一種豬苓菌核多糖的提取制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬苓菌核多糖的制備方法：豬苓菌核乙醇浸泡、蒸餾水提取后，提取液濃縮，然后加入95％-100％的乙醇醇沉，取乙醇終體積濃度為60％的醇沉組分，先用陰離子交換柱分離提純，梯度洗脫后再用凝膠過濾色譜柱分離，制得豬苓菌核多糖。本發(fā)明方法制得的豬苓菌核多糖為均一多糖，具有抗氧化活性，可以清除DPPH自由基，可用于制備抗氧化劑。
【專利說明】-種豬苓菌核多糖的提取制備方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種豬苓菌核多糖的制備方法及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】：
[0002] 豬茶（Polyporus umbellatus)隸屬于無隔擔(dān)子菌亞綱、無裙菌目、多孔菌科、多孔 菌屬，主要是由菌核和子實體兩部分構(gòu)成。豬苓菌核為一味名貴的中藥材，在我國已有2000 多年的藥用歷史，具有利水、滲濕、解熱之效，常被用于治療急性腎炎、淋病、糖尿病、全身浮 腫、小便不暢、尿急尿頻、尿道疼痛、受暑水瀉以及急性肝炎、急性胃炎等疾病?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研 究發(fā)現(xiàn)豬苓菌核水煎提取物具有治療慢性病毒性肝炎及抗腫瘤的作用。
[0003] 多糖是由10個以上的單糖通過糖苷鍵鏈接而成的高分子聚合物，是自然界含量 最豐富的物質(zhì)之一，也是與人類生活緊密相關(guān)的一類生物大分子。與蛋白質(zhì)和核酸相比，組 成多糖的糖殘基種類繁多，不僅含有不同的異頭構(gòu)型而且可以連接不同的取代基；同時每 個糖單體具有多種鏈接位點，這些都使得多糖具有非常復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，同時也具有裝載豐富 生物信息的能力。多糖已成為繼蛋白質(zhì)和核酸研究之后探索生命奧秘的第三里程碑，已吸 引了越來越多學(xué)者的興趣。目前許多研究已證明多糖具有多種生物活性和功能，特別是對 機體免疫功能的作用，這些都使得多糖已成為天然藥物及保健品研發(fā)中的重要組成部分。 而且全球已有多個多糖已經(jīng)或正在分別進行正規(guī)的抗腫瘤、抗艾滋病及糖尿病治療等臨床 試驗。除了生物活性的研究之外，多糖的結(jié)構(gòu)也是許多相關(guān)研究者的主要研究焦點之一，因 為多糖結(jié)構(gòu)決定著其生物活性和功能，結(jié)構(gòu)的闡述是理解其活性以及被更好地開發(fā)利用的 基礎(chǔ)。而獲得均一的多糖組分是糖類結(jié)構(gòu)研究的前提，也是難點和關(guān)鍵點之一。
[0004] 豬苓多糖具有免疫刺激作用，可提高人體免疫力，能顯著降低肝臟中的氧化消除 自由基損傷，對于延緩組織細(xì)胞老化、保護機體、抗老防衰十分有益，是中藥豬苓菌核的重 要活性成分之一。我國已有豬苓多糖注射液、豬苓多糖膠囊等產(chǎn)品問世，并在臨床及日常保 健中廣為應(yīng)用。目前有關(guān)豬苓多糖的研究多集中于粗多糖的活性，均一多糖的研究則鮮有 報道。一些有關(guān)豬苓多糖的專利也已被公開，如專利CN 102048769 A公開了一種豬苓總多 糖的提取工藝，該發(fā)明采用索氏提取法，乙醇沉淀獲得豬苓多糖，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)約20% ;專 利CN 101602812 A公開了一種豬苓多糖的制備方法，該方法采用水煎煮，乙醇醇沉，大孔樹 脂吸附，獲得多糖含量較高的產(chǎn)品；專利CN 101525389 A公開了一種豬苓多糖精制中的脫 色方法，該方法采用熱水提取，乙醇醇沉獲得粗多糖，利用活性炭對粗多糖進行脫色處理， 并確定脫色的最佳工藝條件。目前已公開的豬苓多糖的相關(guān)專利均為粗多糖、多糖含量低， 或為非均一多糖，并沒有涉及單一豬苓均一多糖組分及其結(jié)構(gòu)和活性。


