靶向人蛋白二硫鍵異構(gòu)酶基因的小干擾rna及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了靶向人蛋白二硫鍵異構(gòu)酶基因的小干擾RNA，其核苷酸序列選自：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3，根據(jù)人蛋白二硫鍵異構(gòu)酶的蛋白編碼基因序列為目的基因，選取3個21nt的靶序列，設(shè)計并合成包含各靶序列的互補DNA序列以及無義干擾DNA鏈，退火后插入pLVX-shRNA1表達載體，構(gòu)建3個針對PDI的干擾質(zhì)粒；實驗表明，本發(fā)明所構(gòu)建的RNA干擾表達載體對二硫鍵異構(gòu)酶蛋白表達具有極強的抑制作用，并能夠?qū)CV的復(fù)制產(chǎn)生一定影響；本發(fā)明在研究和/或鑒定基因功能、制備以宿主基因為靶點的抗HCV等病毒感染的基因藥物方面具有較大的應(yīng)用價值與前景。
【專利說明】靶向人蛋白二硫鍵異構(gòu)酶基因的小干擾RNA及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及人蛋白二硫鍵異構(gòu)酶基因序列上用于RNA干擾的干擾靶點，以及針對這些靶點的以各種方式獲得的小干擾RNA分子以及其在制備抗HCV感染的藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]丙型肝炎是發(fā)病率高、治療難度大的一類主要經(jīng)血液傳播的疾病，是嚴(yán)重的社會和公共衛(wèi)生問題。全球大約有1.5億人慢性感染丙肝病毒(hepatitis C virus, HCV),并且每年有超過35萬人死于丙肝相關(guān)疾病。在我國，HCV慢性感染率為3.2%，是具有較高感染率的國家之一(WHO 2012)。丙型肝炎比較隱蔽，一般的檢測方法很難檢測出來。而且，與甲肝和乙肝不同的是，丙肝至今沒有有效的疫苗，而有限的臨床治療方法僅在少數(shù)病人中獲得成功。由于HCV作為RNA病毒發(fā)生變異的頻率遠遠高于DNA病毒的變異速度，因此從病毒本身角度出發(fā)的疫苗研制變得異常困難，這就迫切要求我們進一步了解病毒與宿主細胞間的相互作用，闡明作用機制，從宿主的角度出發(fā)尋找關(guān)鍵性的宿主因子和新型干預(yù)途徑，發(fā)現(xiàn)和驗證潛在的分子標(biāo)記物和藥物靶點。
[0003]二硫鍵異構(gòu)酶是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種豐富成分，在各種分泌蛋白和細胞表面蛋白生物合成中催化二硫鍵的形成。已經(jīng)證實細胞表面PDI的功能對于某些病毒和細菌的侵入是需要的，其中病毒包括HIV、新城疫病毒和辛德畢斯病毒等。蛋白二硫鍵異構(gòu)酶介導(dǎo)的HIV糖蛋白gpl20 二硫鍵的還原對于病毒與細胞的融合是需要的。高度二硫鍵化的HIV gpl20分子與淋巴細胞表面的CD4和CXCR4受體結(jié)合，結(jié)合后其構(gòu)象變化引起HIV與細胞的融合。淋巴細胞表面相關(guān)ΗΠ的抑制能夠阻止HIV與細胞的融合，說明包膜蛋白Env的氧化還原變化是必要的。在穩(wěn)定表達針對PDI的小干擾RNA的Hela細胞中，小鼠多瘤病毒的感染力出現(xiàn)與PDI表達水平同等程度的下降。但PDI并不影響病毒的吸附和吞入，而可能是在二硫鍵的還原和重排中發(fā)揮作用，以穩(wěn)定病毒殼粒。猴病毒40侵入細胞包括了陷窩/脂筏介導(dǎo)的胞吞作用，囊泡運輸至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，遷移至胞質(zhì)，并引入核中。Mar1 Schelhaas等研究發(fā)現(xiàn)，SV40在侵入過程中利用硫基/ 二硫化物氧化還原酶——ERp57和TOI，以及Derlin-1和SellL。最近有研究證實細胞表達PDI通過引起整聯(lián)蛋白的活化而參與登革熱病毒的侵入，并且登革熱病毒的感染在晚期進一步增加roi的表面表達。巰基/二硫鍵交換參與輪狀病毒的入侵過程，并且細胞表面PDI至少可以成為抑制輪狀病毒感染的潛在靶標(biāo)。研究通過PDI干擾實驗證實，二硫鍵和細胞PDI可能在人乳頭瘤病毒16型的感染中發(fā)揮著一定的潛在作用。