神經(jīng)生長因子在制備治療脊髓損傷藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種神經(jīng)生長因子(NGF)在制備治療脊髓損傷的應用。NGF在制備治療脊髓損傷藥物中的應用，藥物的形式可以是粉針劑、水劑、脂質(zhì)體。NGF可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)引起的脊髓神經(jīng)元凋亡，從而對脊髓損傷產(chǎn)生治療作用。
【專利說明】神經(jīng)生長因子在制備治療脊髓損傷藥物中的應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種NGF的應用，尤其涉及NGF在制備治療脊髓損傷藥物中的應用，包 括各種因素導致的脊髓原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷的治療。

【背景技術】
[0002] 脊髓損傷（Spinal Cord Injury，SCI)是一種嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷，通?？蓪е聡?重的神經(jīng)功能障礙和殘疾，不僅影響患者個人生理及心理，而且對家庭及社會造成沉重的 負擔。世界上脊髓損傷癱瘓病人有上千萬，我國亦逾百萬，據(jù)統(tǒng)計美國每年新增1萬多傷病 員，我國僅北京地區(qū)脊髓損傷發(fā)生率約800人/年。已成為高發(fā)傷病之一。
[0003] 脊髓損傷可以分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。脊髓損傷發(fā)生后，其損傷臨近部位 的組織受損破壞，發(fā)生出血、壞死，為原發(fā)性損傷；隨后損傷區(qū)及臨近部分發(fā)生缺血、再灌注 損傷，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生氧自由基損害，細胞內(nèi)鈣離子超載，炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，興奮性神經(jīng)遞質(zhì) 損害，細胞凋亡等一系列病理生理過程，稱為繼發(fā)性損傷。繼發(fā)性損傷是一種細胞和分子水 平主動調(diào)節(jié)的過程，具有可逆性。繼發(fā)性損傷可加重原發(fā)性損傷，造成脊髓功能障礙，致使 機體全癱或部分癱瘓。如果能阻斷此連鎖反應中的某一環(huán)節(jié)，則可能明顯減輕繼發(fā)性損傷， 促進脊髓功能的恢復。而對原發(fā)性脊髓損傷的主要依靠外科手術，到目前為止尚無有效治 療發(fā)現(xiàn)，故對繼發(fā)性損傷進行藥物控制治療，有可能成為減輕脊髓損傷的有效途徑。
[0004] 研宄表明，脊髓損傷繼發(fā)性與神經(jīng)細胞凋亡有關，細胞凋亡又稱細胞程序性死亡， 是指細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命的過程。其受控于 一系列基因順序表達而發(fā)現(xiàn)的主動的耗能的自殺性死亡，是維持機體細胞種類和數(shù)量動態(tài) 平衡的重要機制，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。目前已知的三條主要信號轉(zhuǎn)導途徑來 控制細胞凋亡：1、線粒體通路；2、死亡受體通路；3、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路機制是近年來 發(fā)現(xiàn)的一條新的凋亡途徑，且很多動物實驗已被初步證明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路參與了脊髓損傷的繼 發(fā)性病理機制。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞中重要的細胞器，參與蛋白質(zhì)合成、折疊和寡聚化，還參 與脂類代謝、類固醇代謝的合成以及Ca 2+調(diào)節(jié)等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)非常敏感，葡萄糖營養(yǎng)素的缺乏、 蛋白質(zhì)糖基化的抑制、二硫鍵形成的障礙、蛋白質(zhì)運轉(zhuǎn)異常、Ca 2+耗竭等刺激均可導致內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)功能失調(diào)，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)不能正確折疊而被大量滯留， 導致未折疊蛋白反應，激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體、細胞核之間的信號轉(zhuǎn)導，抑制蛋白質(zhì)合成并 啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關基因轉(zhuǎn)錄，一定程度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應激能力，促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 功能恢復。但是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激持續(xù)存在或過強時將誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關性蛋白細胞凋亡，造成組 織損傷。脊髓損傷時，發(fā)生的缺血缺氧、酸中毒、ATP耗竭、媽超載以及大量自由基生成等均 可誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，從而使其在脊髓損傷發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。
