一種基于dc細(xì)胞的乙肝病毒t表位肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)工程、基因工程和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種基于DC細(xì)胞的乙肝病毒T表位肽。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種基于DC細(xì)胞的乙肝病毒T表位肽，其特征在于：所述基于DC細(xì)胞的乙肝病毒T表位肽由9個氨基酸殘基組成，其氨基酸序列為：QLFHLCLII。本發(fā)明以堿性氨基酸為骨架，采取固相合成技術(shù)，同步在該骨架上同時合成相同的預(yù)設(shè)氨基酸序列，并以乙肝病毒為設(shè)計靶標(biāo)，并采用合成技術(shù)生產(chǎn)基于DC細(xì)胞的乙肝病毒特異性表位肽；通過DC細(xì)胞體外負(fù)載該表位肽，并將成熟的DC細(xì)胞輸注特定人群體內(nèi)，特異性的產(chǎn)生針對乙肝病毒感染所帶來的危害，尤其是針對慢性乙肝的所產(chǎn)生的清除體內(nèi)病毒和改善臨床癥狀的作用。
【專利說明】—種基于00細(xì)胞的乙肝病毒了表位肽
[0001]本申請是申請日為2011年3月25日、申請?zhí)枮?01110073862.3、發(fā)明名稱為《一種基于IX:細(xì)胞的乙肝病毒I表位肽》的分案申請。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)工程、基因工程和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種基于IX:細(xì)胞的乙肝病毒7表位肽。

【背景技術(shù)】
[0003]全世界有超過4億人感染乙型肝炎病毒，每年有1百萬人死于感染綜合癥，包括肝硬化、肝細(xì)胞癌或者其他并發(fā)癥。現(xiàn)有技術(shù)大多采用中藥或者西藥治療乙肝，雖然有一定療效，但是不能根治乙肝或其他并發(fā)癥，尤其不能有效阻斷因乙型肝炎病毒感染所造成的肝臟纖維化和硬化、阻斷乙肝病毒通過胎盤傳染給胎兒、阻斷乙肝病毒通過乳汁傳染給母乳喂養(yǎng)的新生兒。
[0004]肽合成技術(shù)目前在國內(nèi)外有一些機(jī)構(gòu)都有開展，組織相容性復(fù)合體(冊10 I類限制性細(xì)胞毒性I細(xì)胞(011)在控制胞內(nèi)病原體和腫瘤細(xì)胞生長中起極為重要的作用。通過蛋白質(zhì)基本性質(zhì)分析，疏水性分析，跨膜區(qū)預(yù)測，信號肽預(yù)測，亞細(xì)胞定位預(yù)測，抗原性位點預(yù)測，可以對基因編碼蛋白的性質(zhì)作出初步判斷和預(yù)測。尤其通過疏水性分析和跨膜區(qū)預(yù)測可以預(yù)測基因是否為膜蛋白。將該212個氨基酸與從數(shù)據(jù)庫中的蛋白片段進(jìn)行81^1結(jié)果顯示100條肽與目標(biāo)肽有同源性，其中16條同源性100%，84條為99%，而這100條肽均為的即600；1^6八0；^6蛋白。利用13611011軟件對該212個氛基酸的分析，可以得到該蛋白質(zhì)片段的一般生物學(xué)特性。