【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明提供了一種豬苓菌核多糖，該多糖具有清除DPPH自由基的活性，可用于制 備抗氧化劑。
[0006] 本發(fā)明提供了一種豬苓菌核多糖的制備方法，所述方法包括以下步驟：
[0007] (1)干燥的豬苓菌核，經(jīng)粉碎得到豬苓菌核粉末，豬苓菌核粉末用體積分?jǐn)?shù) 95% -100%的乙醇充分浸泡，過濾，得濾渣；
[0008] (2)步驟⑴所得的濾渣加蒸餾水，90_100°C提取2_4h，重復(fù)提取3?4次，過濾， 合并所有的上清液，所得上清液A減壓濃縮至原體積的1/10,得到濃縮液A ;
[0009] (3)向步驟⑵得到的濃縮液A中緩慢加入體積分?jǐn)?shù)95% -100%的乙醇，至乙醇 終體積濃度為30 %，4°C溫度下靜置8?12h，離心分離，得到沉淀I和上清液I，上清液I 中緩慢加入體積分?jǐn)?shù)95% -100%的乙醇，至乙醇終體積濃度為60%，4°C溫度下靜置8? 12h，離心分離，收集沉淀II，真空冷凍干燥，得到醇沉組分；
[0010] (4)將步驟（3)得到的醇沉組分加蒸餾水溶解，離心，得上清液B，上樣于陰離子交 換柱，依次用水、〇. lmol/L氯化鈉水溶液、0. 2mol/L氯化鈉水溶液、0. 4mol/L氯化鈉水溶液 進行梯度洗脫，苯酚硫酸法監(jiān)測洗脫液中多糖含量，收集〇. 2mol/L氯化鈉水溶液洗脫下來 的洗脫液，濃縮至所得濃縮液B中氯化鈉濃度達到飽和，將濃縮液B上樣于凝膠過濾色譜 柱，用蒸餾水洗脫，苯酚硫酸法檢測，收集含有多糖的洗脫液，濃縮、真空冷凍干燥后制得豬 苓菌核多糖。
[0011] 所述步驟（1)中，體積分?jǐn)?shù)95%-100%的乙醇的體積用量以豬苓菌核粉末的質(zhì)量 計為 8-10L/kg。
[0012] 所述步驟（1)中，所述浸泡優(yōu)選浸泡3?4次，每次浸泡12?16h。
[0013] 所述步驟（2)中，蒸餾水的質(zhì)量用量為豬苓菌核粉末的質(zhì)量的10-20倍。
[0014] 所述步驟（4)中，醇沉組分加蒸餾水溶解，所述蒸餾水的體積用量以醇沉組分的 質(zhì)量一般計為〇. 1?〇. 2mL/mg。
[0015] 所述步驟（4)中，所述的離子交換柱的填料為DEAE-Sepharose Fast Flow(二乙 氨乙基-瓊脂糖快速流）陰離子交換樹脂，層析柱規(guī)格為26cm內(nèi)徑X 100cm高度，上樣量 5-15mL,流速 3mL/min ；
[0016] 所述步驟（4)中，所述梯度洗脫的程序優(yōu)選為：依次用水洗脫1?2個柱體積， 0. lmol/L氯化鈉溶液洗脫1. 5?3個柱體積，0. 2mol/L氯化鈉溶液洗脫1. 5?3個柱體積， 0. 4mol/L氯化鈉溶液洗脫1?3個柱體積，洗脫結(jié)束后，離子交換柱用lmol/L的氯化鈉水 溶液再生,再用水平衡4-5個柱體積。
[0017] 進一步，所述步驟（4)中，所述梯度洗脫的程序更優(yōu)選為：依次用水洗脫1個柱體 積，0. lmol/L氯化鈉溶液洗脫2個柱體積，0. 2mol/L氯化鈉溶液洗脫2個柱體積，0. 4mol/ L氯化鈉溶液洗脫1個柱體積，洗脫結(jié)束后，離子交換柱用lmol/L的氯化鈉水溶液再生，再 用水平衡4-5個柱體積；
[0018] 所述步驟（4)中，所述的凝膠過濾色譜柱的填料為Sephacryl S-500 HR(丙烯葡 聚糖凝膠），層析柱規(guī)格為16cm內(nèi)徑X IOOcrn高度，上樣量2?8mL，流速lmL/min，一般用 水洗脫至少1個柱體積。
