只要能滿足使所述轉基因質粒穩(wěn)定地自 行復制，并且其所攜帶的外源基因可被有效表達即可，所述宿主細胞較佳地為真核細胞，優(yōu) 選地為HC-Il細胞株。所述細胞株的制備方法為本領域常規(guī)制備方法，較佳地為市售可得。 所述轉化方法為本領域常規(guī)轉化方法，其較佳地包括化學轉化法、熱激法或電轉法。
[0010] 一種利用動物乳腺反應器制備人凝血因子VIII的方法，該制備方法包括以下步 驟：
[0011] (1)利用所述的利用VWF穩(wěn)定表達人凝血因子VIII的乳腺特異共表達載體，通過 顯微注射法制備轉基因哺乳動物；
[0012] (2)從步驟（1)所得轉基因哺乳動物的乳汁中分離人凝血因子VIII即得。
[0013] 步驟（1)所述轉基因哺乳動物為轉基因牛、轉基因羊或者轉基因小鼠。
[0014] 本發(fā)明所述的轉基因質粒為本領域常規(guī)的轉基因質粒。所述轉基因質粒較佳地 為包含hFVIIIBDD-IRES-vWF片段的轉基因質粒，所述轉基因質粒的載體骨架較佳地包 括：各種質粒、粘粒、噬菌體或病毒載體等，本發(fā)明所述轉基因質粒的載體骨架優(yōu)選地為 pcDNA3. 1 (-)質粒。
[0015] 較佳地，將本發(fā)明所述hFVIIIBDD-IRES-vWF片段克隆連接到共表達質粒的基因 表達盒中。本發(fā)明所述基因表達盒為本領域常規(guī)基因表達盒，所述表達盒較佳地包括合適 的轉錄調節(jié)序列，以及轉錄終止信號，還包括有助于實現(xiàn)表達或實現(xiàn)表達所需的其他因子， 如表達增強子元件。所述基因表達盒在骨架質粒的位置為任何位置，只要不影響該骨架質 粒的其他功能以及hFVIIIBDD-IRES-vWF片段的表達即可。
[0016] 本發(fā)明所述共表達質粒的基因表達盒中還包括啟動子，其中所述啟動子為常規(guī)啟 動子，較佳地包括組成型啟動子，誘導型啟動子和/或組織特異性啟動子。其中所述組成型 啟動子是在大多數(shù)生理和發(fā)育條件下在大多數(shù)組織中有活性的啟動子。誘導型啟動子是受 到生理或發(fā)育調節(jié)的啟動子，例如通過應用化學誘導劑進行調節(jié)的啟動子。組織特異性啟 動子僅在特定類型的組織或細胞中有活性。本發(fā)明所述基因表達盒中的啟動子為常規(guī)啟動 子，較佳地為真核啟動子，更佳地為CMV啟動子，優(yōu)選地為P1A3啟動子。
[0017] 本發(fā)明所述hFVIIIBDD片段為本領域常規(guī)的表達人凝血因子hFVIIIBDD的片段， 其序列較佳地為如序列表中SEQ ID NO :1中第Ipb到第4416pb的核苷酸所示，所述vWF片 段為本領域常規(guī)的表達血管性血友病因子的片段，其序列較佳地為如序列表中SEQ ID NO: 1中第5360pb到第13801bp所示，所述IRES片段為本領域常規(guī)的IRES片段，其序列較佳地 為如序列表中SEQ ID NO :1中第4629pb到5266pb所示。
[0018] 其中步驟（2)從所得轉基因動物的乳汁中分離人凝血因子VIII的方法為本領域 常規(guī)的蛋白質分離方法。
[0019] 所述的利用vWF穩(wěn)定表達人凝血因子VIII的乳腺特異共表達載體在制備基因治 療藥物中的應用。
[0020] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明所述利用動物乳腺反應器制備人凝血因子VIII的方 法能夠顯著延長凝血因子VIII的半衰期，有效提高所得凝血因子VIII的穩(wěn)定性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖 1 為 dpcDNA3. I (-)-PlA3-hFVIIIBDD-IRES-vWF 載體的構建流程圖。
[0022] 圖 2 為 pcDNA3. 1 (_) -vWF 質粒結構圖。
[0023] 圖3為pcDNA3. I (-)-vWF質粒酶切鑒定結果圖。