[0005]細(xì)胞免疫反應(yīng)在免疫應(yīng)答過程中起著關(guān)鍵的作用。當(dāng)外源性抗原被抗原呈遞細(xì)胞捕獲后，蛋白質(zhì)抗原在內(nèi)吞系統(tǒng)被降解成多肽片段，其中的免疫原性多肽即I細(xì)胞表位與冊扣I類分子結(jié)合，被轉(zhuǎn)運至八?表面供I細(xì)胞受體識別，從而激發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，對其氨基酸序列特征的了解將有助于亞單位疫苗分子的設(shè)計與研制以及增加對免疫系統(tǒng)的更進(jìn)一步理解。因此，對I細(xì)胞表位的預(yù)測以及在此基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造具有重要的理論價值和實際意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種能有效治療乙肝及其各種并發(fā)癥，阻斷阻斷乙肝病毒通過胎盤傳染給胎兒、阻斷乙肝病毒通過乳汁傳染給母乳喂養(yǎng)的新生兒的一種基于IX:細(xì)胞的乙肝病毒I表位肽及其類似物。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
一種基于IX:細(xì)胞的乙肝病毒I表位肽，其特征在于:所述基于IX:細(xì)胞的乙肝病毒丁表位肽由9個氨基酸殘基組成，其氨基酸序列為:亂？見111 (谷氨酰胺-亮氨酸-苯丙氨酸-組氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-異亮氨酸選擇乙型肝炎病毒核心蛋白作為目的抗原。
[0008]相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明以堿性氨基酸為骨架，采取固相合成技術(shù)，同步在該骨架上同時合成相同的預(yù)設(shè)氨基酸序列，并以乙肝病毒為設(shè)計靶標(biāo)，并采用合成技術(shù)生產(chǎn)基于00細(xì)胞的乙肝病毒特異性表位肽；通過IX:細(xì)胞體外負(fù)載該表位肽，并將成熟的IX:細(xì)胞輸注特定人群體內(nèi)，特異性的產(chǎn)生針對乙肝病毒感染所帶來的危害，尤其是針對慢性乙肝的所產(chǎn)生的清除體內(nèi)病毒和改善臨床癥狀的作用；阻斷因乙型肝炎病毒感染所造成的肝臟纖維化和硬化；阻斷乙肝病毒通過胎盤傳染給胎兒；阻斷乙肝病毒通過乳汁傳染給母乳喂養(yǎng)的新生兒。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1是表位肽的質(zhì)譜圖，
圖2是九肽中各位點氨基酸殘基結(jié)合八2分子優(yōu)先順序，
圖3是九肽中與結(jié)合或不結(jié)合有關(guān)的氨基酸殘基，
圖4是多項式系數(shù)表八2),
圖5是患者數(shù)據(jù)表，
圖6是患者數(shù)據(jù)表，
圖7是慢性乙肝患者單核細(xì)胞的表型，
圖8是培養(yǎng)天數(shù)，
圖9是肽沖擊后樹突狀細(xì)胞形態(tài)的改變(八-10，6為陰性對照，
圖10是患者治療效果表，
圖11是治療48周血漿耶乂 0嫩的水平，
圖12是治療48周血漿八II的水平。

【具體實施方式】
[0010]本發(fā)明所述的基于IX:細(xì)胞的乙肝病毒了表位肽，其氨基酸序列為:亂冊1X111，分子量為1150。
[0011]表位肽采用標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行合成，經(jīng)純化后，其純度大于98%，參見圖1，質(zhì)譜分析并證實其分子量符合理論值。
[0012]本發(fā)明基于IX:細(xì)胞的乙肝病毒I表位肽的合成方法為:
一、表位肽的設(shè)計和篩選
1、乙型肝炎病毒抗原
乙型病毒抗原的核心抗原為乙肝病毒在體內(nèi)引起反應(yīng)的主要抗原，核苷酸序列為639恥，編碼蛋白為 212 氨基酸，
8081^2800.0611613811^^1)0448622]；來源于中國人群 861101:7？6 8,血清學(xué)分型―舊。.2、同源性分析