[0019] 本發(fā)明還提供按照本發(fā)明所述方法制得的豬苓菌核多糖，所述的豬苓菌核多糖 為均一多糖，以葡萄糖和葡萄糖醛酸作為主要的結(jié)構(gòu)單元，其中以葡萄糖構(gòu)成的中性部分 的重量百分含量為60. 7%，以葡萄糖醛酸構(gòu)成的酸性部分的重量百分比為24. 2%，總糖 的重量百分含量為84. 9%，不含蛋白和核酸；該豬苓菌核多糖為均一多糖，平均分子量為 290KDa，其結(jié)構(gòu)是以1 - 6連接的β -D-葡萄糖為主鏈，以1 - 3連接的β -D-葡萄糖、1 - 4 連接的β -D-葡萄糖、I - 3連接的β -D-葡萄糖醛酸、I - 4連接的β -D-葡萄糖醛酸、末 端β -D-葡萄糖構(gòu)成的支鏈取代于主鏈的0-3位置，其中主鏈上被取代的殘基與未被取代 的殘基比為1: 1。
[0020] 本發(fā)明提供的豬苓菌核多糖可用于制備抗氧化劑。
[0021] 本發(fā)明制備方法操作簡單、易于控制，所用試劑為水和乙醇，安全無毒，成本低。本 發(fā)明方法制得的豬苓菌核多糖具有抗氧化活性，可以清除DPPH自由基，抗氧化活性隨著濃 度的增大而增大。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0022] 圖1實施例2制得的PUP60S2組分的HPGPC圖。
[0023] 圖2實施例2制得的PUP60S2組分的紅外光譜圖。
[0024] 圖3實施例2制得的PUP60S2組分的DPPH清除率曲線圖。

【具體實施方式】：
[0025] 下面以具體實施例來對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步說明，但本發(fā)明的保護范圍不 限于此。
[0026] 實施例1豬苓菌核多糖PUP60的提取
[0027] 稱取干燥的豬苓菌核，經(jīng)粉碎得到豬苓菌核粉末（過20目篩），取I. Okg豬苓菌核 粉末，加8. OL的體積分?jǐn)?shù)96ν%的乙醇浸泡12h，重復(fù)浸泡3次，浸泡后過濾，棄上清液得濾 渣；所得的濾渣加20L的蒸餾水，KKTC提取3h，提取三次，過濾，合并所有的上清液，上清液 減壓濃縮至為原體積的1/10,得到濃縮液；濃縮液中緩慢加入96v%的乙醇至乙醇終體積 濃度為30%，4°C靜置過夜后，離心分離，分別收集沉淀I和上清液I。上清液I中繼續(xù)緩慢 加入96v%的乙醇至乙醇終體積濃度為60%，4°C靜置過夜后，離心分離，收集沉淀II，沉淀 II經(jīng)真空冷凍干燥后即得豬苓菌核粗多糖的60%醇沉組分，記為PUP60,產(chǎn)量5. lg。
[0028] 實施例2豬苓菌核多糖PUP60S2的純化制備
[0029] 取50mg PUP60溶解于IOmL蒸饋水中配成5mg/mL的溶液，離心，取上清液上樣于 DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱（購自GE醫(yī)療）進行柱層析。以3mL/min的流速 依次用水洗脫1個柱體積，〇. lmol/L氯化鈉水溶液洗脫2個柱體積、0. 2mol/L氯化鈉水溶 液洗脫2個柱體積、0. 4mol/L氯化鈉水溶液洗脫1個柱體積，苯酚硫酸法檢測，分別收集各 洗脫條件下的洗脫組分。
[0030] 上述梯度洗脫完成后，依次用lmol/L的氯化鈉水溶液再生柱子和蒸餾水平衡柱 子。然后按照上述步驟，分批取PUP6050mgX9,重復(fù)上述柱層析步驟做9次，合并總共10 次0. 2mol/mL氯化鈉水溶液洗脫的組分，減壓濃縮至濃縮液中氯化鈉濃度達到飽和，取濃 縮液分批上樣于S印hacryl S-500 HR凝膠柱（購自GE醫(yī)療），每次上樣量5mL，用蒸餾水 以lmL/min的流速洗脫，苯酚硫酸檢測，收集含有多糖的洗脫液。將分批次凝膠柱層析得到 的含有多糖的洗脫液合并，減壓濃縮，真空冷凍干燥后即得豬苓菌核多糖，記為PUP60S2組 分，產(chǎn)量150mg。
[0031] 實施例3 PUP60S2的理化性質(zhì)分析
