用于胰腺脫細(xì)胞支架的試劑盒、支架的制備及再種植方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于胰腺脫細(xì)胞支架的試劑盒、支架的制備及再種植方法，試劑盒包括灌注液1、灌注液2和灌注液3；其中灌注液1包括0.25g/LEDTA、10000U/L肝素鈉及PBS緩沖液；灌注液2包括1%Triton-X100和0.1%氨水；灌注液3包括0.01g/LDNaseⅠ。本發(fā)明劑盒費(fèi)用低、細(xì)胞脫除徹底、易于去除洗滌劑、細(xì)胞外基質(zhì)及血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)保存完好，有利于外源及內(nèi)源性細(xì)胞的再種植和生長，并方便移植到糖尿病實(shí)驗(yàn)動物。
【專利說明】用于胰腺脫細(xì)胞支架的試劑盒、支架的制備及再種植方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于胰腺脫細(xì)胞支架的試劑盒、支架的制備及再種植方法。

【背景技術(shù)】
[0002]糖尿病是由胰島素分泌缺陷或其生物作用受損，或兩者兼有引起的以高血糖為特征的代謝性疾病。通過調(diào)節(jié)飲食、體育鍛煉，口服降糖藥和外源性胰島素注射能夠在一定程度上降低糖尿病微血管和大血管病變及相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生率，然而并不能達(dá)到治愈的效果，高血糖相關(guān)的器官損害仍然是糖尿病病人死亡的首要原因。
[0003]β細(xì)胞具有分泌胰島素的功能，通過胰腺或者胰島細(xì)胞移植，是目前唯一能夠在I型糖尿病病人中起到長期穩(wěn)定控制血糖水平的治療方法。在目前，理想的可用于移植的胰腺或胰島的數(shù)量不足的條件下，制備可供移植的組織工程胰腺十分必要。胰腺組織工程是構(gòu)建可移植胰腺的一條創(chuàng)新性途徑，然而，由于缺乏合適的支架材料，通常所構(gòu)建的組織工程胰腺結(jié)構(gòu)簡單，血管網(wǎng)絡(luò)不夠完善而不能達(dá)到替代治療的目的。
[0004]去細(xì)胞胰腺支架作為一種天然的生物支架，不僅保留有細(xì)胞粘附、增殖所依賴的細(xì)胞外基質(zhì)成分，包括:蛋白質(zhì)、多糖、生長因子和細(xì)胞因子；而且保留有細(xì)胞高密度生長所需要的管道結(jié)構(gòu)，在移植到體內(nèi)后可以維持生理血壓，也可以使祖細(xì)胞分化為器官特異性表型。
[0005]然而，如何選擇合適的去細(xì)胞試劑，降低去細(xì)胞殘余洗滌劑對胰腺生物學(xué)特性的影響，獲得有利于細(xì)胞再種植的胰腺生物支架，是目前構(gòu)建可移植胰腺生物支架迫切需要解決的問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種制備胰腺去細(xì)胞生物支架的試劑盒、胰腺去細(xì)胞支架的制備及再種植獲得可移植胰腺支架的方法。所述試劑盒費(fèi)用低、細(xì)胞脫除徹底、易于去除洗滌劑、細(xì)胞外基質(zhì)及血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)保存完好，有利于外源及內(nèi)源性細(xì)胞的再種植和生長，并方便移植到糖尿病實(shí)驗(yàn)動物。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:
一種用于胰腺脫細(xì)胞支架的試劑盒，其特征是:包括灌注液1、灌注液2和灌注液3 ；其中灌注液I包括0.25 g/L EDTAU0000 U/L肝素鈉及PBS緩沖液；灌注液2包括1%Triton-X 100 和 0.1% 氨水；灌注液 3 包括 0.01 g/L DNase I ；