將該212個氨基酸與從:81數(shù)據(jù)庫中的蛋白片段進(jìn)行81%七，以確定該段蛋白質(zhì)的特異性。
[0013]3、耶乂核心抗原的一般特性預(yù)測
應(yīng)用軟件〔IX ？^01:6111 101-^136110113版本和31即511 ？3? 0軟件對耶乂核心抗原的編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，包括疏水性、親水性、抗原
性、跨膜結(jié)構(gòu)域、等電點及信號肽潛在切割位點。
[0014]4、利用3冊?￡11?進(jìn)行表位初步預(yù)測
5、？即02？？方案預(yù)測
6、基序法
(1)不同的冊扣1類對所結(jié)合的肽的組成有不同的要求，但其中起主要作用進(jìn)而對肽鏈與冊扣1類分子的結(jié)合有重要影響的是肽鏈的兩個主要錨點殘基，他們在多肽與冊扣1類分子的高親和力結(jié)合中是必需的。對于八2，九肽的兩個錨點分別位于肽鏈的第2位氨基酸殘基和羧基末端(第9位氨基酸殘基):且第2位氨基酸殘基應(yīng)是亮氨酸(1)或蛋氨酸(1),第9位氨基酸殘基應(yīng)是纈氨酸…)、異亮胺酸(1)或匕參見圖2，符合這些條件的多肽與八-八2限制性表位的可能性較大。
[0015](2) 二級錨點殘基的作用除了兩個主要錨點殘基的必需因素外，多肽鏈中的其他氨基酸殘基對多肽與八2分子的高或中等親和力結(jié)合也有不可忽視的影響。參見圖3，在九肽其他位置上，不同氨基酸殘基對多肽與八2分子的結(jié)合有著不同的影響，有的氨基酸殘基有利于結(jié)合，而有的則不利于結(jié)合。理想的與八2結(jié)合的表位(即有高的或中等親和力)應(yīng)不包含不利于結(jié)合的氨基酸殘基，或有利于結(jié)合的殘基多于不利于結(jié)合的殘基。
[0016]7、多項式方案預(yù)測表位肽
多項式方案是指當(dāng)某殘基8出現(xiàn)在某肽的第I位時，不考慮其他肽序列的情況下，該殘基對于整個肽與冊扣1類分子的結(jié)合自由能提供了一常量虹，用在第I位為殘基I？的大量多肽的1匕。的負(fù)1000值的平均值來估計此常量。1匕。被定義為待測肽將對照肽復(fù)合物中50%的對照肽置換下來的濃度。20種氨基酸殘基分別在1-9位的值列于圖4給定某一九肽，將其所有氨基酸殘基對應(yīng)的虹值相加，選擇分值大于選定閾值的抗原肽為可能的后選肽。參見圖4，本發(fā)明選擇22。
[0017]二、表位肽的鑒定、修飾及合成
從軟件預(yù)測的5條表位肽中尋找到具有較高的抗原結(jié)合性能，并將其用8細(xì)胞表位，1?表位和棕櫚酰基團(tuán)修飾，？11100方案合成，為進(jìn)一步探討外源性小分子表位肽進(jìn)入細(xì)胞激發(fā)冊扣1類反應(yīng)奠定基礎(chǔ)。多肽的固相化學(xué)合成主要有兩種策略:8%固相合成策略和固相合成策略。在80(3法中氨基酸的0-氨基的保護(hù)基團(tuán)選擇弱酸敏感基團(tuán)，側(cè)鏈活性基團(tuán)的保護(hù)基團(tuán)選用強(qiáng)酸敏感基團(tuán)。1?%法中氨基酸的0 -氨基的保護(hù)基團(tuán)選擇弱堿敏感基團(tuán)，側(cè)鏈活性基的保護(hù)基團(tuán)選用弱酸敏感基團(tuán)。
[0018]1、抗原肽的法固相合成與標(biāo)記(按照抗原肽的序列從羧端向氨端依次合成