[0032] 取實施例2所獲得的PUP60S2組分25mg，加蒸餾水配成lmg/mL溶液，取0. 2mL加 入試管中，再向加入試管中加入I. 2mL的0. 0125mol/mL四硼酸鈉硫酸溶液，碎冰中冷卻，漩 渦振蕩器上混合均勻后，于l〇〇°C沸水浴中反應(yīng)5min，冰水中冷卻后加入20 μ L 0. 15 %的 間羥基聯(lián)苯的NaOH溶液，混勻后，測定其在520nm處的吸光值。以D-GlcA為對照標(biāo)準(zhǔn)品， 測得PUP60S2組分中糖醛酸含量為24. 2%。取上述lmg/mL PUP60S2溶液10mL，加蒸餾水 稀釋成0. lmg/mL的溶液，取ImL加入具塞試管中，再一次加入ImL蒸饋水、ImL 6 %苯酚、 5mL濃硫酸，振蕩混合均勻，沸水浴反應(yīng)15min，于490nm處測定吸光度。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)對 照品，測得PUP60S2組分中總糖含量為84. 9%。紫外全掃描結(jié)果表明PUP60S2中不含蛋白 和核酸。
[0033] PUP60S2組分的純度和分子量測定利用高效凝膠過濾色譜（HPGPC)測定。測定 條件如下：樣品濃度為lmg/mL，上樣量為IOyL,色譜柱為TSK-gel PWaG4000,流動相為 0. lmol/L的硝酸鈉溶液，流速lmL/min，檢測器為Waters 2414示差儀。所得結(jié)果見圖1，為 單一對稱峰，說明PUP60S2組分為均一多糖。PUP60S2組分經(jīng)與Dextran系列標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖制 得的標(biāo)準(zhǔn)曲線對照得出分子量為290KDa。
[0034] Img PUP60S2組分經(jīng)溴化鉀壓片后，采用Nicolet 6700紅外光譜儀掃描，所得 紅外光譜圖（圖2)中3400. OcnT1左右出現(xiàn)的強而寬的吸收峰為締合的羥基伸縮振動峰， 2920. OcnT1附近的峰為C-H伸縮振動峰，1200-lOOOcnT1左右的峰為C-O-H和C-O-C的吸收 峰，以上這些都是多糖的特征吸收峰；1615. 8CHT1和1414. 4CHT1為羧酸鹽的特征吸收峰，說 明PUP60S2組分中含糖醛酸；895. 2CHT1出現(xiàn)一個弱的吸收峰，而840. OcnT1附近無吸收峰， 說明PUP60S2中只含β構(gòu)型的糖殘基。PUP60S2組分為由β構(gòu)型的糖殘基組成的酸性多 糖。
[0035] 實施例4 PUP60S2的結(jié)構(gòu)分析
[0036] 參照文獻（Fau，Τ. R.，Conrad, Η. Ε.，Stoichiometric depolymerization of polyuronides and glycosaminoglycuronans to monosaccharides following reduction of their carbodiimide-activated carboxyl groups. Biochemistry. 1972, 11:1383-1388.)將 PUP60S2 組分的羧基還原，具體方法為：20. Omg PUP60S2組分溶于10. OmL蒸餾水中，加190. Omg EDC，利用自動電位滴定儀以0. Imol/mL HCL溶液維持pH 4. 5反應(yīng)2h，然后于Ih內(nèi)緩慢加入20mL 2mol/L NaBH4溶液，并同時以 4mol/mL HCL溶液維持pH 7.0。還原后的產(chǎn)物經(jīng)蒸餾水透析后，濃縮，真空冷凍干燥，即得 PUP60S2組分還原后的組分PUP60S2R。PUP60S2R經(jīng)間羥基聯(lián)苯法檢測不含糖醛酸。