其中，灌注液I中PBS緩沖液的PH=7-8 ;灌注液2的溶劑為PH=7_8的雙蒸水；灌注液3的溶劑為PH=7-8的雙蒸水。
[0008]灌注液I的配制方法為:將0.25 g EDTA、10000 U肝素鈉溶于I L PH=7_8的PBS緩沖液中；
灌注液2的配制方法為:將10 mL Triton-X 100和ImL氨水溶于I L PH=7_8的去離子水中； 灌注液3的配制方法為:將0.0l g DNase I溶于I L PH=7_8的去離子水中。
[0009]一種胰腺脫細(xì)胞支架的制備方法，其特征是:包括下列步驟:
(O將小鼠離體胰腺用蠕動泵經(jīng)門靜脈緩慢灌注10ml灌注液1，控制速度為5 ml/min ;灌注液I沖洗胰腺內(nèi)的血液，使胰腺由淡紅色變?yōu)榈S色；
(2)將離體胰腺置于_80°C冰箱中，一天后將其取出于常溫下融化；
(3)利用蠕動泵經(jīng)門靜脈緩慢灌注IL灌注液2，速度控制在2ml/min;灌注I L灌注液2后,小鼠胰腺由淡黃色變?yōu)橥该鳡睿?br> (4)利用蠕動泵經(jīng)門靜脈灌注200ml DNase I溶液，后繼續(xù)灌注2 L去離子水，以去除離體胰腺中殘余的灌注液，獲得全胰腺脫細(xì)胞支架，灌注速度控制在5 ml/min。
[0010]一種胰腺脫細(xì)胞支架的再種植方法，其特征是:包括下列步驟:
(1)將胰腺生物支架采用Y射線輻照滅菌；
(2)滅菌過后的全胰腺脫細(xì)胞支架在三維循環(huán)培養(yǎng)系統(tǒng)中循環(huán)灌注500ml含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，流速控制在5 ml/min ；
(3)將IX 107細(xì)胞消化后重懸至3 ml含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中；經(jīng)門靜脈中的留置針注入I ml細(xì)胞懸液，間隔20 min再次注入I ml，間隔20 min第三次注入Iml細(xì)胞懸液；細(xì)胞注射完成后將胰腺支架靜置在培養(yǎng)基中2 h，以利于細(xì)胞的貼壁；
(4)經(jīng)門靜脈中的留置針循環(huán)灌注培養(yǎng)基，流速控制在4ml/min，培養(yǎng)基隔天更換一次，共培養(yǎng)5天。
[0011]本發(fā)明劑盒費(fèi)用低、細(xì)胞脫除徹底、易于去除洗滌劑、細(xì)胞外基質(zhì)及血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)保存完好，有利于外源及內(nèi)源性細(xì)胞的再種植和生長，并方便移植到糖尿病實(shí)驗(yàn)動物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0013]圖1是小鼠胰腺去細(xì)胞支架的大體直觀圖；
圖2是小鼠胰腺脫細(xì)胞前后的HE染色圖和掃描電鏡圖；
其中A和C是胰腺脫細(xì)胞之前的HE染色和掃描電鏡圖；B和D是胰腺經(jīng)由本專利的方法處理脫細(xì)胞后制備的胰腺生物支架的HE染色和掃描電鏡圖。
[0014]圖3是小鼠胰腺脫細(xì)胞支架再種植MIN-6細(xì)胞后的HE染色圖和免疫組化圖。
[0015]其中(A) HE染色圖；(B)免疫組化圖。

【具體實(shí)施方式】
[0016]本實(shí)施例制備小鼠全胰腺生物支架的試劑盒包括灌注液1、灌注液2和灌注液3。
[0017]其中，灌注液I為0.25 g/L EDTA、10000U/L肝素鈉的PBS緩沖液；灌注液2為1%Triton-X 100和0.1%氨水的混合液，灌注液3為0.01 g DNase I。