[0019]( 1)第一個氨基酸與樹脂的連接:將2-01101*01:1*11:71 01101*1(16 068111樹脂1邑置于干燥潔凈的肽合成柱中，加入811110(1[，溶脹5111111，真空吸棄溶劑。分別取2 11111101 [1110(3氨基酸和5 11111101 01私，溶于8 1111 001，并加入于樹脂中，室溫輕輕搖動反應(yīng)60 1111110真空吸棄溶劑。用 10 1111 0肥洗滌樹脂 2 次，每次 2 111111。加入 10 1111 001/16011/1)1^(80:15:5),輕輕搖動反應(yīng)10111111，真空吸棄溶劑。重復(fù)一次。用10 1111 01？洗漆樹脂3次，每次2 1111110真空吸棄溶劑，隊吹干。
[0020](2)第一個氨基酸與樹脂的偶聯(lián)率測定:精確稱取21118干燥的氨基酸-樹脂置于比色杯中，加入31111 20%哌啶丨0即，輕輕搖動反應(yīng)10111111，用20%哌啶丨0即作為空白對照調(diào)零，紫外分光光度計測定樣品的290=0光吸收值。重復(fù)測定2次，取平均值。偶聯(lián)率通過以下公式計算:
偶聯(lián)率(臟01/8)=(八138樣品)丨(樣品重量呢父1.75)......公式(1)
(3)1?%基團(tuán)的脫保護(hù):向樹脂中加入10 01脫保護(hù)(02811)00試劑(25%哌啶/0110，混勻，室溫輕輕搖動反應(yīng)5 棄溶劑，用10 111101？洗滌樹脂3次，每次2 ―!!。用6 1111異丙醇洗漆樹脂3次，每次5 1111110用6 1111己燒洗漆樹脂3次，每次5 111111。真空吸棄溶劑。取少量樹脂樣品，用茚三酮顯色法0^1861'法)快速測定樹脂上的游離氨基含量:將樹脂2 1111用乙醇洗滌3次，分別加入2滴5%茚三酮、80%苯酚和1(⑶(2…0.00111(^:981111哌唳),充分混勻，1201加熱6 111111,判斷基團(tuán)的去保護(hù)反應(yīng)程度。
[0021](4)第二個氨基酸的偶聯(lián)反應(yīng):第二個氨基酸的連接采用原位活化法，取2 11111101的氨基酸、4.011111101的18111和4.011111101的11081,加入最少量的01？溶解后加入5 11111101的01私，充分混勻后，加于脫基團(tuán)的樹脂中。室溫輕輕搖動反應(yīng)60 1111110真空吸棄溶齊0。用5 1111甲醇洗滌樹脂3次，每次5 111111。用10 1111 01？洗滌樹脂3次，每次2 111111。真空吸棄溶劑。取少量樹脂樣品進(jìn)行茚三酮顯色分析。測定偶聯(lián)率。
[0022](5)肽鏈的延伸反應(yīng):用10…02811)0(試劑脫去上一個氨基酸~端的1?%保護(hù)基團(tuán)，10 “ 01？洗滌樹脂3次，真空吸棄溶劑。取少量樹脂樣品進(jìn)行茚三酮顯色分析。按照(3)方法偶聯(lián)下一個氨基酸。重復(fù)進(jìn)行1?%保護(hù)基團(tuán)脫保護(hù)和氨基酸偶聯(lián)反應(yīng)，直至偶聯(lián)得到所需多肽鏈。
[0023](6)肽鏈的側(cè)鏈去保護(hù)及從樹脂上的切割:將已合成好全部氨基酸序列的樹脂，用10 1111 0班^洗滌后再用6 1111異丙醇洗滌樹脂3次，每次5 111111。用6 “己烷洗滌樹脂3次，每次5 111111。真空吸棄溶劑后隊吹干，放入裂解容器中。18樹脂加入25 1111切割試劑(界八:硫代苯甲醚:水:苯酚:201=82.5:5:5:5:2.5 乂八)，室溫切割反應(yīng)2卜，不時搖動混勻，反應(yīng)后的混合液經(jīng)玻璃濾器過濾樹脂，收集切割反應(yīng)混合液，用I洗滌樹脂3次。將反應(yīng)混合液轉(zhuǎn)移于一圓底燒瓶中，用等體積預(yù)冷的乙醚洗滌4次，收集沉淀。干燥后即得到合成抗原妝粗品。
[0024](7)合成抗原肽的脫鹽:將抗原肽粗品加蒸懼水溶解。稱取八11161*8112111^-25凝膠158，溶脹后裝柱，裝好后的柱子先用50“蒸餾水平衡，平衡好后，每次上樣3-5 “，用蒸餾水進(jìn)行洗脫，紫外分光光度儀檢測220 11111處紫外吸收，按峰收集抗原肽。
