慢性乙型和丁型肝炎病毒肝細胞受體編碼基因slc10a1的新突變蛋白、編碼基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種乙肝病毒和丁肝病毒肝細胞受體的編碼基因 SLC10A1 的突變株、突變蛋白及其在乙肝病毒和丁肝病毒感染及相關肝衰竭中的預防或治療上的應用。 SLC10A1 基因的突變蛋白是在SLC10A1蛋白的氨基酸序列的第267位由絲氨酸突變?yōu)楸奖彼?。根?jù)該突變蛋白及其編碼基因，可以建立基于 SLC10A1 基因及其突變體的診斷試劑盒。而且由于這一變異阻礙乙肝病毒或丁肝病毒進入肝細胞，故有產(chǎn)生預防及治療乙肝或丁肝的相應新藥物的應用前景，本研究也提示 SLC10A1 基因的其它突變也可能有預防和治療乙肝和丁肝的應用前景。
【專利說明】慢性乙型和丁型肝炎病毒肝細胞受體編碼基因SLC10A1的 新突變蛋白、編碼基因及其應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程以及醫(yī)學【技術領域】，具體涉及到一種慢性乙型和丁型肝炎病 毒肝細胞受體編碼基因51^7似7的新突變蛋白、編碼基因及其應用。

【背景技術】
[0002] 慢性乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV)感染而引起的以肝臟損害為主要表 現(xiàn)的傳染性疾病，是關系到我國乃至全球公共衛(wèi)生的重大疾病。乙肝病毒通過乙肝病毒肝 細胞受體進入肝細胞從而引發(fā)感染，因此該受體發(fā)生變異會干擾乙肝病毒與其發(fā)生結(jié)合， 從而阻止乙肝病毒進入肝細胞。而且丁肝病毒和乙肝病毒共用同一肝細胞受體，因此慢性 乙型肝炎病毒肝細胞受體變異也有阻止丁肝病毒進入肝細胞的作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供慢性乙型和丁型肝炎病毒肝細胞受體編碼基因5ZC7似2的 突變株及其突變蛋白在乙肝、丁肝及相關肝衰竭的預防和治療上的應用。
[0004]本發(fā)明要求保護的內(nèi)容是以慢性乙型和丁型肝炎病毒肝細胞受體的編碼基因 5ZC7似7的突變基因及其編碼的突變蛋白作為研究基礎，在乙型病毒性肝炎及丁型病毒性 肝炎及其相關肝衰竭的預防和治療的應用中產(chǎn)生的任何新藥物和新方法 一種慢性乙型和丁型肝炎病毒肝細胞受體的編碼基因5167似7的突變蛋白，是在慢性 乙型和丁型肝炎病毒肝細胞受體的編碼基因5ZC7似7蛋白的氨基酸序列的第267位由絲氨 酸突變?yōu)楸奖彼幔景l(fā)明中用P.Ser267Phe表示。所述慢性乙型及丁型肝炎病毒肝細胞 受體的編碼基因5ZC7似i的突變蛋白，氨基酸序列如SEQIDNO: 1所示。
[0005] 上述慢性乙型和丁型肝炎病毒肝細胞受體的編碼基因5ZC7似2的突變蛋白的編 碼基因，該編碼基因的核苷酸序列如SEQIDN0:2所示。
[0006]慢性乙型和丁型肝炎病毒肝細胞受體的編碼基因5ZC7似2的突變蛋白在制備慢 性乙型病毒性肝炎的檢測試劑中的應用。
[0007]慢性乙型和丁型肝炎病毒肝細胞受體的編碼基因5ZC7似2的突變蛋白的編碼基 因在制備慢性乙型病毒性肝炎的檢測試劑中的應用。
[0008] 由慢性乙型和丁型肝炎病毒肝細胞受體的編碼基因5ZC7似2的突變蛋白及突變 蛋白的編碼基因制備慢性乙型病毒性肝炎的檢測試劑方案如下所示： 一種慢性乙型或丁型病毒性肝炎檢測試劑盒，由以下成分組成：引物（引物核苷酸序列 如SEQIDN0:3和SEQIDN0:4所示)，PCR反應液，PCR產(chǎn)物純化盒和測序反應液。所述PCR 反應液為溶解了TagDNA聚合酶、dNTPs、鎂離子(如MgCl2)、PCR反應緩沖液(如lOXTaq Buffer)。以上試劑均可直接購買相應商品，如（10mM)dNTPs購自上海生工生物工程技術 服務有限公司；TagDNA聚合酶及其配套的lOXTaq1?1^€61'、]\%(]12購自？61'11161^38公司。 各試劑的用量及濃度均為本領域常規(guī)值，如lu/yLTagDNA聚合酶1yL、2mmol/L的dNTP (即濃度均為 2mmol/L的4 種dNTP的混合物)3iiL、25mmol/LMgCl23iiUlOXTaqBuffer(內(nèi)含（順4)2504)31^、滅菌(1(11120 17111。