不難看出，由于其在新生蛋白和錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的折疊和再折疊中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，宿主蛋白PDI在病原感染中的功能逐漸成為一個研究熱點。目前通過基于活性的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，已知二硫鍵異構(gòu)酶在HCV的感染過程中出現(xiàn)酶活性的顯著上調(diào)，盡管其蛋白表達并未出現(xiàn)變化。因此，二硫鍵異構(gòu)酶可以作為最有希望的藥物靶點之一特異抑制HCV的感染和復(fù)制。本發(fā)明設(shè)計和構(gòu)建PDI干擾載體用于高效干擾二硫鍵異構(gòu)酶基因表達，進而抑制HCV的復(fù)制，以達到治療和減輕丙型肝炎相關(guān)疾病癥狀的目的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供人蛋白二硫鍵異構(gòu)酶的mRNA干擾靶點，針對該靶點設(shè)計人工序列，并將該序列在干擾載體中進行表達獲得小干擾RNA分子。因此本發(fā)明的目的也在于提供針對人蛋白二硫鍵異構(gòu)酶基因的小干擾RNA分子，包含該小干擾RNA分子的表達載體以及由其轉(zhuǎn)化的慢病毒表達載體，此外，由表達載體產(chǎn)生的、作為小干擾RNA分子前體的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA分子也包含在本發(fā)明之中。
[0005]本發(fā)明另一個目的在于提供人蛋白二硫鍵異構(gòu)酶的RNA干擾靶點在制備抗HCV感染中的應(yīng)用。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過實驗驗證得到靶向人蛋白二硫鍵異構(gòu)酶基因的小干擾RNA片段，其選自下述核苷酸序列:
SEQ ID NO:1: GGAATATACAGCTGGCAGAGA ；
SEQ ID NO:2: CAGTGACGTGTTCTCCAAATA ；
SEQ ID NO:3: GCTGTTCTTGCCCAAGAGTGT。
[0007]根據(jù)上述靶片段序列設(shè)計ShRNA的轉(zhuǎn)錄模板的正義鏈和反義鏈，最終得到干擾人PDI基因的shRNA的正義鏈和反義鏈。對應(yīng)于靶序列SEQ ID NO:1的正義鏈如SEQ ID NO:4所述，反義鏈如SEQ ID NO: 5所示；對應(yīng)于靶序列SEQ ID N0:2的正義鏈如SEQ ID N0:6所示，反義鏈如SEQ ID NO:7所示；對應(yīng)于靶序列SEQ ID N0:3的正義鏈如SEQ ID N0:8所示，反義鏈如SEQ ID N0:9所示。
[0008]干擾人蛋白二硫鍵異構(gòu)酶基因的shRNA的轉(zhuǎn)錄模板為SEQ ID N0:4和SEQ IDNO: 5,SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO: 7、或 SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9 退火形成的雙鏈 DNA。
[0009]上述shRNA的制備方法如下:
(I)將上述的RNA干擾靶序列及其互補序列用環(huán)狀結(jié)構(gòu)序列連接形成正義鏈，在正義鏈兩端引入接頭序列；所述的環(huán)狀結(jié)構(gòu)序列為TTCAAGAGA，5’端引入的接頭序列為GATCC，3’端引入的接頭序列為TTTTTTG。
[0010](2)根據(jù)步驟(I)所述的正義鏈獲得其反義鏈，同時在其兩端加入相應(yīng)的接頭序列；
(3)將步驟(I)與(2)制備的序列在TE溶液中退火，從而形成短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA。
[0011]進一步，本發(fā)明提供抑制人蛋白二硫鍵異構(gòu)酶基因表達的RNA干擾載體，命名為pLVX-shRNAl-PDI，包括骨架載體和上述干擾人二硫鍵異構(gòu)酶基因的shRNA的轉(zhuǎn)錄模板。
[0012]所述的人蛋白二硫鍵異構(gòu)酶基因表達的RNA干擾載體的驗證方法包括如下步驟:
(1)合成DNA片段SEQID NO: 10和SEQ ID NO: 11，并作為引物從人293T細胞中抽提RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行PCR擴增，克隆人蛋白二硫鍵異構(gòu)酶基因，構(gòu)建二硫鍵異構(gòu)酶基因的真核表達載體pCMV-Flag-PDI ；