[0025](8) 純化抗原肽:使用冊1:61~8公司的冊1:61~84000制備型高效色譜儀分離純化抗原肽。色譜柱為徑向加壓色譜柱(25^100,15 ^111，0211^ ？狀018填料),洗脫系統(tǒng)為:八液:5%乙腈溶液(含0.10歷)；8液:95%乙腈溶液(含0.08%！^。手動進(jìn)樣，每次進(jìn)樣1 1111，流速4 1111/111111，線性梯度，45111111內(nèi)，8液從5%升到50%，然后5 111111內(nèi)升到95%8液做最后洗脫。220 11111處檢測紫外吸收，按峰收集組分，用于質(zhì)譜檢測。將分子量檢測正確的組分收集，真空凍干，成為需要的純品，備用。
[0026](9)質(zhì)譜鑒定抗原肽:采用激光解析質(zhì)譜鑒定抗原肽，數(shù)據(jù)分析軟件為62025八80^^1-6八.02.01，方法嚴(yán)格按照操作手冊進(jìn)行，檢測合成抗原肽的分子量。
[0027]2、表位肽的修飾
在丁細(xì)胞表位的化末端加上糖分子、脂肽或棕櫚酰基可以增加小分子肽在細(xì)胞膜上的定位、跨膜及穿透能力。而輔助性I細(xì)胞表位或8細(xì)胞表位有助于增強(qiáng)I細(xì)胞表位的生物學(xué)功能，為了尋找到最佳的I細(xì)胞表位通過外源性途徑引發(fā)反應(yīng)的能力，我們選擇了丁匕、8及棕櫚酰絲氨酸三種修飾基團(tuán)以協(xié)同、偶聯(lián)和-…柔性連接的多種方案進(jìn)行I細(xì)胞表位肽的修飾。
[0028]3、表位肽的合成
再次按照肽合成的步驟合成上述9條肽，合成肽為凍干粉，100^/條。合成抗原肽均經(jīng)純化(純度? 98%)，同時行質(zhì)譜測序。凍干多肽放置于-201保存。
[0029]三、治療慢性乙肝患者的效果
負(fù)載抗原的自體樹突狀細(xì)胞(抗原呈遞細(xì)胞)(八000已經(jīng)用于免疫治療。我們采用^008治療了 380例慢性乙肝患者，在治療48周后對每例患者的病毒學(xué)、生物化學(xué)指標(biāo)和血清學(xué)反應(yīng)進(jìn)行了評估，報告顯示:治療結(jié)束后46.36%的耶6八8陰性患者和3.13%的耶6八8陽性患者耶乂- 0嫩定量檢測結(jié)果為陰性；耶6仏陰性患者$=0.007)和耶6仏陽性患者$=0.003)谷丙轉(zhuǎn)氨酶全轉(zhuǎn)為正常。結(jié)果提示40(:疫苗對慢性乙肝患者免疫功能的重建，病毒學(xué)、生化及血清學(xué)指標(biāo)的改善是極有效的。
[0030]1、患者情況
本發(fā)明中的380例患者，其中185例！186^陽性，195例！陰性，沒有人在本發(fā)明之前6個月進(jìn)行抗病毒或免疫調(diào)節(jié)藥物治療?；颊邤?shù)據(jù)見圖5和圖6。
[0031]參見圖6，有185例耶6^陽性，195例耶6^陰性的患者。185例耶6^陽性的患者:其中 160 例哪-0嫩彡 1000 00^163/1111 (73 例八[丁彡 40 I口，87 例八 11X40 1^),20 例冊乂-0嫩〈1000 001)168/1111(22^^13 40 113^^1X40 I口兄 195 例冊6^ 陰性的患者:其中其中110例冊乂-0嫩彡1000 00^163/1111 (43例釓I彡40 I口，67例釓1X40 1^),85 例冊7-0嫩〈1000 00^163/1111 (55^^13 40 I口，28 例釓 1X40 I口兄
[0032]2、0)14+的選擇和IX:的增殖