[0009] 所述PCR產(chǎn)物純化盒為純化PCR產(chǎn)物的溶液和DNA吸附柱Labell; 所述純化PCR產(chǎn)物的溶液為：lu/iiL奸堿性磷酸酶（SAP,可購于Fermentas公 司）0.61^、2〇11/111^外切酶（￡1〇1，可購于？61'11161^38公司）0.15111^和滅菌(1(11120 1. 25-1. 75yL，或按上述比例配制的其他體積的混合液。純化PCR產(chǎn)物的溶液優(yōu)選 2~2, 5uL〇
[0010] 所述測序反應液為BigDye(購自ABI公司）和5XSequencebuffer(購自ABI 公司）的混合液，BigDye和5XSequencebuffer的體積比優(yōu)選為1:2,如liiLBigDye與 2iiL5XSeqUenCebuffer混合。上述慢性乙型病毒性肝炎檢測試劑盒，優(yōu)選的引物核苷酸 序列如SEQIDN0:3和SEQID勵:4所示，引物濃度都為3.211111〇1/1。
[0011] 本發(fā)明是通過對"相對極端性狀的"99例慢性乙肝患者及90例未注射過乙肝疫 苗正常對照進行全外顯子組測序，通過生物信息學分析及進一步的數(shù)據(jù)篩選找到最有可能 的候選基因；然后在對所找到的候選基因進行大樣本量的病例-對照(其中慢性乙肝患者 1899例，未注射乙肝疫苗正常對照1828例)相關關系研究中證實慢性乙型肝炎病毒肝細胞 受體的編碼基因51^7似7的突變p.Ser267Phe及其編碼的突變蛋白有抵抗慢性乙型病毒性 肝炎及肝衰竭的作用。同時，我們對突變蛋白的的結(jié)構(gòu)分析也證實這一突變干擾乙肝病毒 與其肝細胞受體的結(jié)合，從而有阻止乙肝病毒進入肝細胞的作用。
[0012] 本發(fā)明的人5ZC7似2基因核苷酸全長序列(包含突變位點)通常是用聚合酶鏈式反 應（PCR)進行。對于PCR擴增法，可根據(jù)5ZC7似7基因的核苷酸序列，進行引物設計，并以 所檢測的患慢性乙型肝炎患者抽提的DNA作為模板，擴增目的序列。最后通過測序反應檢 測及確定相關基因的突變。
[0013] 與現(xiàn)有研究相比，本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明首次在臨床病例中證實51^7似7變異株及其編碼的突變蛋白有抵抗慢性乙型 病毒性肝炎及相關肝衰竭的作用。由于這一變異妨礙乙肝病毒進入肝細胞，故有產(chǎn)生預防 及治療乙肝的相應新藥物新方法的應用前景，且由于乙肝病毒及丁肝病毒共用同一肝細 胞受體，故這一發(fā)現(xiàn)同樣也適用于丁肝病毒感染的預防及治療藥物及其它療法的開發(fā)及應 用。本研究也提示51^7似7基因的其它突變也可能有預防和治療乙肝和丁肝的應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1為5ZC7似2基因的部分測序結(jié)果，其中上部為5ZC7似7野生型的測序結(jié)果，中 部為5ZC7似7p.Ser267Phe雜合性突變的測序結(jié)果，下部為5ZC7似7p.Ser267Phe純合性突 變的測序結(jié)果；箭頭所示為突變位點。
[0015] 圖2為5ZC7似7p.Ser267Phe突變型蛋白整體的結(jié)構(gòu)模擬圖。

【具體實施方式】
[0016] 以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明 做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設備為本【技術領域】常規(guī)試 齊U、方法和設備。
[0017] 除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。
[0018] 實施例1 一、病例收集：來自中山大學附屬第三醫(yī)院傳染科的1899例慢性乙型肝炎患者和來自 中山大學附屬第二醫(yī)院的1828例未注射乙肝疫苗或自報疫苗注射史不明的健康自愿者， 在取得上述患者、自愿者及家屬知情同意后，取外周血于EDTA抗凝管中備用。用Qiagen 公司生產(chǎn)的QIAamp DNABlood Mini Kits(試劑盒)從抗凝外周血中提取DNA(具體提取步 驟參考產(chǎn)品說明書)，TE溶解，-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0019] 二、5ZC7似2基因的突變檢測： 5ZC7似7基因的mRNA序列來自Genbank(NM_003049)。Genomic DNA序列來自UCSC數(shù) 據(jù)庫（http: //genome, ucsc. edu/)和Ensembl數(shù)據(jù)庫（http: //asia. ensembl. org/index. html)。