[0037] 參照文獻(Zhang, A. Q. , et al. Purification and structural investigation of a water-soluble polysaccharide from Flammulina velutipes. Carbohydrate Polymers, 2012, 87 (3) : 2279-2283.)，還原前后的 PUP60S2 和 PUP60S2R 分別經(jīng)水解，還原， 乙?；螅肎C色譜分析，具體方法為：取2mg PUP60S2和PUP60S2R，分別加4mL 2mol/ L TFA于IKTC水解2h，加3mL甲醇減壓濃縮蒸干，重復(fù)5次；上述蒸干后的產(chǎn)品加入30mg NaBH4并溶于3mL蒸餾水中，于室溫下還原3h，然后用冰醋酸中和過量的NaBH 4，至溶液不 在產(chǎn)生氣泡為止，加入3mL甲醇，減壓濃縮蒸干，重復(fù)5次，置于真空干燥器中過夜。次日， IKTC烘箱中加熱15min，充分出去殘留的水分后，加入4mL醋酐，KKTC反應(yīng)lh，冷卻，然后 加入3mL甲苯，加壓濃縮蒸干，重復(fù)5次，以除去多余的醋酐。上述乙酰化的產(chǎn)物用3mL氯仿 溶解，并加少量蒸餾水清洗，重復(fù)4次。氯仿層以適量的無水硫酸鈉干燥后，用氯仿適當(dāng)稀 釋，并用GC分析。GC條件：HP-5毛細(xì)管柱，氫火焰離子檢測器，氮氣為載氣，柱溫為120°C維 持lmin，然后以10°C /min升溫至240°C，并維持6. 5min。進樣口和檢測器溫度均為250°C。 GC結(jié)果顯示PUP60S2是由葡萄糖構(gòu)成的中性部分以及糖醛酸構(gòu)成的酸性部分組成。
[0038] 參照文獻（Ciucanu, I.，Caprita, R.，· Per-〇-methylation of neutral carbohydrates directly from aqueous samples for gas chromatography and mass spectrometry analysis. Anal. Chim. Acta. 2007, 585(1) :81-85)將PUP60S2 和 PUP60S2R完 全甲基化后，具體方法為：取2mg PUP60S2和PUP60S2R，分別加 ImLDMSO和微量水，超聲溶 解，冷卻至室溫后，加入20mg NaOH粉末以及50mg片狀NaOH，振蕩，然后加0· 5mL CH3I反應(yīng) 10min，加2mL蒸餾水終止反應(yīng)，并加3mL的氯仿進行萃取，棄去上層水相，加蒸餾水洗5次， 有機相在40°C下減壓濃縮。重復(fù)上述甲基化步驟甲基化一次。IR檢測無 OH吸收峰說明甲 基化完全。甲基化后的多糖溶于3mL 88%的甲酸溶液，KKTC下解聚3h后，加甲醇濃縮蒸 干，重復(fù)3次。解聚后的多糖按上述乙?；牟襟E處理（即水解，還原，乙?；?，并按照上 述的GC條件用GC-MS分析。分析結(jié)果見表1。表1中可知PUP60S2的糖殘基主要有葡萄糖 末端，1 - 3連接的葡萄糖，1 - 4連接的葡萄糖，1 - 6連接的葡萄糖，1 - 3, 6連接的葡萄 糖，1 - 4連接的葡萄糖醛酸和1 - 3連接的葡萄糖醛酸，且其中糖醛酸鏈接于1 - 3, 6葡 萄糖殘基上。
[0039] 30mg PUP60S2組分，加 D2O反復(fù)凍干三次后，溶于0. 5ml D2O中，采用500MHz ANANCEIII核磁共振儀分析。1H NMR的化學(xué)位移以25°C時HOD δ 4. 78為內(nèi)標(biāo)，13C NMR的化學(xué) 位移以飽和3-三甲基硅烷磺酸鈉的重水溶液（D20+DSS)峰的δ 〇.〇〇為外標(biāo)。NMR波譜結(jié) 果見表2。通過結(jié)合上述單糖組成和甲基化的結(jié)果，確定了 PUP60S2的結(jié)構(gòu)為以1 - 6連接 的β -D-葡萄糖為主鏈，以1 - 3連接的β -D-葡萄糖、1 - 4連接的β -D-葡萄糖、1 - 3 連接的β -D-葡萄糖醛酸、1 - 4連接的β -D-葡萄糖醛酸、末端β -D-葡萄糖構(gòu)成的支鏈 取代于主鏈的0-3位置，其中主鏈上被取代的殘基與未被取代的殘基比為1:1。