參見圖7，采用白細(xì)胞分離法分離出患者外周血單核細(xì)胞，0)14+細(xì)胞選擇的純度達(dá)到93% (91 - 95%的范圍)(圖幾1 - 63).在經(jīng)過和幾-4處理后，細(xì)胞變成明顯的樹突狀，在第10天，大部分細(xì)胞表達(dá)輔刺激分子標(biāo)記⑶86、⑶40、⑶80和分子(圖7，4 - ￠5)。參見圖8，對新鮮的IX:細(xì)胞和解凍的未成熟細(xì)胞進(jìn)行檢測，標(biāo)志物的表達(dá)差異不顯著。輔刺激分子標(biāo)記⑶86、⑶40、⑶80和-1的水平在10天內(nèi)均增加了，但是，所有的分子標(biāo)記物的水平在第11天，即用肽沖擊過后的12小時內(nèi)快速降低。
[0033]培養(yǎng)天數(shù)
參見圖8，第十一天，陰性質(zhì)控保持低值。在第9天，細(xì)胞變形，分子標(biāo)記⑶14快速減少，其它的分子標(biāo)記如4040，⑶80，⑶86，^-1,在前9天處于增加狀態(tài)，但是在第10天，第11天肽沖擊過后開始減少。
[0034]參見圖8，我們用？1扣對肽標(biāo)記，進(jìn)行細(xì)胞定位，采用共聚焦顯微法以確定IX:細(xì)胞對耶卩肽吸收情況。分析顯示:30分鐘內(nèi)肽就會被IX:細(xì)胞吸收。最初，在細(xì)胞體會看到熒光，細(xì)胞核看不到熒光；2小時后，肽會經(jīng)由胞體擴(kuò)散到樹突；12小時后，在樹突和胞體檢測到熒光會逐漸消退。在細(xì)胞核沒有觀察到熒光。
[0035]參見圖9，肽沖擊后樹突狀細(xì)胞形態(tài)的改變(八4)4為陰性對照。八4分別為用肽沖擊30分鐘，1小時，2小時，4小時，6小時和12小時樹突狀細(xì)胞形態(tài)的改變。
[0036]3、血清學(xué)反應(yīng)
185例耶6仏陽性的患者中，在治療24周時，22.16^(41/185)例耶6^轉(zhuǎn)陰，16.2196(30/185)發(fā)生了血清學(xué)轉(zhuǎn)換(產(chǎn)生！186仙)；治療48周時，29.73^(55/185)例勝仏轉(zhuǎn)陰，21.6296(40/185)發(fā)生了血清學(xué)轉(zhuǎn)換(產(chǎn)生！186汕兄
[0037]195例耶6^陰性的患者中，在治療24周時，8.21^(16/195)例耶8^轉(zhuǎn)陰，耶8?血清學(xué)轉(zhuǎn)化率(088^轉(zhuǎn)陰或出現(xiàn)冊8汕)為1.030/0(2/195)；治療48周時，10.26^(20/195)例耶8^轉(zhuǎn)陰，耶8八8血清學(xué)轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)陰或出現(xiàn)冊8汕)為2.5696(5/195) (1^162)。
[0038]4、病毒學(xué)反應(yīng)
耶6^陽性的患者，在治療24周時，實時熒光定量？⑶檢測1187-0嫩水平平均下降0.62108 001)168/1111,8.13^(13/160)的患者耶乂-0嫩未被檢出，但這些患者治療前耶乂-0嫩均為陰性；在治療48周時，1187-0嫩水平平均下降0.88 108 00^168/1111,3.13^(5/160)的患者！187-0嫩未被檢出。在治療24周時，2096(32/160)的患者耶7-0嫩水平下降了 21000，在治療48周時，44.3896(71/160)的患者耶7-0嫩水平下降了 2 1000。
[0039]參見圖11，耶6^陰性的患者，在治療24周時，耶7-0嫩水平下降了 3.24 108001)168/1111,64.55^(71/110)的患者耶7-0嫩未被檢出；在治療48周時，耶7-0嫩水平下降了 3.24 108 001)168/1111,50^(55/110)的患者冊乂-0嫩未被檢出。由此顯示:冊6^陰性的患者比耶6仏陽性的患者1187-0嫩水平下降的更大更迅速。