[0020] 檢測步驟如下所示： 1、PCR擴增： ?〇?反應體積為301^:10父丁&9 811打61<內(nèi)含（順4)2504)3111，25111111〇1/1]\%(：123111，2臟〇1/1(1階13混合物3111，3.211111〇1/1上、下游引物各1111，111/1111&9〇嫩聚合酶 1 U L，實施例1提取的DNA模板1 y L，滅菌ddH20補足體積至30 y L。
[0021] PCR反應條件：95°C預變性3min;95°C30s，引物特異性退火溫度lmin，72°C 45s，36個循環(huán)；最后72°C延伸10min。
[0022] 檢測5ZC7似2基因突變位點的上游引物P1和下游引物P2序列為： P1 :5' - CCATCTGCTGCGAAACTC -3'； P2 :5' -GGGCTACCTGGTTCTTAGTGA -3'； 2、 測序反應方案： ①預反應：反應體積共3iiL:lu/iiL蝦堿性磷酸酶（SAP)0.6iiL、20u/iiL外切酶 (￡叉〇1)0.1(?61'11161^38公司）、？0?產(chǎn)物0.5-1.〇11]^、滅菌(1(11120補足體積至311]^。反應 混合物在PCR儀上反應，37°C溫浴15min，85°C15min滅活酶。反應完畢后反應混合物直 接作為測序反應的模板用。
[0023] ②測序反應：用ABI公司的96孔板，在GeneAmp9700PCR儀上進行。反應體積 共 10iiL:3iiL的預反應產(chǎn)物、2iiL的 5XSequencebuffer(ABI公司）、liiL的BigDye (八81公司）、11^的引物（3.211111〇1/1)，31^的滅菌(1(11120。反應條件 ：981：2111111;961： 10s，50°C5s，60°C4min，30 個循環(huán)；最后 4°C保存。
[0024] ③測序純化：直接在96孔板上進行。
[0025]a)測序反應完畢后，配無水乙醇6mL+3mol/L醋酸鈉（pH5. 2) 240 iiL混合溶液 (即無水乙醇：醋酸鈉體積比=25:1)，每個樣品中加入50 iiL混合溶液。用錫箔紙封閉，并 振蕩混勻。
[0026]b)將測序產(chǎn)物放于_20°C避光靜置20min以上。
[0027]c) 2CTC，3700rpm離心 30min。
[0028]d)倒去上清液，倒扣在四層吸水紙上，360rpm離心10s。
[0029] e)配75%乙醇(無水乙醇7.5mL+ddH20 2.5mL混合溶液的比例)，每個樣品中加 入90yL混合溶液。用錫箔紙封閉，并振蕩混勻。
[0030]f)將測序產(chǎn)物放于-20°c避光靜置20min以上。
[0031]g) 2CTC，3700rpm離心 30min。
[0032] h)倒去上清液，倒扣在四層吸水紙上，360rpm離心10s。
[0033] i)室溫通風處，避光晾干，30min以上。
[0034]j)每個樣品中加ddH2010iiL，用錫箔紙封閉，振蕩后離心。
[0035]k)待測樣品放于4°C避光靜置1.5h以上，以充分溶解，上ABI3730測序儀進行 測序。
[0036] 三、測序結(jié)果分析：用ABI序列分析軟件進行分析：發(fā)明人對自中山大學附屬第 三醫(yī)院傳染科的1899例慢性乙型肝炎患者和來自中山大學附屬第二醫(yī)院的1828例未注射 乙肝疫苗或自報疫苗注射史不明的健康自愿者進行51^7似7基因的突變檢測。
[0037] 結(jié)果如下：突變位點：5ZC7似2基因氨基酸序列的第267位由絲氨酸突變?yōu)楸奖?酸，也可表示為p.Ser267Phe，突變后的氨基酸序列如SEQIDN0:1所示。其中有149例患 者和348例正常對照存在雜合性突變。5例患者和26例正常對照存在純合性突變，在1899 例病例和1828例對照研究中，其風險等位基因的個數(shù)分別是159個和400個，優(yōu)勢比值（0R 值）為0. 36,P值為5. 7X1(T23。多基因遺傳病的研究中，通常是通過關聯(lián)分析來確定其風 險基因的，本實驗結(jié)果中，P值有非常顯著差異，且0R值為0.36,說明該突變基因有抵抗乙 型慢性病毒性肝炎和相關肝衰竭的作用。測序結(jié)果見圖1。