[0040] 表I PUP60S2和PUP60S2R的甲基化結(jié)果
[0041]

【權(quán)利要求】
1. 一種豬苓菌核多糖的制備方法，其特征在于所述方法包括以下步驟： (1) 干燥的豬苓菌核，經(jīng)粉碎得到豬苓菌核粉末，豬苓菌核粉末用體積分?jǐn)?shù) 95% -100 %的乙醇充分浸泡過濾，得濾渣； (2) 步驟（1)所得的濾渣加蒸餾水，90-100°C提取2-4h，重復(fù)提取3?4次，過濾，合并 所有的上清液，所得上清液A減壓濃縮至原體積的1/10,得到濃縮液A ; (3) 向步驟（2)得到的濃縮液A中緩慢加入體積分?jǐn)?shù)95% -100%的乙醇，至乙醇終體 積濃度為30%，4°C溫度下靜置8?12h，離心分離，得到沉淀I和上清液I，上清液I中緩慢 加入體積分?jǐn)?shù)95% -100%的乙醇，至乙醇終體積濃度為60%，4°C溫度下靜置8?12h，離 心分離，收集沉淀II，真空冷凍干燥，得到醇沉組分； (4) 將步驟（3)得到的醇沉組分加蒸餾水溶解，離心，得上清液B，上樣于陰離子交換 柱，依次用水、〇. lmol/L氯化鈉水溶液、0. 2mol/L氯化鈉水溶液、0. 4mol/L氯化鈉水溶液進 行梯度洗脫，苯酚硫酸法監(jiān)測洗脫液中多糖含量，收集〇. 2mol/L氯化鈉水溶液洗脫下來的 洗脫液，濃縮至所得濃縮液B中氯化鈉濃度達到飽和，將濃縮液B上樣于凝膠過濾色譜柱， 用蒸餾水洗脫，苯酚硫酸法檢測，收集含有多糖的洗脫液，濃縮、真空冷凍干燥后制得豬苓 菌核多糖。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟（1)中，體積分?jǐn)?shù)95%-100%的乙 醇的體積用量以豬苓菌核粉末的質(zhì)量計為8-10L/kg。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟（1)中，所述浸泡為浸泡3?4次， 每次浸泡12?16h。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述蒸餾水的質(zhì)量用量為豬苓菌核粉末的質(zhì) 量的10-20倍。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟（4)中，醇沉組分加蒸餾水溶解，所 述蒸饋水的體積用量以醇沉組分的質(zhì)量計為〇. 1?〇. 2mL/mg。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟（4)中，所述的離子交換柱的填料為 DEAE-Sepharose Fast Flow 陰離子交換樹脂。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟（4)中，所述梯度洗脫的程序為：依 次用水洗脫1?2個柱體積，0. lmol/L氯化鈉溶液洗脫1. 5?3個柱體積，0. 2mol/L氯化 鈉溶液洗脫1. 5?3個柱體積，0. 4mol/L氯化鈉溶液洗脫1?3個柱體積。
8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟（4)中，所述的凝膠過濾色譜柱的填 料為 S印hacryl S-500HR。
9. 如權(quán)利要求1?8之一所述的方法制得的豬苓菌核多糖。
10. 如權(quán)利要求9所述的豬苓菌核多糖在制備抗氧劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K31/715GK104371036SQ201410604399
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月31日
【發(fā)明者】張安強, 何鵬飛, 孫培龍 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)