[0040]治療的周數(shù)
參見圖11，治療48周血漿0嫩的水平。檢測下限為1000(301)168/1111。
[0041]生化指標(biāo)的轉(zhuǎn)化
參見圖12，本發(fā)明中195例八II水平高于40幾/111[患者，在治療48周時，92例患者(50.26%)其八[丁恢復(fù)正常；185例八[丁水平低于40 I麻患者，在治療8周時，有7例高于正常值，之后12周沒有經(jīng)過任何治療，其八⑶水平又恢復(fù)正常。在治療期間，195例患者中有33例(16.92%)^正常的患者從I出現(xiàn)一過性升高，至治療結(jié)束又恢復(fù)正常。
[0042]參見圖10，在治療48周后，耶6仏陰性患者$=0.007)和耶6仏陽性患者(^=0.003)^11趨于正常，療效顯著，有69%耶6八8陰性患者從！'恢復(fù)正常，30.5%耶6八8陽性患者八口恢復(fù)正常。
[0043]治療的周數(shù)
參見圖12，通過48周的治療，血漿從I的水平。檢測最低下限為40 I口/1。
[0044]聯(lián)合反應(yīng)
在治療48周時，185例！186八8陽性患者中有25例(13.51%)達(dá)到完全反應(yīng)(00:087-0嫩呈陰性，從I正常，冊6?出現(xiàn)血清學(xué)轉(zhuǎn)化。135例(72.97%)患者達(dá)到部分反應(yīng)尺):耶乂-0嫩呈陰性，從I正常，！186^未出現(xiàn)血清學(xué)轉(zhuǎn)化。25例(13.51%)患者無應(yīng)答(沒有達(dá)到以上標(biāo)準(zhǔn)此外，76例(47.51%)患者出現(xiàn)了病毒學(xué)應(yīng)答，55例(29.73%)出現(xiàn)！186?血清學(xué)轉(zhuǎn)化，29例(30.5%)出現(xiàn)生化應(yīng)答。
[0045]參見圖10，195例勝仏陰性的患者，105例(53.85%)出現(xiàn)⑶，53例(27.18%)出現(xiàn)？8，37例(18.97%)無應(yīng)答。此外，37例(18.97%)患者出現(xiàn)病毒學(xué)應(yīng)答，20例(10.26%)患者出現(xiàn)耶血清學(xué)轉(zhuǎn)化，69例(69%)出現(xiàn)生化應(yīng)答，。
[0046]380例患者中有110例是首次治療(其中:85例耶6^陰性，25例耶6^陽性),270例患者以前接受過別的治療(其中:115例耶6^陰性，155例耶6^陽性
[0047]耐藥性分析
患者在治療48周時進(jìn)行基因突變分析，發(fā)現(xiàn)沒有新的點突變發(fā)生。
[0048]安全性、副作用和藥物不良反應(yīng)
對所有登記的患者監(jiān)護(hù)期間沒有發(fā)現(xiàn)任何的過敏現(xiàn)象，沒有觀察到皮疹或呼吸困難，10例患者出現(xiàn)低燒，但都能在24小時內(nèi)自愈。
[0049]統(tǒng)計分析顯示:耶6八8陽性的患者在IX:疫苗治療期間病毒的清除在統(tǒng)計學(xué)上不顯著$=0.273),1186?陰性的患者統(tǒng)計學(xué)上療效顯著$=0.001)。耶6仏陰性的患者耶乂-0嫩水平下降了 3.24 108 001)168/1111(病毒指數(shù)快速下降，而!186八8陽性的患者!187-0嫩僅僅下降了 0.88 108 001)168/1111)0對于耶6^陰性的患者，在治療24周后，48周時，耶乂-0嫩的陰轉(zhuǎn)率達(dá)50% ；而耶一^陰性的患者在采用I剛-^治療6個月時，！187-0嫩的陰轉(zhuǎn)率為37%，而這樣的陰轉(zhuǎn)率的維持僅為24% ；采用阿德福韋酯治療1年后，1187-0嫩的陰轉(zhuǎn)率為28%。陳等報道，耶6八8陽性的患者，在治療前后，耶7-0嫩下降1.771^2.39。叩168。與目前的藥物治療相比，IX:疫苗在降病毒載量更快速、穩(wěn)定和持久。雖然！18^8陽性和陰性的患者病毒清除率有所不同，但是，00疫苗會觸發(fā)一種強(qiáng)大的⑶8+(:11陽性和陰性的患者