[0038] 實施例2 5ZC7似7p.Ser267Phe突變型蛋白結(jié)構(gòu)預測：用theprogramPyMol(http://pymol.org) >DiscoveryStudio3. 0(AccelrysInc.)、theprogramsMultAlin(CorpetF. Multiplesequencealignmentwithhierarchicalclustering.Nucleic.Acids. Res. 1988; 16，10881-10890)及ESPript軟件（GouetP,RobertX，CourcelleE. ESPript/ENDscript:Extractingandrenderingsequenceand3Dinformationfrom atomicstructuresofproteins.Nucleic.Acids.Res. 2003; 31，3320-3323)預測 5ZC7似7p.Ser267Phe突變型蛋白的結(jié)構(gòu)及功能域。
[0039] 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測結(jié)果見圖2。對5ZC7似7基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的預測，該 蛋白包括兩個結(jié)構(gòu)域：核心區(qū)和嵌板區(qū)，這兩個域之間的相對運動形成inward-open或 outward-open結(jié)構(gòu)。這表明核心結(jié)構(gòu)域的剛體旋轉(zhuǎn)可能促進膽汁酸的運送，在我們野生型 NTCP蛋白的outward-open結(jié)構(gòu)中，我們發(fā)現(xiàn)第267位氨基酸位于跨膜結(jié)構(gòu)域9b中（TM9b), 并特定位于配體遷移通路的表面。同時這個模型也表明，在NTCP蛋白中，267位氨基酸非常 靠近157-165氨基酸殘基所組成的乙肝病毒感染所必須的結(jié)構(gòu)域。此外，親水性的絲氨酸 突變?yōu)榱舜蟮氖杷缘谋奖彼岷?，可能會影響NTCP與配體的結(jié)合。
[0040] 實施例3 5ZC7似7基因突變檢測試劑盒的制備。
[0041] 一、試劑盒成分如表1所示。
[0042]表1

【權利要求】
1. 一種慢性乙型和丁型肝炎病毒肝細胞受體的編碼基因5ZC7似7的新突變蛋白，其特 征在于，在慢性乙型和丁型肝炎病毒肝細胞受體基因51^7似7蛋白的氨基酸序列第267位 由絲氨酸突變?yōu)楸奖彼?；所述慢性乙型和丁型肝炎病毒肝細胞受體的編碼基因51^7似7 的新突變蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2. 權利要求1所述慢性乙型和丁型肝炎病毒肝細胞受體的編碼基因5ZC7似2的新突變 蛋白的編碼基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3. 權利要求1所述慢性乙型和丁型肝炎病毒肝細胞受體的編碼基因5ZC7似2的新突變 蛋白在制備預防或/和治療乙型或丁型肝炎及其相關肝衰竭藥物中的應用。
4. 權利要求2所述慢性乙型和丁型肝炎病毒肝細胞受體的編碼基因5ZC7似7的新突變 蛋白的編碼基因在制備預防或/和治療乙型或丁型肝炎及其相關肝衰竭藥物中的應用。
5. 權利要求1所述慢性乙型和丁型肝炎病毒肝細胞受體的編碼基因5ZC7似2的新突變 蛋白在制備慢性乙型或丁型肝炎的檢測試劑中的應用。
6. 權利要求2所述慢性乙型和丁型肝炎病毒肝細胞受體的編碼基因5ZC7似7的新突變 蛋白的編碼基因在制備慢性乙型或丁型肝炎的檢測試劑中的應用。
7. -種慢性乙型或丁型病毒性肝炎檢測試劑盒，其特征在于，由以下成分組成：核苷 酸序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示的引物，PCR反應液，PCR產(chǎn)物純化盒和測序反 應液； 所述PCR反應液為溶解了 Tag DNA聚合酶、dNTPs、鎂離子的PCR反應緩沖液；所述PCR 產(chǎn)物純化盒由純化PCR產(chǎn)物的溶液和DNA吸附柱Labell組成，所述純化PCR產(chǎn)物的溶液 為lu/ y L蝦堿性磷酸酶、20u/ y L外切酶Exo I和滅菌ddH20的混合液；所述測序反應液為 BigDye 和 5XSequence buffer 的混合液。
8. 根據(jù)權利要求7所述慢性乙型或丁型病毒性肝炎檢測試劑盒，其特征在于，所述引 物的濃度分別為3.2iimol/L。
【文檔編號】A61K38/16GK104387457SQ201410586449
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月28日 優(yōu)先權日:2014年10月28日
【發(fā)明者】王一鳴, 高志良, 趙強, 彭亮, 胡彬, 王俊, 李奇斌, 廖啟軍 申請人:中山大學