(2)將步驟(I)得到的pCMV-Flag-PDI與上述的小干擾RNA表達載體pLVX-shRNAl-PDI共同轉(zhuǎn)染至293T細胞中，培養(yǎng)48h ；
(3)收取步驟(2)共轉(zhuǎn)染的細胞以PBS溶液洗兩遍，以RIPA裂解液裂解細胞蛋白，以抗Flag標(biāo)簽抗體進行免疫印跡檢測RNA干擾組和對照組中PDI蛋白的表達情況；結(jié)果表明，上述構(gòu)建的RNA干擾載體可以在293T細胞中高效表達，使人蛋白二硫鍵異構(gòu)酶基因表達量顯著降低，達到抑制PDI基因表達的目的。
[0013]轉(zhuǎn)染上述的人蛋白二硫鍵異構(gòu)酶基因表達的RNA干擾載體進入真核細胞內(nèi)(Huh7.5.1細胞)，并在真核細胞內(nèi)表達相應(yīng)的小分子干擾RNA，干擾二硫鍵異構(gòu)酶基因的表達，24h后感染HCV病毒，再培養(yǎng)72h后，取培養(yǎng)上清，進行培養(yǎng)上中HCV滴度的TCID50測定;
結(jié)果表明:與轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒相比，轉(zhuǎn)染人蛋白二硫鍵異構(gòu)酶基因的RNA干擾質(zhì)粒，使HCV的病毒滴度出現(xiàn)降低。從而可以將上述人蛋白二硫鍵異構(gòu)酶基因表達的RNA干擾載體用于降低PDI表達，達到抑制HCV復(fù)制的目的。
[0014]本發(fā)明中所得到的三個干擾PDI基因表達的干擾質(zhì)粒具有在細胞高效干擾PDI基因表達的能力，為進一步研究PDI基因的生物學(xué)功能提供有效和可罪的研究工具，同時為將來基于PDI基因的抗HCV治療藥物的開發(fā)提供了可能。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是本發(fā)明中干擾組和對照組的Western blot檢測結(jié)果示意圖；圖中:1為PDI+pLVX-shRNAl-CTRL ;2 為 PDI+ pLVX-shRNAl-Ι ;3 為 PDI+ pLVX-shRNAl-2 ;4 為 PDI+pLVX-shRNAl-3 ；5 為 Protein marker。
[0016]圖2是本發(fā)明中HCV感染的二硫鍵異構(gòu)酶RNA干擾組和對照組Huh7.5.1細胞的培養(yǎng)上清中的病毒滴度結(jié)果；圖中:shPDI是指人蛋白二硫鍵異構(gòu)酶的RNA干擾載體，即pLVX-shRNAl-PDI ；shCTRL 為對照干擾載體。

【具體實施方式】
[0017]以下結(jié)合附圖和實施例來進一步闡述本發(fā)明的具體內(nèi)容，本實施例是在人293T細胞和Huh7.5.1細胞中進行，利用同樣的方法所構(gòu)建的特異性靶向人PDI基因的小分子RNA干擾載體，及其在人丙型肝炎的抗病毒治療中的應(yīng)用，也應(yīng)視為本申請的保護范圍，本實施例中方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法，所使用試劑如無特殊說明的，均為常規(guī)市售試劑。
[0018]實施例1:針對PDI基因的RNA干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建
1.1表達PDI基因ShRNA的寡核苷酸序列的設(shè)計與合成
登錄Genebank，檢索PDI基因P4HB的mRNA編碼序列全長，基因序列號為G1:121256637,將序列錄入在線數(shù)據(jù)庫siRNA Wizard v3.1尋找siRNA的祀位點，設(shè)計干擾發(fā)卡序列及對照序列，在序列兩端分別引入BamH I和EcoR I酶切位點，提交上海生工公司進行合成，三對 shRNA，暫命名為 pLVX-shRNAl-1、pLVX-shRNAl-2 和 pLVX-shRNAl-3。
[0019]1.2寡核苷酸序列的退火
將合成的RNA干擾寡核苷酸片段干粉在12000 rpm離心30 S，加入適量無菌超純水進行溶解，并用TE溶液進行進一步的稀釋，使寡核苷酸溶液濃度達到100 μ M，用于退火反應(yīng)溶液。將配制好的退火反應(yīng)緩沖液進行混合，短暫離心后放置PCR儀上，用以下程序進行退火:90°C 5 min,70°C 10 min,55°C 10 min,40°C 10 min,25°C 10 min。退火后的寡核苷酸可以立刻使用進行連接反應(yīng)，或者在_20°C長期保存。