陽性的患者，體內(nèi)病毒的復(fù)制會影響IX:疫苗清除病毒的效果，呈現(xiàn)低反應(yīng)狀態(tài)。因此，為了增強(qiáng)％疫苗治療的效果，！186^陽性的患者最好結(jié)合其他的抗病毒藥物治療。本發(fā)明中冊6?陰性的患者，其中58例0嫩〉104⑶？168?匕52例0嫩在103 - 104 00^163/1111,剩余的85例0嫩〈103?匕所有0嫩〈103?1上88?陰性或者有耶8汕的患者都屬于的“免疫控制”狀態(tài)。20例1^-0嫩〈1000/此的耶6^陰性或耶6仙陰性的患者有20%出現(xiàn)抗體。55 例冊6八8 陰性或冊6汕陽性冊乂-0嫩 ?1000 001)168 /4^^^,^ 45.459()(15/55)出現(xiàn)了生化應(yīng)答，45.4596(15/55)有病毒學(xué)應(yīng)答，27.2796(9/55)出現(xiàn)完全應(yīng)答。
[0050]耶6^血清學(xué)轉(zhuǎn)化是抑制耶乂復(fù)制的一個重要指標(biāo)。本發(fā)明中的380例患者，在治療48周后，耶6八8的消失和發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)化率的比例分別為29.73% (55/185)和
21.6296(40/185)，有10例患者耶一^消失耶一汕出現(xiàn)。采用IX:疫苗治療，?。?6^的轉(zhuǎn)化率高于其他藥物治療:1剛1 (25%).拉米夫定(16%)和阿德福韋酯(12%)。耶6仏陰性的患者耶8八8的轉(zhuǎn)陰率為10.2696(20/195)，而I剛-0治療僅為7.8%。耶8八8的血清轉(zhuǎn)化消失，出現(xiàn))為2.5696(5/195)。以上數(shù)據(jù)提示:經(jīng)過特定的活化肽刺激的IX:疫苗可以通過激發(fā)⑶4+的I細(xì)胞活化患者的體液免疫、重建機(jī)體免疫功能。
[0051]對于耶6仏陰性的患者，本發(fā)明有一重大突破。我們對195例耶6^陰性的患者進(jìn)行評估，在48周研究結(jié)束后臨床療效顯著$=0.001^我們資料表明:基于靶向性自體細(xì)胞疫苗對于耶6^陰性的患者療效顯著。我們采用流式細(xì)胞術(shù)評估了 28例耶6仏陽性患者的⑶3+,0)4+,和0)8+的水平(這些患者的冊7-0嫩水平均在105-108 001)168/1111，八[丁水平在80-2001^1 ),在經(jīng)過2個月的IX:疫苗治療之后，⑶8+細(xì)胞的數(shù)量至少增加了10%，差異顯著(戶⑶.05)，003+和004+細(xì)胞差異不顯著(^)0.05)。
【權(quán)利要求】
1.一種基于DC細(xì)胞的乙肝病毒T表位肽，其特征在于:所述基于DC細(xì)胞的乙肝病毒T表位肽由9個氨基酸殘基組成，其氨基酸序列為:QLFHLCLII。
【文檔編號】A61P31/20GK104387447SQ201410586328
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2011年3月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月25日
【發(fā)明者】羅進(jìn), 閆小君 申請人:江蘇安泰生物技術(shù)有限公司