[0005] 未折疊蛋白應答是一種對抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的自身保護機制，有利于細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn) 定。其由一個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78和3個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激感受蛋白所介導，分別是IRE-1、 ATF6、PERK。無內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時IRE-1、ATF6、I3ERK分別與分子伴侶GRP78結(jié)合，處于無活性 狀態(tài)。一旦內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，GRP78從3種跨U旲蛋白上解尚，轉(zhuǎn)而去結(jié)合未折萱蛋白。解尚后的 感受蛋白被活化并啟動為折疊蛋白應答，降低未折疊或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的積累， 通過IRE-1、ATF6、PERK三條信號途徑，恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能，是一個促生存相應。長時間 或過量的應激，會損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，這三條通路同時也能誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的細胞凋亡信號 通路，去除無功能細胞，其并非直接誘導凋亡，而是通過激活下游凋亡信號分子：Ca SpaSel2 和GADD153/CH0P是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激特異性的轉(zhuǎn)錄因子，在死亡受體和線粒體通路中不被活化。
[0006] 目前對于脊髓損傷治療，在臨床尚無特殊用藥，治療不是很理想。損傷早期多用糖 皮質(zhì)激素（地塞米松、甲基強的松龍等）來減輕炎癥反應。甲基強的松龍是目前應用最為 廣泛且公認最有效的治療脊髓損傷的藥物。大劑量應用甲基強的松龍可通過多種機制阻止 脊髓損傷繼發(fā)性損傷的發(fā)生，但是其在臨床應用中會導致病人出現(xiàn)過敏、休克，導致或加重 潰瘍、糖尿病等相關并發(fā)癥，為治療脊髓損傷增加了一定的風險，也引起了臨床醫(yī)生的擔憂 和警惕。故研發(fā)一種副作用少且有療效的脊髓損傷治療藥物已經(jīng)成為目前研宄的熱點和難 點。
[0007] 近來研宄表明，脊髓損傷后給予外源性生長因子可以促進神經(jīng)功能的恢復。神經(jīng) 營養(yǎng)因子還可與其他中和軸突生長抑制因子，共同起到促進軸突生長和補充的作用。
[0008] 自1953年意大利科學家Levi-montalcini發(fā)現(xiàn)NGF，至今已有60年歷史。神經(jīng) 生長因子（NGF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子中最早被發(fā)現(xiàn)且是目前研宄最為透徹的?，F(xiàn)在研宄最多的 NGF是從小鼠頒下腺中分離的分子量為140 000的糖蛋白。它包含α、β、γ三個亞單位， 活性區(qū)是β亞單位，由兩個118個氨基酸組成的單鏈通過非共價鍵結(jié)合而成的二聚體，與 人體NGF的結(jié)構(gòu)具有高度的同源性，生物效應也無明顯的種間特異性。NGF是具有神經(jīng)元 營養(yǎng)和促突起生長雙重生物學功能的一種神經(jīng)細胞生長調(diào)節(jié)因子，它對中樞及周圍神經(jīng) 元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的表達均具有重要的調(diào)控作用。作為神經(jīng)營養(yǎng)因子 最重要的當然是它的神經(jīng)營養(yǎng)作用，在胚胎發(fā)育的一定時期內(nèi)，NGF為效應神經(jīng)元生存所必 須。體外實驗證實，如果培養(yǎng)液中不加 NGF，神經(jīng)細胞即不能長出軸突，也不能存活。NGF及 其受體也廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，由海馬和腦皮質(zhì)產(chǎn)生的NGF可通過膽堿能神經(jīng)逆行運 輸至前腦基底核，維持膽堿能神經(jīng)元的存活和功能。在胚胎發(fā)育早期，中樞NGF的含量決定 膽堿能神經(jīng)的密度。在無膽堿能神經(jīng)支配的小腦區(qū)和下丘腦，NGF含量也較高，表明除膽堿 能神經(jīng)外，NGF對其他類神經(jīng)元也有營養(yǎng)作用。同時NGF還具有神經(jīng)保護作用當NGF的效 應神經(jīng)元受到損傷時，例如切斷軸突、藥物損害，甚至缺血、缺氧等，神經(jīng)元將發(fā)生一系列的 病理改變，包括死亡，實驗研宄證實NGF通過：（1)抑制毒性氨基酸的釋放；（2)抑制鈣離子 超載；（3)抑制超氧自由基的釋放；（4)抑制細胞凋亡等機制而明顯減輕或防止這些繼發(fā)性 病理損害的發(fā)生來保護神經(jīng)元細胞。