[0018]其中，灌注液I中磷酸緩沖液的PH=7.35 ;灌注液2、3中溶劑去離子水的PH=7.35。
[0019]在本實(shí)施中，灌注液1、灌注液2和灌注液3的配制方法如下:
灌注液I的配置:取125 mg EDTA及0.4 ml肝素鈉溶于PH為7.35的1*PBS液中，定容至500 ml，其中0.4 ml肝素鈉含10000 U的肝素鈉。
[0020]灌注液2的配置:取10 ml Triton X-100和I ml氨水溶于PH=7.35的去離子水中，定容至1000 ml。
[0021]灌注液3的配置:準(zhǔn)確稱量10 mg DNase I溶于PH=7.35的去離子水中，定容至1000 ml ο
[0022]所述試劑盒在制備小鼠全胰腺生物支架中的應(yīng)用。
[0023]利用本實(shí)施例的試劑盒制備小鼠全胰腺生物支架的方法如下:
A.小鼠離體胰腺的獲得
在小鼠腹腔注射水合氯醛以麻醉小鼠，再將I ml肝素注射至小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)全身肝素化。經(jīng)門靜脈逆行插管(藍(lán)色留置針22 G)，I號絲線雙重固定。將腸系膜上靜脈的遠(yuǎn)端及脾動靜脈的大分支依次小心結(jié)扎以防止?jié)B漏，最后將胰腺和周圍的組織結(jié)構(gòu)小心分離，如胃、小腸、脾臟和腸系膜組織。整個操作過程中保持動作輕柔以保證獲得胰腺的完整性。
[0024]B.利用蠕動泵經(jīng)門靜脈緩慢灌注100 ml灌注液1，控制速度為5 ml/min。
[0025]灌注液I沖洗胰腺內(nèi)的血液，使胰腺由淡紅色變?yōu)榈S色。
[0026]灌注液I的作用包括:通過EDTA螯合Ca2+，以松解細(xì)胞與細(xì)胞支架的連接，使后續(xù)的脫細(xì)胞過程較為容易。通過肝素鈉的沖洗能防止胰腺內(nèi)的微血管形成血栓，使得灌注液能充分與細(xì)胞接觸。
[0027]C.將離體胰腺置于_80°C冰箱中，一天后將其取出于常溫下融化。
[0028]D.利用蠕動泵經(jīng)門靜脈緩慢灌注IL灌注液2，速度控制在2 ml/min。
[0029]灌注I L灌注液2后，小鼠胰腺由淡黃色變?yōu)橥该鳡睢?br> [0030]E.利用蠕動泵經(jīng)門靜脈灌注200 ml DNase I溶液，后繼續(xù)灌注2 L去離子水，以去除離體胰腺中殘余的灌注液，獲得全胰腺脫細(xì)胞支架，灌注速度控制在5 ml/min。
[0031]上述步驟A、B、C、D及E依次進(jìn)行，一個灌注步驟完成，再進(jìn)行下一個灌注步驟。
[0032]胰腺生物支架采用Y射線輻照滅菌。
[0033]滅菌過后的全胰腺脫細(xì)胞支架在三維循環(huán)培養(yǎng)系統(tǒng)中循環(huán)灌注500 ml含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，流速控制在5 ml/min。
[0034]將I X 107細(xì)胞消化后重懸至3 ml含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中。經(jīng)門靜脈中的留置針注入I ml細(xì)胞懸液，間隔20 min再次注入I ml，間隔20 min第三次注入Iml細(xì)胞懸液。細(xì)胞注射完成后將胰腺支架靜置在培養(yǎng)基中2 h，以利于細(xì)胞的貼壁。
[0035]經(jīng)門靜脈中的留置針循環(huán)灌注培養(yǎng)基，流速控制在4 ml/min，培養(yǎng)基隔天更換一次，共培養(yǎng)5天。
[0036]下面通過具體的方法驗(yàn)證本實(shí)施例制備的全胰腺生物支架符合胰腺組織工程的需要。