[0020]反應(yīng)體系如下: 正義寡核苷酸(100 μ M) 5yL 反義寡核苷酸(100 μ Μ) 5μ L 加TE溶液補足至50 μ L
用水將退火后的寡核苷酸稀釋100倍使用。
[0021]1.3寡核苷酸與載體的連接
用BamH I和EcoR I雙酶切2 μ g pLVX-shRNAl載體質(zhì)粒，酶切方法和體系參考說明書進行。將寡核苷酸與雙酶切的PLVX-shRNAl載體按照以下體系進行16°C連接過夜。連接反應(yīng)體系如下:
T4 DNA連接酶 5U 雙酶切載體2 μ L
稀釋后寡核苷酸 2yL 10 X 連接酶 Buffer I μ L 加水補足至1yL
1.4質(zhì)粒的測序驗證
連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和挑斑均按常規(guī)方法進行，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌送上海生工進行測序驗證，完全符合設(shè)計要求，無堿基突變。shRNA編碼序列和設(shè)計序列完全一致，表明已成功構(gòu)建ΗΠ表達干擾shRNA表達載體pLVX-shRNAl-PDI。
[0022]實施例2:免疫印跡法檢測PDI表達質(zhì)粒與PDI基因的RNA干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞中PDI的表達水平驗證RNA干擾效果
2.1 PDI基因的克隆及真核表達載體構(gòu)建
從NCBI數(shù)據(jù)庫檢索人PDI基因序列，以Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計引物，引入Hind III和I酶切位點。以Trizol對人源293T細胞進行裂解，抽提細胞RNA，再以隨機引物Oligo(dT)進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。以合成的引物SEQ ID N0:10和SEQ ID N0:11進行 PCR 擴增 PDI 基因，擴增程序為:94°C 3min ；94°C 30s，62°C 50s，72°C 30s，30 個循環(huán)；72°C延伸7min。將PDI基因的PCR產(chǎn)物進行膠回收后，與pCMV_Flag質(zhì)粒分別同時以III和I雙酶切，線性化的質(zhì)粒與PDI基因的雙酶切產(chǎn)物均進行膠回收，再在16°C條件下連接過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，挑斑，放大培養(yǎng)，對菌液PCR陽性的克隆進一步送上海生工測序分析。結(jié)果表明序列無突變，無移碼，成功將PDI基因克隆至載體pCMV-Flag，構(gòu)建pCMV-Flag-PDI真核表達載體。以超純質(zhì)粒抽提試劑盒(Qiagen公司)提取不含內(nèi)毒素的超純質(zhì)粒，備用。
[0023]2.2 PDI真核表達載體及其RNA干擾載體的共轉(zhuǎn)染
轉(zhuǎn)染前一天，以不含雙抗的DMEM培養(yǎng)基將生長狀態(tài)良好的293T細胞鋪至六孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞生長至融合度約80-90%時，參考Invitrogen產(chǎn)品說明，取2 μ gpCMV-Flag-PDI與2 μ g pLVX-shRNAl-PDI,以針對TLR3基因的RNA干擾載體同步以脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 Reagent轉(zhuǎn)染,作為對照。轉(zhuǎn)染6小時后，更換新鮮含1%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行維持培養(yǎng)48h。
[0024]2.3免疫印跡檢測PDI表達情況
將轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48h的細胞以PBS洗兩遍，以RIPA細胞裂解液于冰上裂解細胞20min，再將蛋白裂解物以12000rpm離心15min，取上清以80V 40min和120V 1.5h進行SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)印NC膜。以5%脫脂奶將轉(zhuǎn)印蛋白的NC膜封閉lh，再與抗Flag標(biāo)簽抗體孵育2h，洗滌后，與HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗孵育lh，以PBST洗滌5遍后以高靈敏度化學(xué)發(fā)光底物SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate (Pierce 公司)進行化學(xué)發(fā)光顯色。結(jié)果表明，三個干擾載體均可較好的干擾PDI基因的表達，其中I和3效果最好。結(jié)果見圖1。
[0025]實施例3:PDI基因干擾對HCV復(fù)制的影響
3.1 RNA干擾法分析
以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)Huh7.5.1細胞，提前一天以不含雙抗的DMEM培養(yǎng)基將細胞接種至六孔細胞培養(yǎng)板中，使細胞密度達到106。次日將提取的不含內(nèi)毒素的超純質(zhì)粒pLVX-shRNAl-PDI,以脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000 Reagent 轉(zhuǎn)染 Huh7.5.1 細胞，具體步驟參考Invitrogen產(chǎn)品說明。轉(zhuǎn)染6小時后，以MOI值=1的比例接入HCV病毒，培養(yǎng)72h，收集培養(yǎng)上清，采用TCID50法測定上清中病毒滴度。
[0026]3.2 病毒 TCID50 測定
病毒滴度采用96孔細胞培養(yǎng)板進行測定。將感染細胞培養(yǎng)上清以8000 rpm,5 min進行離心，以除去雜質(zhì)和細胞碎片，以細胞維持液(含2%血清的DMEM培養(yǎng)基)進行10倍梯度稀釋，接種于長至80-90%匯合度的Huh7.5.1單層細胞中，每個稀釋倍數(shù)設(shè)6個重復(fù)孔，感染72 h后，棄去上清，以固定液(甲醇/丙酮=1:1)于-20° C固定20 min。HCV感染的Huh7.5.1細胞再以本實驗室研制的HCV核心蛋白多克隆抗體(1:1000)進行標(biāo)記，以FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗(1:200)進行間接免疫熒光測定，記錄各孔的陰性和陽性情況，按照Reed-Muench法進行計算，得到培養(yǎng)上清中HCV感染性病毒粒子的TCID50數(shù)量。結(jié)果表明，PDI基因的RNA干擾，使得HCV的復(fù)制受到一定程度的下降。結(jié)果見圖2。
[0027]上述結(jié)果說明，本發(fā)明中涉及到的三個針對PDI基因的干擾質(zhì)料載體均能夠有效抑制PDI基因的表達，這為進一步研究_■硫鍵異構(gòu)酶基因的生物學(xué)功能提供了有力的研究手段，同時也為將來針對PDI基因的相關(guān)基因治療藥物的開發(fā)，特別是抗HCV感染提供了可倉泛。
【權(quán)利要求】
1.靶向人蛋白二硫鍵異構(gòu)酶基因的小干擾RNA，其選自下述核苷酸序列:
SEQ ID NO:1: GGAATATACAGCTGGCAGAGA ；
SEQ ID NO:2: CAGTGACGTGTTCTCCAAATA ；
SEQ ID NO:3: GCTGTTCTTGCCCAAGAGTGT。
2.針對人蛋白二硫鍵異構(gòu)酶基因的shRNA，其為:SEQID N0:4和SEQ ID NO: 5,SEQ IDNO:6 和 SEQ ID NO:7、或 SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9 退火形成的雙鏈。
3.含有權(quán)利要求2所述shRNA的小干擾RNA表達載體。
4.權(quán)利要求1所述的小干擾RNA、權(quán)利要求2所述的shRNA或權(quán)利要求3所述的小干擾RNA表達載體在制備抗HCV感染的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K31/7088GK104388430SQ201410595604
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月30日
【發(fā)明者】張金陽, 葉承金, 宋玉竹, 韓芹芹, 夏雪山 申請人:昆明理工大學(xué)