NGF的第三個作用是促神經(jīng)生長作用，實驗證明，在切 斷軸突后給予NGF將減少某些神經(jīng)元的變性與死亡，無疑這將有助于提高軸突再生的可能 性。同時它還影響軸突再生開始的時間和參與再生的神經(jīng)元數(shù)目以及再生神經(jīng)的質(zhì)量和速 度。這些信息提示我們NGF在脊髓損傷的神經(jīng)保護和修復能有非常明顯的作用。除此之外， NGF在神經(jīng)系統(tǒng)以外，也發(fā)揮一定效應。NGF可以影響免疫細胞的活性，進而調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng) 功能。NGF還可以抑制某些腫瘤的有絲分裂，促其向良性分化。它甚至還能促進創(chuàng)口組織的 修復反應，促進創(chuàng)口愈合。如果能在脊髓損傷中亦有這些作用，可大大降低脊髓損傷后其他 并發(fā)癥的發(fā)生幾率，且能加快病人的術后恢復。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種NGF的應用，NGF應用于制備治療和預防各種原 因造成的原發(fā)性脊髓損傷或繼發(fā)性脊髓損傷。
[0010] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種NGF的應用，NGF對各種原因造成的原發(fā)性脊 髓損傷或繼發(fā)性脊髓損傷有明顯的治療和預防作用。
[0011] 為實現(xiàn)以上目的，一種NGF的應用，我們分別通過動物實驗和體外細胞實驗來證 明NGF確實通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激來減少脊髓神經(jīng)元細胞的凋亡從而對各種原因造成的原 發(fā)性脊髓損傷或繼發(fā)性脊髓損傷有明顯的治療和預防作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1各組脊髓損傷后運動功能評分。
[0013] 圖2各組脊髓損傷HE染色。
[0014] 圖3各組脊髓損傷免疫組化圖。
[0015] 圖4各組脊髓損傷神經(jīng)保護相關蛋白的表達。

【具體實施方式】
[0016] 以下描述用于揭露本發(fā)明以使本領域技術人員能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明。以下描述中的優(yōu) 選實施例只作為舉例，本領域技術人員可以想到其他顯而易見的變型。在以下描述中界定 的本發(fā)明的基本原理可以應用于其他實施方案、變形方案、改進方案、等同方案以及沒有背 離本發(fā)明的精神和范圍的其他技術方案。
[0017] 實施例INGF對實驗性擠壓致脊髓損傷大鼠的治療作用
[0018] 動物模型和分組：SD大鼠30只，體重220-250g，雌性。用以下方法制作脊髓損傷 大鼠模型：10%水合氯醛3.5ml/kg腹腔麻醉。俯臥固定大鼠四肢，作背部后正中切口。切 開皮膚以及皮下組織，顯露并咬除T9錐板和棘突。用15g動脈夾壓迫脊髓2min，麻醉清醒 后雙下肢呈現(xiàn)弛緩性癱瘓。術后7日給予注射用頭孢唑林50mg/kg腹腔注射每日2次，并 每日給予大鼠人工排泄大小便2次。將動物隨機分為3組（每組10只大鼠），假手術組： 只接受T9椎板切除手術，下肢行動正常；對照組：脊髓損傷后，不注射NGF溶液，只給予相 同劑量的生理鹽水；NGF治療組：在脊髓損傷30Min后注射用0. 9% NaCl稀釋的NGF20 μ g/ kg，之后保持20 μ g/kg/day的量，直到脊髓損傷有明顯恢復。
[0019] 檢測指標和結(jié)果：
[0020] BBB評分：根據(jù)BBB評分標準，分別于術后1，3, 7,14天進行評定，并遵循雙盲法觀 察原則，通過計分來評價動物雙后肢功能狀況。通過BBB評分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)皮下注射NGF治療 組后肢恢復情況比對照組明顯好轉(zhuǎn)。各組損傷大鼠 BBB評分結(jié)果見表1及圖1。HE染色： 分別于術后7天和14天處死大鼠取材，石蠟包埋，切片（5 μ m)，通過蘇木精-伊紅染色，于 鏡下觀察發(fā)現(xiàn)給予NGF后，大鼠脊髓組神經(jīng)細胞凋亡明顯少于對照組，見附圖2。免疫組化 學染色：分別于術后7天和14天處死大鼠取材，石蠟包埋，切片（5 μ m)，經(jīng)DAB顯色，發(fā)現(xiàn)給 予NGF后，大鼠脊髓損傷處神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞GRP78, CHOP和Caspase-12蛋白表達明 顯少于對照組，見附圖3。Western blot:于術后7天處死大鼠取材，用化學發(fā)光試劑盒曝 光、顯影、定影，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，NGF治療組GRP78, CHOP和Caspase-12表達明顯減少， 見附圖4 ;而神經(jīng)保護因子GAP-43表達明顯增加，見附圖4。
[0021] 表1各組脊髓損傷大鼠不同時間點BBB評分比較（X土s)
[0022]

【權(quán)利要求】
1. 一種NGF的應用，其特征在于，NGF在制備治療脊髓損傷藥物中的應用，包括各種因 素導致的脊髓原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷的治療。
【文檔編號】A61K38/18GK104436166SQ201410589321
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月22日
【發(fā)明者】張宏宇, 肖健, 鄔芬贊, 張超, 李校堃 申請人:溫州醫(yī)科大學