[0024] 圖4為pcDNA3. I (-)-IRES載體的構建圖。
[0025] 圖 5 為 pcDNA3. I (-) -hFVIIIBDD-IRES 載體酶切鑒定結果圖。
[0026] 圖 6 為 pcDNA3. I (-) -hFVIIIBDD-IRES-vWF 載體酶切鑒定結果圖。
[0027] 圖 7 為 dpcDNA3. I (-)-PlA3-hFVIIIBDD-IRES-vWF 載體體酶切鑒定結果圖。
[0028] 圖8為vWF外源基因瞬時轉染細胞的RT-PCR結果圖。
[0029] 圖9為共表達載體轉染HC-Il細胞后hFVIIIBDD基因的轉錄分析結果圖。
[0030] 圖10為PCR方法鑒定共表達轉基因小鼠結果圖。
[0031] 圖11為轉基因小鼠乳汁中hFVIII濃度和活性的半衰期結果圖。

【具體實施方式】
[0032] 下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。
[0033] 實施例1
[0034] 下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實 施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商 品說明書選擇。
[0035] 實施例1構建含PlA3-hFVIIIBDD-IRES-vWF片段的共表達載體
[0036] 1、已有的 pcDNA3. 1 (_) -vWF 載體鑒定
[0037] pcDNA3. 1 (_) -vWF-neo載體的構建方法請參見文獻：諸江，王鴻利，陳淳等；人血 管性血友病因子cDNA全長的克隆與表達.中華血液學雜志[J] ;1996，17(9) :475-478.。該 載體經(jīng)過酶切鑒定以及測序后，鑒定其中的vWF片段是正確的，因此將該載體作為后續(xù)目 的載體中vWF片段的來源。
[0038] pcDNA3. 1 (_) -vWF-neo載體的酶切鑒定反應體系如表1和表2所示：
[0039] 表 I DraI 酶切鑒定 pcDNA3. 1 (_)-vWF 質粒
[0040]

【權利要求】
1. 一種利用vWF穩(wěn)定表達人凝血因子VIII的乳腺特異共表達載體，其特征在于，包 括骨架質粒和hF VIIIBDD-IRES-vWF片段，其中所述骨架質粒為pcDNA3. 1(_)質粒，hF VIIIBDD-IRES-vWF片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :1所示。
2. 根據(jù)權利要求1所述一種利用vWF穩(wěn)定表達人凝血因子VIII的乳腺特異共表達載 體，其特征在于，所述共表達載體的啟動子為P1A3啟動子。
3. -種包含如權利要求1-2任一項所述的利用vWF穩(wěn)定表達人凝血因子VIII的乳腺 特異共表達載體的重組表達轉化體，其特征在于，所述重組表達轉化體的宿主細胞是HC-Il 細胞株。
4. 一種利用動物乳腺反應器制備人凝血因子VIII的方法，其特征在于，該制備方法包 括以下步驟： (1) 利用權利要求1或2所述的利用vWF穩(wěn)定表達人凝血因子VIII的乳腺特異共表達 載體，通過顯微注射法制備轉基因哺乳動物； (2) 從步驟（1)所得轉基因哺乳動物的乳汁中分離人凝血因子VIII即得。
5. 根據(jù)權利要求4所述利用動物乳腺反應器制備人凝血因子VIII的方法，其特征在 于，步驟（1)所述轉基因哺乳動物為轉基因牛、轉基因羊或者轉基因小鼠。
6. 權利要求1-2任一項所述的利用vWF穩(wěn)定表達人凝血因子VIII的乳腺特異共表達 載體在制備基因治療藥物中的應用。
【文檔編號】A61K48/00GK104313052SQ201410586289
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月29日 優(yōu)先權日:2014年10月29日
【發(fā)明者】曾凡一, 曾溢滔, 任曉葉 申請人:上海滔滔轉基因工程股份有限公司