[0037]請參閱圖2，其中A和C是胰腺脫細(xì)胞之前的HE染色和掃描電鏡圖；B和D是胰腺經(jīng)由本專利的方法處理脫細(xì)胞后制備的胰腺生物支架的HE染色和掃描電鏡圖。
[0038]請參閱圖3，為通過本專利方法制備的全胰腺生物支架種植小鼠MIN-6細(xì)胞后，循環(huán)灌注培養(yǎng)五天后的HE染色和免疫組化染色圖。
[0039]需要指出的是，本實(shí)施例的試劑盒及利用其制備全胰腺生物支架的方法，同樣適用于制備大鼠、豚鼠、豬等其他動物的全胰腺生物支架。
[0040]以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的【技術(shù)領(lǐng)域】，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于胰腺脫細(xì)胞支架的試劑盒，其特征是:包括灌注液1、灌注液2和灌注液3 ;其中灌注液I包括0.25 g/L EDTAUOOOO U/L肝素鈉及PBS緩沖液；灌注液2包括1%Triton-X 100 和 0.1% 氨水；灌注液 3 包括 0.01 g/L DNase I ； 其中，灌注液I中PBS緩沖液的PH=7-8 ;灌注液2的溶劑為PH=7_8的雙蒸水；灌注液3的溶劑為PH=7-8的雙蒸水。 灌注液I的配制方法為:將0.25 g EDTA、10000 U肝素鈉溶于I L PH=7_8的PBS緩沖液中； 灌注液2的配制方法為:將10 mL Triton-X 100和ImL氨水溶于I L PH=7_8的去離子水中； 灌注液3的配制方法為:將0.01 g DNase I溶于I L PH=7_8的去離子水中。
2.一種胰腺脫細(xì)胞支架的制備方法，其特征是:包括下列步驟: (O將小鼠離體胰腺用蠕動泵經(jīng)門靜脈緩慢灌注10ml灌注液1，控制速度為5 ml/min ;灌注液I沖洗胰腺內(nèi)的血液，使胰腺由淡紅色變?yōu)榈S色； (2)將離體胰腺置于_80°C冰箱中，一天后將其取出于常溫下融化； (3)利用蠕動泵經(jīng)門靜脈緩慢灌注IL灌注液2，速度控制在2ml/min;灌注I L灌注液2后,小鼠胰腺由淡黃色變?yōu)橥该鳡睿? (4)利用蠕動泵經(jīng)門靜脈灌注200ml DNase I溶液，后繼續(xù)灌注2 L去離子水，以去除離體胰腺中殘余的灌注液，獲得全胰腺脫細(xì)胞支架，灌注速度控制在5 ml/min。
3.一種胰腺脫細(xì)胞支架的再種植方法，其特征是:包括下列步驟: (1)將胰腺生物支架采用Y射線輻照滅菌； (2)滅菌過后的全胰腺脫細(xì)胞支架在三維循環(huán)培養(yǎng)系統(tǒng)中循環(huán)灌注500ml含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，流速控制在5 ml/min ； (3)將IX107細(xì)胞消化后重懸至3 ml含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中；經(jīng)門靜脈中的留置針注入I ml細(xì)胞懸液，間隔20 min再次注入I ml，間隔20 min第三次注入Iml細(xì)胞懸液；細(xì)胞注射完成后將胰腺支架靜置在培養(yǎng)基中2 h，以利于細(xì)胞的貼壁； (4)經(jīng)門靜脈中的留置針循環(huán)灌注培養(yǎng)基，流速控制在4ml/min，培養(yǎng)基隔天更換一次，共培養(yǎng)5天。
【文檔編號】A61L27/36GK104353115SQ201410590216
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月29日
【發(fā)明者】王志偉, 陸玉華, 郭益冰, 黃龑, 李曉紅, 凌長春, 朱慧, 陸晶晶, 王雷, 鄔迪, 范向軍, 朱銘言 申請人:南通大學(xué)附屬醫(yī)院